土壤中固氮菌对农药抗性的研究

乔秀丽，迟彩霞

(绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化 152061)



土壤中固氮菌对农药抗性的研究

乔秀丽，迟彩霞

(绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化 152061)

[目的]了解自生固氮菌对不同农药的抗性。[方法]根据固氮菌自身的特点，应用无氮培养基分离自生固氮菌获得纯种的自生固氮菌；通过抑菌圈试验及分光光度计测定其吸光值研究了草甘膦异丙胺盐、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、咪锰·多菌灵3种常用农药对自生固氮菌生长的影响。[结果]草甘膦异丙胺盐对自生固氮菌生长有促进作用；甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对自生固氮菌有较小的抑制作用，并且该农药自身不稳定，易被分解；咪锰·多菌灵对固氮菌有强烈抑制作用。[结论]试验结果为田间正确使用农药提供了理论依据。

自生固氮菌；抑菌圈；农药；抗性

自20世纪90年代以后，农业高产主要依靠大量使用农药、化肥，致使我国成为世界污染大国。农药的使用致使土壤中的固氮菌生长受到抑制，造成土壤肥力下降，使得人们不得不继续增加化肥的使用量来提高农作物产量，恶性循环使绿色食品离人们越来越远。应用现代科学技术，建立和完善生物固氮体系已经成为解决人类目前所面临的人口、粮食、能源和环境等问题的重要措施[1-6]。

固氮菌在自然界分布十分广泛，可以固定空气中的游离氮转变为生物可以利用的氮元素[7-10]。固氮反应是地球上维持生产的一个重要的生态反应。研究固氮菌对农药是否有一定的抗药性(耐药性)及农药对自生固氮菌是否有影响，已是迫在眉睫的问题[11-16]。为此，笔者将不同地点的土样在无氮培养基上进行分离和纯化，同时采用抑菌圈法和分光光度计测吸光值的方法，检测了常用的不同种类田间农药对自生固氮菌生长的影响及自生固氮菌对农药的抗性，以期为田间正确使用农药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试剂与药剂。95%乙醇、葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸钙、氯化钠、碳酸钙、琼脂粉、结晶紫、碘、碘化钾、番红均为分析纯；草甘膦异丙胺盐水剂(上海惠光环境科技有限公司)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐乳油(湖北巨胜科技有限公司)、咪锰·多菌灵可湿性粉剂(吉林长春长双农药有限公司)。

1.1.2仪器。XSP-BM-8C型显微镜(上海上光仪器有限公司)、HPX-9162 MBE数显电热培养箱(上海波徐实业有限公司医疗设备厂)、SW-CJ-2F超双人双面净化工作台(江苏苏州净化设备有限公司)、BL-50A立式压力灭菌器(上海东亚压力容器制造有限公司)、752型紫外-可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1培养基的配制与自生固氮菌的分离纯化。

1.2.1.1培养基的配制。无氮固体培养基：葡萄糖15.0 g，硫酸镁0.3 g，磷酸二氢钾0.3 g，硫酸钙0.3 g，氯化钠0.2 g，碳酸钙7.5 g，琼脂粉3.0 g，无菌水150 ml，调节pH至6.5～7.0，灭菌备用[17-18]。使用时加入相应浓度的农药。液体培养基：上述配方不加琼脂粉。上述成分在0.1 MPa、121 ℃下灭菌20 min，冷却后再加葡萄糖。

1.2.1.2土壤采集及处理。在树林中铲去表面2 cm表面土，取5～10 cm深层土壤，装入灭过菌的烧杯中，密封保存，采取多点取样，标记取样地点、时间、环境。将土样于4～5 ℃冰箱中保存。

试验时将土样混合均匀，放于28 ℃恒温箱中烘干水分，然后放于纱布中进行过筛。去除土块以及杂物，留下粉状土样。

1.2.1.3固氮菌的分离和纯化。将灭过菌的无氮培养基融化，冷却到50 ℃，倒入无菌培养皿中，凝固后制成平板。将准备好的土样(与无菌水配制成泥浆状)划线接种到制备好的平板中，标明样号、日期。置于28 ℃恒温培养箱中培养、观察。当接种部位长出透明、胶状菌落时，进行纯化，直至出现单菌落为止[19]。

1.2.1.4自生固氮菌革兰氏染色镜检。取对数生长期的菌落进行革兰氏染色[20]，油镜观察染色结果，并用已知菌作对照。

1.2.2农药对自生固氮菌生长的影响。

1.2.2.1自生固氮菌最大吸收波长的测定。用接种环将纯化的自生固氮菌接种于配制好的液体培养基中，28 ℃培养24 h。用紫外-可见分光光度计测其不同浓度的OD值，确定最大吸收波长为600 nm。

