火箭煤油染毒对二硝基氟苯所致小鼠迟发型过敏反应的免疫抑制作用

徐冰心 刘志国 李成林 史煜华 王建营 吴继华 李建忠 岳茂兴 崔彦

火箭煤油又称航天煤油，是一种高密度、低凝点、高品质的高热安定性大型火箭发动机用煤油，适用于新型大推力运载航天煤油发动机，将作为中国新一代大推力运载火箭的主体推进剂投入到航天发射中。皮肤接触中毒是职业作业过程中一种最常见并且不可能避免的方式，并且航天煤油的蒸汽压下降时，蒸发速度减慢，也可能导致皮肤沾染吸收航天煤油。笔者对皮肤接触、眼接触和吸入火箭煤油的毒性和防护已进行了初步研究[1-5]。 皮肤接触火箭煤油的免疫毒性未见研究。二硝基氟苯皮肤试验是用于测定机体细胞免疫功能最常用的体内试验方法。本文观察了小鼠皮肤染毒航天煤油对二硝基氟苯(DNFB)所致迟发型过敏反应(DTH)的影响，以期研究皮肤接触火箭煤油的细胞免疫毒性。

材料与方法

一、实验材料

1.实验动物及分组：SPF级(6周龄)雌性ICR小鼠102只，体重18～22 g，购自北京医科大学实验动物中心。按照小鼠体质量进行随机分组，每组6只。第一系列实验为不同剂量火箭煤油1次染毒(1 d，1次/d)：分为阴性对照、阳性对照、100 μL组、200 μL组、400 μL组；第二系列实验为同一剂量火箭煤油不同次数染毒(不同天数，1次/d)：分为阴性对照组、阳性对照组、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d组；第三系列实验为不同剂量火箭煤油多次染毒(5 d，1次/d)：分为阴性对照组、阳性对照组、100 μL组、200 μL组、400 μL组。阴性对照组和阳性对照组涂抹丙酮，各剂量试验组涂抹相应剂量的航天煤油。

2.试剂和仪器：火箭煤油(航天一院101研究所(批号：20110805)，DNFB(北京蓝博斯特生物技术有限公司)，丙酮(北京益利精细化学品有限公司)，麻油(福临门中粮集团)，分析天平BS110S型(北京赛多利斯天平有限公司)。

二、实验方法

1.DNFB溶液配制：致敏或攻击临用前新鲜配制1%DNFB 20 mL，称取DNFB 200 mg(当DNFB呈液态时可用注射器吸取药物后滴于小瓶中称量)。将称取的药物置于干净小瓶中，将预先配好的丙酮麻油溶液(丙酮∶麻油为1∶1)倒入小瓶内，盖好并用封口膜封口，混匀后，备用。

2.致敏：每只鼠背部用电推子去毛，范围约3 cm×3 cm，注意不能损伤皮肤，用外科胶布仔细粘掉残留的碎毛，按照上面分组方法涂抹航天煤油，对照组涂抹丙酮。末次涂抹3 h后除阴性对照组外将50 μL 1%DNFB溶液均匀涂抹于鼠背上。第2天DNFB强化1次。

3.DTH反应的产生与测定：致敏后第5天，将1%DNFB溶液20 μL均匀涂抹于小鼠右耳的两面进行攻击。攻击后24 h，颈椎脱臼处死小鼠，称重，剪下左右耳廓，用直径8 mm打孔器取下的耳片，称重。同时取小鼠胸腺及脾脏称重，左右耳片重量之差为肿胀度，(右耳重-左耳重)/左耳重为肿胀率，分别以每100 g小鼠的脾重(mg)和胸腺重(mg)作为脾指数和胸腺指数[6]。见图1。

图1 DTH反应小鼠耳肿胀情况图(左耳：未激发；右耳：激发)

三、统计学分析

结 果

一、不同剂量火箭煤油一次染毒对DNFB所致DTH的影响

与阴性对照组比较，阳性对照组小鼠耳肿胀度、肿胀率和脾指数有显著增加，胸腺指数有显著降低。与阳性对照组比较，200 μL组小鼠耳肿胀度和肿胀率显著降低、胸腺指数显著升高(P<0.05)；400 μL 组的小鼠耳肿胀度和肿胀率显著降低、胸腺指数显著升高(P<0.05)，随染毒剂量的增加，变化趋势更为明显。见表1。

二、同一剂量航天煤油不同次数染毒对DNFB所致DTH的影响

与阴性对照组比较，阳性对照组小鼠耳肿胀度、肿胀率和脾指数有显著增加，胸腺指数有显著降低。与阳性对照组比较，4 d组小鼠脾指数显著降低(P<0.05)，与阳性对照组比较，5 d组小鼠耳肿胀度、肿胀率和脾指数显著降低、胸腺指数显著升高(P<0.05)。随着染毒次数的增加，变化趋势更为明显。见表2。

