茺蔚子药材储藏过程中水苏碱变化的影响因素分析
2015-01-13张美玲迟铁铮单英俏姜丽娇贡济宇蔡广知
张美玲， 迟铁铮， 单英俏， 姜丽娇， 于 野， 贡济宇*， 蔡广知*
（1.长春中医药大学，吉林长春130117；2.吉林市人民医院，吉林吉林132001）
茺蔚子药材储藏过程中水苏碱变化的影响因素分析
张美玲1， 迟铁铮2， 单英俏1， 姜丽娇1， 于 野1， 贡济宇1*， 蔡广知1*
（1.长春中医药大学，吉林长春130117；2.吉林市人民医院，吉林吉林132001）
目的以水苏碱为指标来考察影响茺蔚子药材储藏过程中水苏碱含有量的因素及其变化趋势。方法采用HPLC-ELSD法测定不同产地茺蔚子中水苏碱，选用以氨基键合聚合物为填充剂的色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5μm），流动相为乙腈-0.2%醋酸溶液 （84∶16）；体积流量为1.0 mL/min，柱温是35℃，蒸发光闪射检测器。考察温度、光照和时间对茺蔚子中水苏碱的影响。结果方法平均回收率为98.3%，RSD=1.1%。不同产地的茺蔚子药材中水苏碱的含有量为2.19～3.13 mg/g；温度对盐酸水苏碱的含有量无影响；光照储存7个月后药材中水苏碱的含有量降低44.34%；储存24个月药材中水苏碱的含有量下降18.83%。结论建立了茺蔚子药材的成分定量测定方法，填补了药材标准的空缺；光照条件下，茺蔚子药材中水苏碱含有量明显下降，水苏碱见光易降解，故茺蔚子药材、饮片及其相关制剂在储存或生产过程中均需要避光保存。尽量缩短药材周转期。
茺蔚子；高效液相色谱-蒸发光散射法；盐酸水苏碱；影响因素
茺蔚子为唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的干燥成熟果实［1］，具有活血调经，清肝明目的功效［2］，为常用的妇科用中药，全国大部分地区均有分布。含益母草宁碱、水苏碱及脂肪油［3］，油酸及亚麻酸占油总量的84.84%，另含维生素A样物质［4］。2010年版 《中国药典》中茺蔚子药材标准无成分定量测定项，水苏碱是茺蔚子中的主要活性成分之一，本实验拟建立茺蔚子中水苏碱的HPLC-ELSD定量测定法，并对药材中水苏碱的影响因素及变化趋势进行分析。
1 仪器与试药
1.1 仪器 安捷伦1100高效液相色谱仪，SEDEX 55蒸发光散射检测器，自动进样器，安捷伦液相色谱工作站，Asahipak NH2P-50 4E色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；超声波提取器（昆山禾创超声仪有限公司）；AL204型万分之一电子天平 （瑞士），AB135-S型十万分之一电子天平（瑞士）。
1.2 试药 盐酸水苏碱对照品 （批号110712-201010，购于中国食品药品检定研究院）；药材采自全国各地；乙腈为色谱纯，水为超纯水；醋酸为优级纯，其他试剂均为分析纯。
2 实验方法与结果
2.1 对照品溶液的制备 精密称取盐酸水苏碱对照品4.87 mg，置10 mL棕色量瓶中，加70%乙醇溶解，定容至刻度，摇匀，即得。
2.2 供试品溶液的制备 取茺蔚子药材粉末 （过三号筛）约3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足失质量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3 色谱条件与系统适用性试验 氨基键合聚合物为填充剂的Asahipak NH2P-50 4E色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-0.2%醋酸溶液 （84∶16）；体积流量1 mL/min；柱温35℃；SEDEX 55蒸发光散射检测器 （漂移管温度35℃，压力为2.2 bar），进样量为5μL。理论塔板数按盐酸水苏碱计应不低于6 000。对照品和供试品色谱图见图1和图2。
图1 盐酸水苏碱对照品色谱图Fig.1 HPLC chromatograMof stachydrine reference substance
图2 茺蔚子色谱图Fig.2 HPLC chromatograMof Leonuri Fructus
2.4 方法学验证试验
