芎芷地龙汤对偏头痛风热证模型NO、NOS、cGMP的影响

赵永烈，王玉来，姚卓亭，岳广欣

·基础医学论著/研究·

芎芷地龙汤对偏头痛风热证模型NO、NOS、cGMP的影响

赵永烈1，2，王玉来1，姚卓亭1，岳广欣3

目的 探讨芎芷地龙汤对偏头痛风热证一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、环鸟苷酸(cGMP)的影响。方法 使用热风及硝酸甘油协同诱导建立大鼠偏头痛风热证模型，观察2 h内搔头次数，用放免法测定血浆中环鸟苷酸的含量，用硝酸还原酶法测定血浆中一氧化氮的含量，用比色法测定血浆中一氧化氮合酶的含量。结果 偏头痛模型组血浆NOS、NO、cGMP含量升高，与正常组、风热组相比差异有统计学意义(P<0.01)；偏头痛风热证组血浆NOS、NO、cGMP含量继续升高，与正常组比较有统计学意义(P<0.01)；与偏头痛模型组比较有统计学意义(P<0.05)；经过治疗后血浆NOS、NO、cGMP含量恢复，与偏头痛风热证组及偏头痛模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 风热对正常机体无影响，而对硝酸甘油致偏头痛模型病理状态有显著影响，偏头痛模型受风热外袭后血浆NOS、NO、cGMP含量持续升高，芎芷地龙汤能明显改善偏头痛风热证动物模型血浆中升高的NOS、NO、cGMP含量。

偏头痛；风热证；芎芷地龙汤；一氧化氮；一氧化氮合酶；环鸟苷酸

研究表明一氧化氮(nitric oxide，NO)是一个小的气体信使物质，能控制神经信息的传递和血管紧张度，调节基因转录和蛋白质生物合成，诱导蛋白质转译后修饰[1]。NO被普遍认为是引起原发性头痛的触发物[2]，在偏头痛患者外周血中可检测到NO水平升高[3]，NO释放可扩张脑膜血管并激活神经元[4，5]，进而增加痛觉的传导，导致中枢敏化[6，7]。NO由一氧化氮合酶(nitric-oxide synthase，NOS)产生，NO信号传导激活可溶性鸟苷环化酶(soluble guanylyl cyclase，sGC)产生环鸟苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)，进而引起蛋白激酶的磷酸化。而蛋白激酶是重要的细胞内信号传导分子，是作为第二信使通路与c-fos(即早基因蛋白表达)偶联，被广泛应用作为神经元和痛觉激活的标志，在调节疼痛中发挥着重要的作用[8]。我们前期实验证实了芎芷地龙汤有镇痛、镇静作用，并显示与剂量有一定的关系，以中剂量的作用最为稳定[9，10]。并研究了芎芷地龙汤对偏头痛风热证血管活性物质内皮素(ET)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、血栓素A2(TXA2)、前列环素(PGI2)的影响[11]，为进一步研究偏头痛受风热侵袭后，痛觉敏化行为及机制，本实验以血浆中NO、NOS、cGMP为观察指标，研究偏头痛风热证模型中NO、NOS、cGMP含量的变化规律及芎芷地龙汤对各项指标的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 清洁级雄性SD大鼠40只，体重150 g～180 g，由北京维通利华实验动物研究所提供，合格证号：SCXK(京)2005-0005。适应性饲养3 d后随机分为正常组、偏头痛模型组、风热组、偏头痛风热证组、中药治疗组，每组8只。动物分笼群养，室内温度21 ℃～27 ℃，相对湿度45%～55%。各组大鼠喂常规饲料，自由进食饮水。

