补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素测定

赵 婷， 朱汀滢， 吴 斌

（扬子江药业集团上海海尼药业有限公司，上海201318）

补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素测定

赵 婷， 朱汀滢， 吴 斌*

（扬子江药业集团上海海尼药业有限公司，上海201318）

目的根据 《欧洲药典》质量标准要求，改进补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素的HPLC测定方法。方法补骨脂以甲醇提取，YMC-Triart C18色谱柱（4mm×250mm，5μm），流动相为乙腈-水（35∶65），等度洗脱，体积流量为1mL/min，检测波长为246 nm。结果补骨脂素和异补骨脂素在10～100μg/mL范围内成线性，并在Merck-LiChrospher RP-18（4 mm×250 mm，5μm）和Waters Spherisorb ODS2 column（4mm×250mm，5μm）色谱柱上可重复实验结果，两成分的定量测定结果偏差分别为1.50%和1.33%。7个省和缅甸产共16批补骨脂样品中的补骨脂素和异补骨脂素含有量在1.11% （云南）和0.29% （广西）之间。结论建立的方法可符合欧盟植物药申报专属性、精密度（日间、日内）、准确度的要求。

补骨脂；HPLC；补骨脂素；异补骨脂素；《欧洲药典》

中药补骨脂最早收载于 《开宝本草》，是豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实，别名破故纸、胡韭子、胡故子等。其性温，味辛，入肾经，补肾助阳，在中医临床上主治肾虚泄泻、阳萎、遗精、尿频数、腰膝冷痛、虚寒喘咳等病症。现代医学研究表明，补骨脂还具有抗肿瘤、抗菌、抗骨质疏松、抗雌激素样作用等多种药理活性，以及治疗白癜风、牛皮癣等疾病［1-3］。补骨脂素（psoralen）和异补骨脂素（isopsoralen）属于呋喃香豆素类化合物，是补骨脂中两种重要的活性成分。补骨脂素具有抗肿瘤活性，对肉瘤、艾氏腹水瘤和肝癌细胞的生长具有明显的抑制作用［4］，并且能抑制多巴胺和去甲肾上腺素的转运，可治疗帕金森病、抑郁症、注意力缺陷多动障碍等疾病［5］。另外在体内实验中，它还被证明可以抑制乳腺癌向骨转移［6］。

2005年， 《欧洲药典》开始进行中药-植物药专论的工作，而到2013年为止，约有12%的内容与草药相关，并且约有187种草药专论被收录在《欧洲药典》中［7］。但目前我国尚无中药标准被《欧洲药典》采纳，为了今后更多的中药及中成药被国际接受，中药质量标准的国际化就显得非常重要了。

补骨脂属于首批被推荐入选 《欧洲药典》的药材。本实验分析了先前补骨脂的质量研究报道［5-10］，得到高品质、高鲁棒性 （robustness）的HPLC法，用以定量测定样品中补骨脂素与异补骨脂素，进而应用于多个产地的补骨脂中，为该药材的质量控制提供较可靠的方法。

1 实验材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪，包括Aglient 1260、G1312C泵、G1314F检测器、G1316A柱温箱、G1329B自动进样器（美国Aglient公司）；AB205十万分之一电子天平 （瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250B数控超声波清洗仪 （昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药 补骨脂素 （中国食品药品检定研究院，批号110739-201115，纯度99.3%）；异补骨脂素对照品 （中国食品药品检定研究院，批号110738-201313，纯度100%）；乙腈为色谱纯 （德国Merck公司）；水为超纯水 （自制）；其他试剂为分析纯 （国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 供试样品 补骨脂药材来源于市场购买和采集，经上海中医药大学中药学院生药教研室张红梅博士鉴定为豆科植物补骨脂Psoralen corylif olia L.的成熟果实。

2 色谱条件与系统适应性试验

2.1 《中国药典》2010年版方法 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水 （55∶45）为流动相；检测波长为246 nm；理论板数按补骨脂素峰计算应不低于3 000［8］。

采用《中国药典》常用的内径4.6mm的色谱柱（YMC-Triart C18，4.6 mm×250 mm，5μm）及《欧洲药典》常用的内径4.0 mm的色谱柱（YMC-Triart C18，4.0 mm×250 mm，5μm）进行方法重现。

补骨脂供试品 《中国药典》法分析色谱图见图1。可见两种内径的补骨脂素及异补骨脂素峰对称性较差 （内径4.0 mm对称因子分别为0.79、0.82；内径4.6 mm对称因子分别为0.79、0.83），不能满足 《欧洲药典》对称性大于0.85的要求，因此我们对此方法进行优化。

图1 《中国药典》法补骨脂供试品分析Fig.1 HPLC fingerprints of Psoralea corylifolia L.