2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取上述盐酸水苏碱对照品溶液 （每1 mL含对照品0.487 mg）1、3、5、7、9μL，注入液相色谱仪，以进样量（μg）取对数为横坐标，峰面积积分值取对数为纵坐标，绘制标准曲线。计算得回归方程 y= 1.550 3x+2.149 5，r=0.999 9，表明盐酸水苏碱在0.487～4.383μg范围内线性关系良好。
2.4.2 精密度试验 精密吸取同一盐酸水苏碱对照品溶液及供试品溶液连续进样6次，每次5μL，测得盐酸水苏碱峰面积的RSD分别为1.2%、1.9%，表明仪器的精密度良好。
2.4.3 重复性试验 取同一批茺蔚子药材6份，精密称定，按 “2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定，测得水苏碱RSD为1.7%，平均含有量为2.62 mg/g，表明方法重复性良好。
2.4.4 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液及对照品溶液各 5μL，分别在 0、2、4、8、12、24 h注进样测定，测得盐酸水苏碱峰面积的RSD分别为1.0%、1.5%，表明盐酸水苏碱对照品溶液和供试品溶液在24 h内稳定。
2.4.5 加样回收率试验 精密称取已知含有量的样品6份，每份约1.5 g，置锥形瓶中，分别精密加入盐酸水苏碱对照品适量，按 “2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算回收率，结果盐酸水苏碱的平均回收率为98.3%，RSD为1.1%，说明本方法准确度良好。
表1 回收率试验结果Tab.1 Results of recovery tests
2.5 样品测定 取16份不同产地的茺蔚子药材，按 “2.2”项下方法各平行制备两份供试品溶液，按 “2.3”项下条件测定，记录水苏碱峰面积并计算，结果见表2。
2.6 影响因素考察
2.6.1 温度控制 取茺蔚子3批每批9份样品（每份100 g，置白色透明玻璃瓶），分别放于（15±1）℃、 （25±1）℃和 （35±1）℃恒温箱中，每批每箱3份，用黑色不透光的纸包裹，每个月取适量样品，按上述方法制备样品溶液并测定水苏碱量。
表2 不同产地茺蔚子药材中盐酸水苏碱的测定Tab.2 DeterMination of the content of stachydrine nydro chloride in Leonuri Fructus froMdifferen t grow ing areas
2.6.2 光照控制 取茺蔚子3批每批6份样品（每份100 g，置白色透明玻璃瓶），放于留样室同一地点的样品架，每批次取3份，避光保存 （黑色遮光纸包裹），另9瓶见光保存 （白色透明玻璃瓶），每月取上述条件储存的样品适量，按上述方法制备样品溶液并测定水苏碱量。
2.6.3 储存时间考察 取茺蔚子3批每批3份样品，25℃避光放置 （黑色遮光纸包裹），定期取上述条件储存样品适量，按上述方法制备样品溶液并测定水苏碱量。
2.7 影响因素考察结果
2.7.1 温度对水苏碱的影响 在 （15±1）℃、（25±1）℃ 和 （35±1）℃条件下，储存7个月后茺蔚子中水苏碱平均含有量分别下降 2.30%、2.30%和2.60%，说明温度对药材中水苏碱的含有量影响较小。结果见图3。
图3 温度对茺蔚子药材中盐酸水苏碱的影响Fig.3 Effect of teMperature on the contents of hydrochloric stachydrine in Leonuri Fructus medicinalmaterials
2.7.2 光照对水苏碱的影响 光照对茺蔚子中水苏碱的含有量有显著影响，避光保存7个月，3批产品中水苏碱的平均含有量为3.22 mg/g，见光保存，水苏碱的平均含有量为1.79 mg/g，含有量降低44.34%，见光降解为水苏碱含有量下降的主要原因。结果如图4。
图4 光照对茺蔚子中水苏碱的影响Fig.4 Effect of light on the contents of hydrochloric stachydrine in Leonuri Fructus medicinalmaterials