1.2 药品 芎芷地龙汤[组成：川芎15 g，白芷15 g，生石膏(后下)30 g，地龙20 g，元胡10 g]，饮片均购于北京中医药大学东方医院药房，自行按常规煎煮法煎煮并浓缩，每毫升含生药1.8 g；氯化钠注射液每袋500 mL，北京双鹤药业股份有限公司生产，批号A200909154；硝酸甘油注射液5 mg/mL，北京益民药业有限公司生产，批号20091025；NO测定试剂盒，南京建成生物工程研究所生产，批号：20091020；NOS测定试剂盒，南京建成生物工程研究所生产，批号：20091020；cGMP放免分析试剂盒，北京华英生物技术研究所生产，批号：20091021。

1.3 主要仪器 MDF-330低温冰箱；GC-911γ放免计数器；GL20低温高速离心机；721分光光度计；电吹风 PHILIPS HP8200。

1.4 模型制备与药物干预 实验第1日开始，风热组、偏头痛风热证组、中药治疗组每日早晨固定时间予电吹风吹热风，1档热度，风力1级，距离约45 cm，温度控制于39 ℃～41 ℃，连续吹风7 d，每次2 h，第8日灌胃后30 min，偏头痛模型组、偏头痛风热证组、中药治疗组皮下注射硝酸甘油10 mg/kg，复制实验性偏头痛动物模型，正常组、风热组皮下注射等量的生理盐水。实验第5日开始灌胃给药，连续4 d，中药治疗组灌胃给予芎芷地龙汤(10.8 g/kg)，其余组均灌胃等量生理盐水。

1.5 观察指标

1.5.1 一般情况观察 动物喂养7 d内的一般情况，包括活动情况、皮毛色泽、进食、大便性状。观察第8日皮下注射硝酸甘油或生理盐水后各组大鼠行为改变，并计大鼠搔头次数：以前肢搔脸一次计一次，后肢快速搔头动作从开始到停止计一次，人工观察计算每只大鼠皮下注射后至2 h的搔头次数，以判断实验模型复制是否成功。

1.5.2 血浆标本处理制备 采集颈静脉血6 mL，其中3 mL置入预冷的试管中，每毫升全血加抑肽酶20 μL、10%EDTA-Na215 μL，混匀，迅速低温(4 ℃)离心10 min(3 000 r/min)，分离血浆，置-20 ℃保存待测，用于血中cGMP的测定；另3 mL，每毫升全血加EDTA-Na215 μL颠倒混匀，800 r/min离心10 min，分离血浆，置-4 ℃保存，用于血中NO、NOS的测定。

1.5.3 NO、NOS的测定 NO的测定采用硝酸还原酶法(测定步骤按照试剂盒说明书进行)；NOS的测定采用比色法(测定步骤按照试剂盒说明书进行)；cGMP的测定采用放免法(测定步骤按照试剂盒说明书进行)，由自动γ计数仪器直接读出结果。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况观察 各组大鼠在饲养期间均毛发光洁整齐，食欲可，行动灵活敏捷。风热组、偏头痛风热证组、中药治疗组在吹热风时均有部分大鼠出现烦躁、笼内站立、跳跃，鼻出血的情况。实验开始吹风处理前观察各组大鼠大便，多为软便、中等质地或偏硬质润，开始吹风后，风热组、偏头痛风热证组、中药治疗组大鼠大便无软便，少见中等质地，多为偏硬质润或干硬便，而正常组与偏头痛模型组以中等及偏硬质润便为多。

各组大鼠耳廓与眼结膜的研究，偏头痛模型组、偏头痛风热证组、中药治疗组耳廓漫红，结膜血管纹路明显，而正常组与风热组耳廓整体颜色较淡，结膜脉络无其他3组明显，体现了硝酸甘油对耳廓、结膜血管的扩血管作用。

2.2 芎芷地龙汤对偏头痛风热证实验动物模型行为变化的影响 偏头痛模型组、偏头痛风热证组、中药治疗组皮下注射硝酸甘油后5 min出现烦躁，活动增多，前肢及后肢频繁搔头，双耳耳廓血管较正常组增粗，且血管增长直抵耳缘，结膜血管纹路明显，中药治疗组烦躁、搔头的表现较偏头痛模型组及偏头痛风热证组少，3组在1 h时基本安静蜷卧，其后间断活动，以蜷伏为主。