2.2 优化的色谱方法 YMC-Triart C18色谱柱（4 mm×250 mm，5μm）、YMC-Triart C18（4 mm× 250 mm，5μm），流动相为乙腈-水 （35∶65），体积流量1 mL/min；检测波长246 nm，柱温30℃。空白溶液、补骨脂素及异补骨脂素混合对照品、补骨脂供试品的色谱图见图2。

两种内径下的对称性得到了改善 （内径4.0 mm对称因子分别为0.87和0.88；内径4.6 mm对称因子分别为0.92和0.96），在4.0 mMYMC色谱柱下，补骨脂素及异补骨脂素的分离度为2.90，满足 《欧洲药典》大于1.5的要求，较原 《中国药典》方法有较大的改善，峰形良好，专属性强。按照欧洲药典的要求，本实验采用YMC-Triart C18（4 mm×250 mm，5μm）进行方法验证及样品测定。

3 方法与结果

图2 空白溶液 （A）、补骨脂素及异补骨脂素混合对照品4.0 mm柱（B）、补骨脂供试品的HPLC图-新方法4.0mm柱（C）、补骨脂供试品的HPLC图-新方法在4.6 mm柱（D）Fig.2 HPLC fingerprints of blank solution（A），Mixed reference of psoralen and isopsoralen（B），test sample of P.corylifolia L.（4.0 mMcolumn）（C），test saMp le of P.corylifolia L.（4.6 mMcolumn）（D）

3.1 对照品溶液的制备 分别精密称取补骨脂素和异补骨脂素对照品各14 mg，置50 ML量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，缓慢摇匀。分别精密吸取1mL试液置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，缓慢摇匀，即得混合对照品溶液。

3.2 供试品溶液的制备 取补骨脂药材粉碎成细粉，过三号筛。取药材粉末0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声提取 （功率250W，频率40 kHz）45 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量。过滤，取续滤液用微孔滤膜 （0.45μm）滤过，作为供试品溶液。

3.3 线性关系 精密称取补骨脂素21.73 mg，置100 mL量瓶中，以甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，按倍比稀释法制成7个系列质量浓度的对照品溶液。

精密称取异补骨脂素10.06 mg，置50 ML量瓶中，以甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，按倍比稀释法制成7个系列质量浓度的对照品溶液。

准确吸取上述对照品溶液10μL，按 “2.2”项色谱条件进行测定，以对照品的质量浓度x（μg/mL）为横坐标，测得的峰面积积分值y为纵坐标绘制标准曲线，两个成分的线性回归方程及线性范围结果见表1。由表可知，补骨脂素和异补骨脂素在10～100μg/ML的质量浓度范围内线性良好。

表1 补骨脂素和异补骨脂素的线性方程及线性范围Tab.1 Linear equation and linear range of psoralen and isopsoralen

3.4 精密度 称取补骨脂样品 （1号）6份，按“3.2”项操作，在 “2.2”项条件下进行测定。按上述操作测定3 d，测定补骨脂素和异补骨脂素的量，计算相对标准偏差，结果见表2，可知该仪器的精密度 （日间、日内）良好。

表2 精密度试验结果（n=18）Tab.2 Results of intra-day precision（n=18）

3.5 回收率 取补骨脂素和异补骨脂素含有量已知的补骨脂药材 （1号）粉末0.15 g，精密称定9份，每3份加入相同量 （分别为已知含有量的50%、100%、150%）的补骨脂素和异补骨脂素对照品，按 “3.2”项操作，在 “2.2”项条件下测定，计算回收率及RSD，结果见表3和表4，可知该方法准确度良好，加样回收率数据均符合规定。

表3 补骨脂素加样回收率试验结果 （n=9）Tab.3 Result of recovery tests for psoralen（n=9）

表4 异补骨脂素加样回收率试验结果 （n=9）Tab.4 Result of recovery tests for isopsoralen（n=9）

3.6 稳定性 取补骨脂 （1号）粉末0.3 g，精密称定，按 “供试品溶液制备”项下操作，在上述色谱条件下，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进行测定，以补骨脂素和异补骨脂素的峰面积进行考察，计算RSD。结果显示，24 h内补骨脂素和异补骨脂素的RSD分别为0.93%和1.85%，表明样品在24 h内稳定性良好。

3.7 重复性 取补骨脂样 （1号）9份 （低、中、高剂量各三份），按 “3.2”项下操作，在 “2.2”项条件下测定，计算各成分量及其相对标准差。结果表明，补骨脂素的和异补骨脂素的平均含有量分别为0.54%和0.52%，RSD分别为1.03%和1.26%，可知该方法测定补骨脂中补骨脂素的和异补骨脂素的重复性良好。