2.7.3 储存时间考察结果 随储存时间的延长，茺蔚子中水苏碱的含有量逐步减少，到24个月时，水苏碱含有量下降18.83%。结果见表3。
表3 储存时间对茺蔚子中水苏碱的影响Tab.3 E ffect of storage time on the content of of hydroch loric stachydrine in Leonuri Fructus medicinalmaterials
3 讨论
《中国药典》2010年版中茺蔚子药材的质量标准中只作了定性鉴别规定，没有成分定量测定的具体标准，本实验建立了茺蔚子药材中水苏碱的HPLC-ELSD测定方法，水苏碱属于季铵碱，最大吸收波长192 nm也仅有微弱吸收，使用紫外检测器有信号响应值小、基线噪音大、基线不易稳定等因素影响测定结果，蒸发光散射检测器能克服上述缺点［5-9］，所以采用通用型检测器蒸发光散射检测器进行检测。
实验参数及条件的考察。供试品溶液的制备时，曾比较乙醇、70%乙醇和盐酸甲醇3种溶剂的提取效果［10-12］，提取的完全程度70%乙醇 ＞乙醇＞盐酸甲醇；提取方法考察了加热回流法和超声提取法，两法提取效果没有差异，故选择简便、省时的超声提取法。曾考察 《中国药典》2010年版益母草药材中盐酸水苏碱含量测定的色谱条件，色谱柱选用丙烯酰胺键合硅胶（Venusil HILIC4.6 mm×250 mm）作为填充剂［1］，结果表明，该类色谱柱的基线噪音较高，无法达到定量要求。后采用氨基键合聚合物（Asahipak NH2P50 4E 4.6 mm×250 mm）作为填充剂，结果表明，基线噪音低，重复性好，能够满足定量要求，故选择氨基键合聚合物为填充剂的色谱柱进行测定。经比较乙腈-0.2%磷酸溶液 （80∶20）与乙腈-0.2%磷酸溶液（84∶16）两种流动相，结果乙腈-0.2%磷酸溶液（84∶16）作为流动相时，色谱峰分离度高，无拖尾，阴性无干扰，因此选择乙腈-0.2%磷酸溶液（84∶16）作为流动相。
不同产地的茺蔚子中水苏碱的含有量存在较大差异，其中辽宁省大洼县所产茺蔚子中水苏碱的含有量最高，16份不同产地的茺蔚子中水苏碱的平均含有量为2.63 mg/g，乘以系数0.8，水苏碱的量为2.10 mg/g，可作为茺蔚子药材质量评价的参考标准。
茺蔚子中水苏碱含有量的影响因素结果显示水苏碱见光易降解［13-14］，故茺蔚子药材储藏过程中应常温、避光保存，保存期应控制在24个月内。本实验对于指导茺蔚子药材及其制剂产品的规范化生产及安全有效使用具有现实意义。
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Influencing factors in the change of stachydrine hydrochloride in Leonuri Fructus during storage
ZHANGMei-ling1， CHITie-zheng2， SHAN Ying-qiao1， JIANG Li-jiao1， YU Ye1， GONG Ji-yu1*，
CAIGuang-zhi1*
（1.Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117，China；2.Jilin City People's Hospital，Jilin 132001，China）
Fructus Leonuri；HPLC-ELSD；stachydrine hydrochloride；influencing factors
R284.1
：A
：1001-1528（2015）05-1056-04
10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.028
2014-12-29
吉林省重点科技攻关项目 （20130338SC）
张美玲（1990—），女，硕士生，研究方向为中药活性物质。E-mail：jlseven-fairy@163.com
*通信作者：贡济宇 （1960—），女，教授，研究方向为药物分析。Tel：（0431）86172207，E-mail：gjy0431@126.com蔡广知 （1977—），男，讲师，研究方向为中药鉴定及质量分析。Tel：13159751573，E-mail：80188429@qq.com