偏头痛模型组2 h内搔头次数与正常组、风热组、中药治疗组相比，差异有统计学意义(P<0.01)；偏头痛风热证组2 h内搔头次数与正常组、风热组、中药治疗组相比，差异有统计学意义(P<0.01)；正常组与风热组2 h内搔头次数相比，差异无统计学意义(P>0.05)；偏头痛风热证组与偏头痛模型组2 h内搔头次数相比，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组2 h内搔头次数比较(±s) 次

2.3 芎芷地龙汤对偏头痛风热证实验动物模型NO/NOS/cGMP通路的影响 偏头痛模型组血浆NOS、NO、cGMP含量升高，与正常组、风热组相比差异有统计学意义(P<0.01)；偏头痛风热证组血浆NOS、NO、cGMP含量继续升高，与正常组比较有统计学意义(P<0.01)；与偏头痛模型组比较有统计学意义(P<0.05)；经过治疗后血浆NOS、NO、cGMP含量恢复，与偏头痛风热证组及偏头痛模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组血浆中NOS、NO、cGMP含量比较(±s)

3 讨 论

研究表明NO 是一种细胞内信使，在中枢伤害性感受传递中发挥着重要作用[12，13]。NO由L-精氨酸经NOS的催化作用而产生，NO作为第一信使激活胞浆sGC，增加cGMP生成，再激活蛋白激酶G(protein kinase G，PKG)，使有关蛋白或酶类的丝氨酸、苏氨酸残基磷酸化，从而松弛血管平滑肌，扩张血管；cGMP也作为第二信使和神经递质，使局部神经肽-降钙素基因相关肽反复释放；cGMP作为第二信使激活第三信使细胞癌基因c-fos，激活靶基因特异DNA序列，调节基因的转录，从而产生对机体长时程的生理效应。c-fos表达将外界刺激引起的第二信使介导的短时程信号在基因表达上转换成长时程信号，在痛觉引起的突触可塑性变化中起重要作用[14]。在物理因素和化学因素刺激下，软脑膜的eNOS阳性内皮细胞产生NO，大脑内的小动脉和毛细血管(例如大脑动脉和微动脉)扩张，引起典型偏头痛的发生，同时轻度增加脑血流并降低脑血管阻力[15]。分布于大脑动脉和穿通动脉的nNOS免疫阳性副交感神经的节后(硝基能)纤维、含nNOS神经元的谷氨酸能纤维和星形细胞(产生NO的一个可能位点或神经血管信号传导的中介物)也在血管周围释放NO[4]。在三叉神经血管系统(硬脑膜、三叉神经节、三叉神经核)可检测到来源于血管内皮细胞、神经元、星型胶质细胞的NO，NO可促使CGRP和神经递质释放，进而引起血管扩张或神经信号的传递[16]。反过来，CGRP使血管的eNOS活化产生NO，NO弥散入血管平滑肌激活鸟苷酸环化酶，导致cGMP形成，进而使细胞内Ca2+降低，引起血管舒张[1，17]。在人类，在NO供体诱发的头痛期间，CGRP血浆水平升高[18]，在动物，NO促使CGRP从硬脑膜血管周传入神经和三叉神经核释放，而由神经元和三叉神经节神经胶质细胞释放的NO，向三叉神经周围神经元传递信号[19]。

