青龙衣水解单宁含量测定方法研究

姜 蕊，张 霞，邢 丹，刘子祯，刘伟锐，杨 悦，王晓宏，折改梅（北京中医药大学中药学院中药化学系，北京 100102）

青龙衣水解单宁含量测定方法研究

姜 蕊，张 霞，邢 丹，刘子祯，刘伟锐，杨 悦，王晓宏，折改梅＊（北京中医药大学中药学院中药化学系，北京 100102）

目的 建立青龙衣水解单宁含量测定的方法。方法 以没食子酸为对照品，研究青龙衣水解单宁的含量测定，采用紫外－可见分光光度法，确定改良的Folin－Ciocalteu法运用于青龙衣单宁含量测定显色的最佳条件，测定青龙衣酸解前后总单宁的含量。结果 测定没食子酸的标准曲线方程为：Y＝151.8 X＋0.041，在0.992～4.960μg·mL－1范围内线性关系良好，r＝0.999（n＝6）。优化的显色方法为1.0mL的样品液，Folin－Ciocalteu 1.5mL，加去离子水10mL，用70g·L－1的碳酸钠定容至25 mL，30℃显色1.5h。结论 该显色方法操作简便，准确度高、稳定性和重复性良好，既适用于未酸解单宁样品的含量测定，也适用于酸解后单宁样品的含量测定，对水解单宁类成分的含量测定具有普遍适用性。

青龙衣；单宁；酸解；紫外－可见分光光度法

青龙衣是胡桃科胡桃属植物核桃（Juglans regia Linn.）未成熟果实的干燥果皮，主产于东北、山东、河北等地，为民间常用中药［1－2］。青龙衣中含有萘醌类及其衍生物、黄酮类、二芳基庚烷类和大量水解型单宁［3］。其单宁物质有抗氧化、抗炎镇痛等多种功效［45］。再者，青龙衣有较强的着色功能，其色素物质基础初步认定是水解单宁类成分［6］。但是，迄今为止关于青龙衣单宁含量测定方法却未见详细报道。

中药水解单宁含量测定方法有酒石酸亚铁法、高锰酸钾法和普鲁士兰法［7－9］，多采用醇提物制备供试品，也有采用酸水解样品醇提取物的报道［7－9］。但并未考虑其水解前后2种供试品制备方法是否会对分光光度法的波长和显色条件有显著影响。

鉴于此，笔者对富含单宁类成分的青龙衣水解单宁含量测定方法进行了研究，采用紫外－可见分光光度法，确定了改良的Folin－Ciocalteu法运用于青龙衣单宁含量测定显色的最佳条件，并测定了青龙衣酸解前后总单宁的含量。

本文所建立的显色方法操作简便、准确度高、稳定性和重复性良好，对水解单宁类成分的含量测定具有普遍适用性。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UNICO UV－2000紫外分光光度计（尤尼柯上海公司）；KQ－40KDE超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；DK－S24电热恒温水浴锅（上海精

宏实验设备有限公司）；Sartorious BT 25S1／10 000和Sartorious BS 124S1／10 000电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.2 试药 核桃青皮采自北京昌平，经本文作者鉴定为胡桃科胡桃属植物核桃（Juglans regia Linn.）的外果皮，将其阴干后制得青龙衣。没食子酸对照品（天津市光复精细化工研究所，质量分数99.0%，批号为20120418）；无水碳酸钠、钨酸钠、钼酸钠、磷酸、盐酸、硫酸锂、甲醇（均为分析纯，北京化工厂）。

2 方法与结果

2.1 福林试剂的配制 于500mL的圆底烧瓶中加入钨酸钠20g、钼酸钠5g、蒸馏水140mL、体积分数85%的磷酸10mL、浓盐酸20mL，文火回流10h，去冷凝管，加入硫酸锂10g，蒸馏水10mL，混匀，加入几滴液体溴，煮沸15min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加几滴溴，再煮沸除去。冷却后，过滤，定容于250mL的量瓶中，置于棕色瓶中保存。

2.2 对照品溶液的制备 取没食子酸对照品0.024 8g，用蒸馏水溶解并定容至1 000mL的量瓶中，得质量浓度为0.024 8mg·mL－1的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 未酸解样品（供试品I） 取粉碎后的青龙衣5g，精密称定，用80mL体积分数为80%的甲醇超声提取3次，每次20min，合并提取液，过滤，减压浓缩，再用体积分数为80%的甲醇定容至100mL的量瓶中，作为供试品溶液I。

2.3.2 酸解样品（供试品II） 取青龙衣粉末1g，精密称定，用16mL体积分数80%甲醇超声提取3次，每次20min，过滤，合并滤液，用50mL 5mol·L－1的盐酸100℃酸解2h，离心（转速4 000r·min－1，离心15min），取上清液，用体积分数为80%的甲醇定容至100mL的量瓶中，作为供试品溶液II。