3.8 耐用性 分别采用Merck Lichrospher RP-18（4 mm×250 mm，5μm）、Waters Spherisorb ODS2 column（4 mm×250 mm，5μm）、YMC-Triart C18（4 mm×250 mm，5μm）三个品牌的色谱柱对补骨脂药材进行补骨脂素的和异补骨脂素的测定。结果发现，各色谱柱的分离效果及色谱峰形均较理想，且两成分的定量测定结果偏差分别为1.50%和1.33%。同时，对流动相比例、体积流量、柱温进行耐受性考察。结果发现，各条件下分离效果理想，且补骨脂素和异补骨脂素的含量测定结果偏差均小于2.0%。由此可知，该测定方法有较好的耐受性。

4 样品测定

按 “3.2”项下操作，在 “2.2”项下条件测定16批样品，结果见表5。由表可知，不同产地补骨脂中2种成分的含有量差异较大，高者达到1.11% （云南），低者为0.29（广西），同一产地的补骨脂2种成分的含有量也有较大差异。

表5 多个产地样品测定结果Tab.5 Content results of P.corylifolia L.froMdifferent growing areas

5 灰分和酸不溶性灰分

从16批药材中选取2种成分含有量较高的补骨脂，按照 《欧洲药典》要求进行灰分和酸不溶性灰分的实验，结果见表6。

表6 不同产地补骨脂水分、灰分以及酸不溶性灰分的检测Tab.6 Test of loss of drying，total ash and ashinsolublein-HCl of P.corylifolia L.

6 讨论

文献［8-15］报道，补骨脂定量测定所采用的流动相以甲醇-水系统为主，另外还有甲醇-乙酸系统，但对色谱柱损害比较大。在 《中国药典》2010年版中，含量测定采用 “以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水 （55∶45）为流动相；检测波长为246 nm；理论板数按补骨脂素峰计算应不低于3 000”的方法，其流动相为甲醇-水系统，黏性较大，导致系统压力很高，而且测定的补骨脂素和异补骨脂素峰形较差。另外，对补骨脂药材的前处理采用甲醇索氏提取2 h，操作方法繁琐，时间较长，且精密度较差。

本实验对提取方式 （超声提取、加热回流、索式提取）进行考察，同时考察了提取溶媒种类、溶媒用量、提取时间，最终确定采用甲醇50 ML，超声提取45 min作为供试品溶液的制备方法。经验证，本实验测定补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素的方法专属性强，在10～100μg/ML范围内成线性关系，精密度、重复性及准确度良好，稳定性较高，耐受性较好，可较有效地监控补骨脂药材的质量，符合欧盟植物药申报专属性、精密度 （日间及日内）、准确度的要求。

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Improvement in deterMination of psoralen and sopsoralen froMPsoralea corylifolia L.

ZHAO Ting， ZHU Ting-ying， WU Bin*
（Shanghai Haini Pharmaceutical Co.，Ltd.，Yangtze River Pharmaceutical Group，Shanghai201318，China）

AIMTo establish an HPLCmethod for determining the contents of psoralen and isopsoralen froMPsoralea corylifolia L.in agreementwith European Pharmacopoeia.METHODSThe analysis of P.corylifolia L methanolic extractwas carried out on YMC-Triart C18（4 mm×250 mm，5μm）column with acetonitrile-water（35∶65）asmobile phase in isocratic elution manner and 1 mL/min of flow speed，and detection wavelength was set at254 nm.RESULTSThe linear relationships of psoralen and isopsoralen were in the range froM10 to 100 μg/mL.The same process was repeated on Merck-LiChrospher RP-18（4 mm×250 mm，5μm）and Waters Spherisorb ODS2 column（4 mm×250 mm，5μm），their biaswere restricted to the limitof1.50%and 1.33%，respectively.The contents of psoralen and isopsoralen collected froMseven provinces in China and Burma fellwithin the range of1.11%（Yunnan Province）and 0.29%（Guanxi Region）.CONCLUSIONThe established method can satisfy the requirements of European Pharmacopoeia in specificity，precision and accuracy of P.corylifolia L.

Psoralea corylifolia L.；HPLC；psoralen；isopsoralen；European Pharmacopoeia

R284.1

：A

：1001-1528（2015）05-1036-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.024

2014-12-06

赵 婷 （1984—），女，博士，研究方向为中药学。

*通信作者：吴 斌 （1976—），男，博士，高级工程师，研究方向为天然药物化学。Tel：（021）68128999