1.2.2.2抑菌圈试验。取对数期液体菌种，在预先制作好的固体培养基上进行涂布接种。将直径为1 cm的无菌滤纸浸泡于不同种类的农药中，浸泡无菌水的滤纸片作为空白对照，烘干后放于涂布好的平板中，28 ℃培养48 h后观察记录抑菌圈大小。

1.2.2.3测定3种不同农药对所分离固氮菌生长的影响。取处于对数生长期的液体自生固氮菌菌种1 ml，加入到液体无氮培养基中，分别加入1 ml农药(农药的浓度达到田间施用浓度)，以不加入农药的液体无氮培养基作为空白对照，分别测0、4、6、8、24 h自生固氮菌的OD600 nm并做记录。

2 结果与分析

2.1 菌落形态与革兰氏染色观察

2.1.1菌落形态观察。单个菌落圆形或椭圆形，中间凸起，呈煎蛋状、透明或半透明、乳白色或者乳黄色，表面光滑、湿润、有光泽，有一定黏度，培养48 h后单个菌落直径为1～2 mm，约为小米粒大小。

2.1.2革兰氏染色观察。试验所获得的自生固氮菌，革兰氏染色为阴性，在显微镜下观察为卵形、橄榄球状或杆状，单生或双生(多呈“8”型双生结构)，有时呈不规则堆状(图1)。

2.2 抑菌圈试验结果由表1可知，草甘膦异丙胺盐没有抑菌圈，对自生固氮菌无抑制作用，与空白对照完全相同；而咪锰·多菌灵的抑菌圈直径为13 mm，对固氮菌有较大抑制作用。甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的抑菌圈直径为1 mm，只有在较高浓度时才对自生固氮菌有一定的抑制作用。

表1 各种农药抑菌圈大小

2.3 3种不同农药对所分离固氮菌生长的影响由图2可知，在24 h内培养液中含咪锰·多菌灵的菌体吸光值逐渐下降，由0.061下降到-0.034，说明该药对自生固氮菌有一定的抑制作用。培养液中含有草甘膦异丙胺盐的菌体吸光值在4～6 h内下降，8～24 h内有所升高，但都高于对照组，说明该药对所分离自生固氮菌没有抑制作用，反而有一定的促进作用。这是因为该药为氨基酸类农药，自身吸光值较高；再者它本身可以作为自生固氮菌营养成分的一种，自生固氮菌可以从培养基中直接摄取。培养液中含有甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的菌株吸光值与对照相比略有降低，总体处于上升趋势。原因是甲氨基阿维菌素苯甲酸盐自身不稳定，自生固氮菌将其分解后，对自生固氮菌无抑制作用；再有甲氨基阿维菌素苯甲酸盐是一种高效、广谱的杀虫剂，并不是专一杀菌剂，自生固氮菌易对该类药物产生抗药性。

3 结论

通过抑菌圈试验及分光光度计测定其吸光值检测草甘膦异丙胺盐、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、咪锰·多菌灵3种常用农药对自生固氮菌生长的影响。结果表明，自生固氮菌对不同农药有一定抗性。具体为：草甘膦异丙胺盐对自生固氮菌无抑制作用，反而有一定的促进作用；甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对自生固氮菌有一定的抑制作用，但是抑制作用较小，并且自身不稳定，可以被自生固氮菌分解，所以自生固氮菌对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐有一定的抗药性；咪锰·多菌灵对自生固氮菌有强烈的抑制作用，自生固氮菌对该类农药无抗药性。

试验仅限于自生固氮菌对农药抗性的研究，其他固氮菌未涉及到，今后将对其他固氮菌进行深入研究，以完善相关资料，为我国农业的发展提供一定的理论依据。

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Research on Pesticide Resistance ofAzotobacterin the Soil

QIAO Xiu-li, CHI Cai-xia

(Food and Pharmaceutical Engineering College, Suihua University, Suihua，Heilongjiang 152061)

[Objective] The aim was to understand pesticide resistance ofAzotobacterin the soil. [Method] The pure abiogenousAzotobacterwas isolated through using nitrogen-free medium according to the characteristics ofAzotobacter. The effect of three commonly used pesticides such as Glyphosate isopropylamine salt, Emamectin benzoate and Carbendazim on abiogenousAzotobactergrowth were tested through the inhibition zone andODmeasured by spectrophotometer. [Result] The Glyphosate isopropylamine salt had a promoting effect on abiogenousAzotobactergrowth; Emamectin benzoate had little inhibitory effect, and the pesticide itself was not stable, easy to be broken down; Carbendazim had strong inhibitory effects onAzotobactergrowth. [Conclusion] The results provide theoretical basis for the correct use of pesticides in field.

AbiogenousAzotobacter; Inhibition zone; Pesticide; Resistance

黑龙江省科技特派员农村科技创业项目(111)；绥化学院新农村建设研究项目(SXK120101)。

乔秀丽(1963- )，女，黑龙江绥化人，教授，从事农副产品利用及检测研究。

2015-02-11

S 474+.3

A

0517-6611(2015)09-129-02