2.4 确定最大吸收波长 分别移取1.0mL对照品溶液、供试品溶液I、供试品溶液II和去离子水，加入1.5mL福林试剂及10mL的去离子水，用70g·L－1的碳酸钠溶液定容至25mL，常温静置反应1.5h后，用紫外可见分光光度计在400～800nm波长范围内扫描，其中对照品溶液的最大吸收波长为766nm、供试品溶液I的最大吸收波长为765nm、供试品溶液II的最大吸收波长为764nm。确定最大吸收波长为766±2nm。

2.5 标准曲线的建立 分别移取质量浓度为0.024 8 mg·mL－1的没食子酸对照品溶液1.0，1.2，2.0，3.0，4.0和5.0mL，加入1.5mL福林试剂后，加去离子水10mL，用70g·L－1碳酸钠溶液定容至25mL，30℃反应1.5h后，在766nm波长下测定吸光度值。以没食子酸标准溶液的质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标作图，得标准曲线：Y＝151.8 X＋0.041，r＝0.999（n＝6）。结果表明，线性关系良好。

2.6 供试品溶液II制备条件的优化 在单因素实验的基础上，选用L9（34）正交实验表，以总单宁含量为指标，因素水平见表1，实验结果见表2。

表1 酸水解的因素水平表Tab.1 Factor and level of orthogonal design

表2 酸水解的L9（34）正交实验结果Tab.2 Results of L9（34）orthogonal design

采用极差分析法，确定最佳的酸解工艺为：50倍量的4mol·L－1的盐酸，在100℃下水解2h。

2.7 显色条件的考察

2.7.1 碳酸钠质量浓度的考察 精密移取供试品溶液I和供试品溶液II各5份，每份1mL，按2.4项的方法操作，分别设置20，45，70，95和120g·L－1的碳酸钠溶液，在766nm处测定吸光度值，供试品溶液I结果依次为0.280，0.387，0.408，0.392和0.413。供试品溶液II结果依次为0.159，0.373，0.378，0.365和0.343。由此可得，在20～70g·L－1的范围内，吸光度值随碳酸钠质量浓度的增大而增加，质量浓度在70～120g·L－1范围内，吸光度值随碳酸钠质量浓度的增大而减小，而在碳酸钠质量浓度为120g·L－1时供试品溶液出现浑浊，故选择最佳碳酸钠质量浓度为70g·L－1。

此显色条件同时适用于供试品I和II。

2.7.2 福林试剂用量的考察 精密移取供试品溶液I和供试品溶液II各5份，每份1mL，按2.4项的方法操作，分别加入福林试剂0.5，1.0，1.5，2.0和2.5mL，在766nm处测定吸光度值，供试品溶液I的结果依次为0.299，0.381，0.491，0.421和0.433。供试品溶液II的结果依次为0.333，0.370，0.383，0.362和0.362。由此可知，最佳福林试剂用量为1.5mL。

此显色条件同时适用于供试品I和供试品II。

2.7.3 显色温度的考察 精密移取供试品溶液I和供试品溶液II各5份，每份1mL，按2.4项的方法操作，分别在20，30，40，50和60℃下加热，在766nm处测定吸光度值，供试品溶液I的结果依次为0.403，0.415，0.371，0.406和0.336。供试品溶液II的结果依次为0.357，0.379，0.363，0.365和0.345。由此可知，最佳的显色温度为30℃。

此显色条件同时适用于供试品I和供试品II。

2.7.4 显色时间的考察 精密移取供试品溶液I和供试品溶液II各5份，每份1mL，按2.4项的方法操作，分别显色0.5，1，1.5，2和2.5h，在766nm波长下测定吸光度值，供试品溶液I的结果依次为0.463，0.476，0.493，0.485和0.482。供试品溶液II的结果依次为0.346，0.362，0.376，0.343和0.340。由此可知，最佳的显色时间为1.5h。

此显色条件同时适用于供试品I和供试品II。

2.8 方法学考察

2.8.1 精密度 移取质量浓度为0.024 8mg·mL－1的没食子酸对照品溶液2mL，按2.4项的方法操作，连续6次在766nm下测定吸光度值。结果依次为0.335，0.336，0.336，0.336，0.337和0.337，RSD为0.22%，表明该仪器精密度良好。

2.8.2 样品稳定性 分别移取供试品溶液I和供试品溶液II各1mL，室温下分别放置0，0.5，1，2，3和4h后，按2.4项的方法操作，在766nm波长下测定吸光度值。供试品溶液I的结果依次为0.489，0.492，0.492，0.492，0.495和0.497，RSD为0.57%；供试品溶液II的结果依次为0.593，0.594，0.597，0.597，0.602和0.602，RSD为0.64%，表明供试品I和供试品II在4h内的稳定性均良好。

2.8.3 重复性的考察 分别按供试品溶液I和供试品溶液II制备，按2.4项的方法操作，于766nm波长处测定其吸光度，计算供试品溶液I中单宁的平均含量为1.292mg·g－1，RSD为2.9%。供试品溶液II中单宁的平均含量为8.682mg·g－1，RSD为1.2%。

2.8.4 加样回收率 取青龙衣粉末6份，每份约2.5g，再向每份青龙衣粉末中加入约3mg没食子酸对照品，精密称定，按供试品溶液I制备样品、2.4项的方法操作，在766nm下测定吸光度值。平均加样回收率为99.87%，RSD为2.8%。结果见表3。