本实验观察到偏头痛模型组、偏头痛风热证组、中药治疗组大鼠皮下注射硝酸甘油后5 min表现出烦躁，活动增多，前肢及后肢频繁搔头，双耳耳廓血管较正常组增粗，且血管增长直抵耳缘，结膜血管纹路明显，中药治疗组烦躁、搔头的表现较硝酸甘油组及风热硝酸甘油组少，3组在1 h时基本安静蜷卧，其后间断活动，以蜷伏为主。正常组与风热组皮下注射生理盐水后亦有搔头表现，数量较其余3组少，耳廓变红，但血管较细，结膜血管脉络较其他3组稀疏，无活动增多，基本蜷卧于笼中。本实验动物行为改变符合文献描述，在时间上有所缩短。同时表明芎芷地龙汤能明显改善偏头痛动物模型的行为学症状，减少动物的阳性反应次数，具有一定的镇痛镇静作用，符合课题组前期研究结论。对于耳廓与眼结膜的研究，偏头痛模型组、偏头痛风热证组、中药治疗组耳廓漫红，结膜血管纹路明显，而正常组与风热组耳廓整体颜色较淡，结膜脉络无其他3组明显，体现了硝酸甘油的对耳廓、结膜血管的扩血管作用。

本研究还提示动物在皮下注射硝酸甘油后血浆NOS、NO、cGMP含量升高，偏头痛模型受风热因素侵袭后，血浆NOS、NO、cGMP含量持续升高，经药物干预后，血浆NOS、NO、cGMP含量回复。通过研究模型动物搔头次数及血浆中NOS、NO、cGMP含量发现，风热对正常组无影响，而对硝酸甘油致偏头痛模型病理状态组有显著影响，正如《灵枢·百病始生》所言：“风雨寒热，不得虚，邪不能独伤人；卒然逢疾风暴雨而不病者，盖无虚，故邪不能独伤人；此必因虚邪之风，与其身形，两虚相得，乃客其形”。当机体接受硝酸甘油后，机体功能紊乱，再给予风热干预后，容易发病，如《素问·评热痛论》曰“邪之所凑，其气必虚”。给予芎芷地龙汤后，能明显改善偏头痛动物模型的行为学症状，使血浆中NOS、NO、cGMP含量水平趋于正常水平，表明芎芷地龙汤通过发挥其祛风通络活血作用，进而调节机体失衡状态水平，达到治疗偏头痛的作用。

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(本文编辑 郭怀印)

Effect of Xiongzhi Dilong Decoction on NO，NOS and cGMP in Migraine Model with Wind-heat Syndrome

Zhao Yonglie，Wang Yulai，Yao Zhuoting，Yue Guangxin

Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China

Objective To study the effects of Xiongzhi Dilong decoction(XDD) on nitric oxide (NO)/NO synthase (NOS)/cyclic guanosine monophosphate (cGMP) in migraine with wind-heat syndrome.Methods The migraine model with wind-heat syndrome was established by combining exterior pathogen(hot wind) and GTN administration.The frequency of scratching head within 2 h was examined.The contents of plasma cyclic cGMP， NO and NOS were assayed by radioimmunoassay(RIA)， nitrate reductase method and colorimetric method.Results The contents of plasma NOS，NO，and cGMP in migraine model were significantly higher than that in normal group and wind-heat group(P<0.01)，and the contents of plasma NOS，NO and cGMP in migraine with wind-heat syndrome model persistently increased，which was significant difference compared to normal group(P<0.01)，and was significant difference compared to migraine model group(P<0.05).The contents of plasma NOS，NO and cGMP in Chinese medicine treatment group were recovered，which was significant difference compared to migraine with wind-heat syndrome model and migraine model group(P<0.05).Conclusion There is no significant effect on normal organism which sufferd from wind-heat，but there is significant effect on migraine model induced by nitroglycerin.The content of plasma NOS，NO and cGMP in migraine model which is invaded by wind and heat persistently increased.XDD can attenuate remarkably the contents of plasma NOS，NO and cGMP in migraine model with wind-heat syndrome.

migraine；wind-heat syndrome；Xiongzhi Dilong decoction；nitric oxide； nitric oxide synthase；cyclic guanosine monophosphate

国家自然科学基金项目(No.81373591)

1.北京中医药大学东方医院(北京 100078)，E-mail：yongy3@126.com；2.北京中医药大学第三附属医院(北京 100029)；3.中国中医科学院

R747.2 R285.5

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2015．10．005

1672-1349(2015)10-1165-04

2015-05-30)