三、不同剂量航天煤油多次染毒对DNFB所致DTH的影响

与阴性对照组比较，阳性对照组小鼠耳肿胀度、肿胀率和脾指数有显著增加，胸腺指数有显著降低。与阳性对照组比较，100 μL组、200 μL组和400 μL组小鼠耳肿胀度、肿胀率、脾指数显著降低(P<0.05)，胸腺指数显著升高(P<0.05)，随染毒剂量的增加，变化趋势更为明显。见表3。

表1 不同剂量航天煤油一次染毒对DTH的影响

注：与阴性对照组比较:at=534.60、bt=524.37、ct=16.72、dt=9.11，P<0.05；与阳性对照组比较:et=2.27,P<0.05；与阳性对照组比较:ft=28.07、gt=26.96、ht=5.71,P<0.05

表2 同一剂量航天煤油不同次数染毒对DTH的影响

注：与阴性对照组比较:at=44.64、bt=24.40、ct=18.82、dt=2.50,P<0.05；与阳性对照组比较:et=39.43；与阳性对照组比较:ft=8.23、gt=4.51、ht=5.29,P<0.05

表3 不同剂量航天煤油多次染毒对DTH的影响

注：与阴性对照组比较:at=3346.73、bt=224.90、ct=16.64、dt=3.09,P<0.05； 与阳性对照组比较:et=868.65、ft=10.35、gt=3.55、ht=2.69,P<0.05；与阳性对照组比较:it=55.53、jt=34.67、kt=4.28、lt=2.81,P<0.05；与阳性对照组比较:mt=81.69、nt=49.90、ot=4.65、pt=5.37,P<0.05

讨 论

DNFB是一种半抗原，将其溶液涂抹皮肤后，可与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激T淋巴细胞增殖成为致敏淋巴细胞。首次接触4～7 d后将其再次涂抹于皮肤，可使局部产生DTH，在抗原攻击后24～48 h到达高峰，于此时测定局部肿胀，用来反映迟发型皮肤超敏反应的强度。DTH是由CD4+Thl细胞介导的以单个核细胞浸润和组织细胞损伤为主要特征的细胞免疫反应，其中T细胞在移植物排斥、自身免疫、肿瘤免疫和移植物抗宿主病等方面起着关键作用，是机体细胞免疫功能的体现[7-8]。因此二硝基氟苯皮肤试验可作判断机体细胞免疫功能的指标之一。二硝基氟苯作为分析纯化学试剂，纯度高，化学性能稳定，其免疫原性也比较稳定[9]。另外本实验通过称量耳片重量来评价局部肿胀程度，具有客观、人为误差小等优点。

小鼠背部皮肤1次染毒200 μL火箭煤油出现明显免疫抑制作用(20 g小鼠体表面积0.0044 m2)，换算成人l次皮肤接触85m航天煤油即可产生明显的免疫抑制作用(70 kg作业人员体表面积1.87 m2)，这种接触剂量是作业人员日常工作中皮肤可能接触到的剂量；小鼠1次/d接触100 μL航天煤油5 d，换算成人1次/d皮肤接触43 mL航天煤油5 d也能产生明显的免疫抑制作用[10]。因此作业过程中应严格做好皮肤防护，避免皮肤接触沾染，但是根据本实验并不能得出航天煤油接触后免疫抑制作用的持续时间是多长，具体的免疫抑制作用机制仍有待于进一步研究。

1 徐冰心，刘志国，李成林，等. 火箭煤油对家兔的皮肤刺激性研究[J]. 中华航空航天医学杂志，2012，23(4)：278-233.

2 徐冰心，李成林，刘志国，等. 褪黑素减轻动态吸入火箭煤油小鼠肺组织氧化损伤[J/CD]. 中华卫生应急电子杂志，2015，1(2)：15-17.

3 徐冰心，刘志国，李成林，等. 火箭煤油对家兔的皮肤刺激性研究[J]. 中华航空航天医学杂志，2012，23(4)：278-233.

4 徐冰心，王建营，司少艳，等. 火箭煤油的动物皮肤致敏性研究[J]. 中华航空航天医学杂志，2014，25(4)：280-285.

5 Xu B，Li C，Wang J，et al. Lung injury via oxidative stress in mice induced by inhalation exposure to rocket kerosene[J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8(5)：5497-502.

6 王心如．毒理学实验方法与技术[M]．北京；人民卫生出版社，2003: 52．

7 Cher DJ，Mosmann TR.Two types of murine helper T cell clone. II. Delayed-type hypersensitivity is mediated by TH1 clones[J].J Immunol，1987，138(11)：3688-94.

8 胡佳哲，李云. Th1/Th2失衡与疾病相关性的研究进展[J]. 华西医学, 2009，24(1)：236-237.

9 Moorhead JW.Tolerance and contact sensitivity to DNFA in mice. VIII. Identification of distinct T cell subpopulations that mediate in vivo and in vitro manifestations of delayed hypersensitivity[J].J Immunol，1978，120(1)：137-44.

10 徐叔云，卞如濂.药理实验方法学[M].2版.北京:人民卫生出版社，2002：202.