表3 供试品溶液I的加样回收率实验结果Tab.3 Results of recovery tests for sample I

取青龙衣粉末6份，每份约0.5g，再向每份青龙衣粉末中加入约4mg没食子酸对照品，精密称定，按供试品溶液II制备，按2.4项的方法操作，在766nm处测定吸光度值。平均加样回收率为99.56%，RSD为1.6%。结果见表4。

表4 供试品溶液II的加样回收率实验结果Tab.4 Results of recovery tests for sample II

由此一系列的方法学考察结果得出：此种改良的单宁显色方法具有可靠性与普遍适用性。

2.9 样品测定 分别按供试品溶液I和供试品溶液II制备，按2.4项的方法操作，于766nm波长处测定其吸光度，计算供试品溶液中水解单宁的含量。供试品溶液I中水解单宁的含量为1.272mg·g－1，供试品溶液II中水解单宁的含量为9.850mg·g－1。

3 讨论

3.1 对此多酚显色条件的普遍适用性讨论 不同制备方法下的供试品溶液对Folin－Ciocalteu法测定青龙衣水解单宁类成分含量测定的最佳条件没有影响，该实验方法同时适用于醇提单宁类成分和醇提酸解后的单宁类成分，对水解单宁类成分的含量测定具有普遍适用性。

3.2 多酚含量测定显色条件的优化 本实验在优选显色方法时采用低质量浓度的碳酸钠溶液（因为质量浓度增高，造成供试样品浑浊）并采用碳酸钠溶液定容的方法。《中国药典》收录了Folin－Ciocalteu比色法测定单宁类成分的方法，但是其采用福林试剂测定时，确定碳酸钠的质量浓度为290g·L－1，而在作者进行实验时，明显观察到此条件下供试样品有明显的浑浊现象产生，因此采用改良的Folin－Ciocalteu比色法测定。此外，作者还对碳酸钠的用量进行了考察，但是结果显示，其用量的差别对青龙衣水解单宁的含量影响不大。

3.3 酸解工艺考察 在进行正交实验考察供试品酸水解条件前，作者进行了单因素考察，但是结果显示，单因素变量对青龙衣水解单宁类成分含量的影响不大。

3.4 对实验研究对象的探讨 与核桃青皮不同，本实验研究对象为核桃属植物核桃（Juglans regia L.）未成熟果实的干燥果皮青龙衣。经干燥后，本品易于储存，与青皮相比，化学成分尤其是单宁类成分的组成与含量有所不同，并且青龙衣单宁的含量与保存年限有关，随着保存年限的增加，单宁的含量有所降低。

3.5 样品的制备方法对单宁含量的影响 由本实验供试品I和II的含量测定结果显示，水解单宁含量测定影响因素很多。以没食子酸为对照品，酸解后样品单宁的含量大约为未酸解样品的8倍，笔者认为是酸解使供试品中水解单宁酸水解后释放出更多的游离酚羟基，使其与福林试剂的络合度更高，吸光度值增大，从而含量测定值高于未酸解供试品中水解单宁的含量测定值。

［1］吴征镒，周太炎，肖培根，等.新华本草纲目：第3册［M］.上海：上海科学技术出版社，1990.

［2］江苏新医学院.中药大辞典：下册［M］.上海：上海科学技术出版社，1986：1544.

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Determination methods of hydrolysable tannins fromJuglans regia L.

JIANG Rui，ZHANG Xia，XING Dan，LIU Zizhen，LIU Weirui，YANG Yue，WANG Xiaohong，SHE Gaimei＊（School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective To establish a method for the determination of the hydrolyzed tannins fromJuglans regia L..Methods Gallic acid as a reference compound.UVspectrophotometry was used for the determination of the hydrolyzed tannins fromJuglans regia L..The modified Folin－Ciocalteu method was set up，then it was used to determine the contents of both the un－hydrolyzed tannins and the hydrolyzed tannins.Results The standard curve equation was：Y＝151.8 X＋0.041，and gallic acid was linear in the range of 0.992－4.960μg·mL－1，r＝0.999（n＝6）.The optimal conditions for determining the hydrolyzed tannins fromJuglans regia L.were as followed：1.0mL of the sample，1.5mL of F－C reagent，10mL of water，with 70g·L－1sodium carbonate solution to the volume，treatment at 30℃for 1.5h.Conclusion This method is simple，accurate，stable and repeatable.It has universal applicability for the determination of both the un－hydrolyzed tannins and the hydrolyzed tannins.

Juglans regia L.；tannins；hydrolyse；UVspectrophotometry

7,ebook=20

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.005

R282

A

1004－2407（2015）01－0016－05

2014－07－17）

北京中医药大学自主课题（编号：2014－JYBZZXS－119和2013－JYBZZ－JS－137）；国家级大学生创新创业计划（编号：201210026042）；北京市共建项目（编号：BJGJ1326）

姜蕊，女，在读硕士研究生

＊通信作者：折改梅，女，博士，副教授，博士生导师