一种单克隆多抗体ELISA测定降钙素原方法的建立及其临床价值的探讨

翟栓柱，杨葳，严俊，刘娟娟，郁彭，周泽奇

(1.天津科技大学生物工程学院，天津300457;2.天津市医疗器械技术审评中心，天津300070)

一种单克隆多抗体ELISA测定降钙素原方法的建立及其临床价值的探讨

翟栓柱1，杨葳2，严俊1，刘娟娟1，郁彭1，周泽奇1

(1.天津科技大学生物工程学院，天津300457;2.天津市医疗器械技术审评中心，天津300070)

降钙素原;单克隆抗体;双抗体夹心法;快速检测

自20世纪90年代起，降钙素原(procalcitonin，PCT)作为一种生物标志物逐渐进入临床应用，临床价值越来越被认可。PCT的含量反映了全身性细菌感染的存在和严重程度[1]，同时它的升高或降低直接反映疾病恶化或好转的趋势[2]，也可用于对治疗结果的评价以及指导抗菌药物的使用[3]，对于细菌性感染的标志性高于其他生物标志物。但由于检测方法的不同，试验的敏感性和特异性各不相同，甚至使PCT失去生物标志功能。本研究创新采用单克隆多抗体建立PCT双抗体夹心酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测体系，并初步评价其临床应用价值。

一、材料和方法

1.临床样本样本收集自山东省胸科医院，确定Cut-off值所用200例阴性样本为正常人体检样本，60例阳性样本通过血清学临床检测、血液细菌培养等确认细菌感染，患者年龄为5～60岁，男女性别随机抽取。219例样本通过法国生物梅里埃VIDAS PCT试剂盒检测确定阴阳性，患者年龄为7～72岁，男女性别随机抽取。

2.试剂牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)购自Amresco公司，PCT全长抗原、PCT单克隆抗体、PCT酶标抗体由丹娜(天津)生物科技有限公司提供，酶标板购自天津市优万兴生物技术有限公司。其它试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

3.抗体选择及反应条件优化混合单克隆多抗体预试验的单克隆多抗体，即多种单克隆抗体混合物，比单个单克隆抗体具有更高的检测敏感性，目前拥有针对PCT N端结合位点的多个单克隆抗体以及针对PCT C端结合位点的多个单克隆抗体，并且其已使用辣根过氧化物酶标记。首先，分别配制单克隆多抗体的包被液，然后将其等量混合，在4℃下过夜包被，包被量为200 ng/well，包被液为磷酸盐缓冲液;向每孔加入100 μL PCT抗原梯度稀释液，37℃温育30 min，洗涤拍干，分别加入多个单克隆抗体的酶标抗体，37℃温育30 min，洗涤拍干，加入显色底物溶液，37℃温育15 min，加入2 mol/L硫酸进行终止，然后放入酶标仪进行吸光度(A)450nm读数。根据结果选择验证单克隆抗体的配对效果。

4.双抗体夹心ELISA检测方法的建立根据优化试验结果，选择最优试验条件，将PCT标准品按照10、5、2、1、0.5、0.25 ng/mL浓度配制标准曲线，用最佳包被体系、反应时间体系和酶标抗体工作浓度建立人PCT双抗体夹心ELISA检测方法。以PCT标准品浓度为横坐标，以A450nm值为纵坐标绘制标准曲线。

5.统计学方法采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量数据采用±s表示，以P＜0.01为差异有统计学意义。

二、结果

1.双抗体夹心ELISA检测体系的建立及标准曲线绘制根据试验结果，最优包被缓冲液为磷酸盐缓冲液，最优包被量为200 ng/well，最优包被条件为4℃过夜，最优封闭液为含3%BSA的磷酸盐缓冲液。混合酶标抗体工作浓度为1∶5 000，反应体系为一步法，反应时间10 min，显色时间10 min。根据最优试验条件建立ELISA检测体系，在酶标仪A450nm下读数。以PCT标准品浓度为横坐标，以A450nm值为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线为Y= 0.187 1X+0.025 3，R2=0.999 8。

2.Cut-off值确定根据标准曲线的结果计算检测抗原的浓度，通过检测200名正常人样本，取95%可信区间的抗原浓度值为Cut-off上限:+ 2s=0.12+2×0.06=0.25，通过检测60例阳性患者样本，取95%可信区间的抗原浓度值为Cutoff值下限:-2s=1.75-2×0.63=0.50，抗原的浓度值0.25～0.50 ng/mL之间为疑似患者。

3.敏感性和特异性分析本研发产品检测的样本数量为219例，法国生物梅里埃VIDAS PCT试剂盒检测其中阳性样本73例，阴性样本146例。73例PCT抗原阳性样本中，本研发产品结果有68例为阳性，5例为疑似。146例PCT抗原阴性样本中，本研发产品结果143例为阴性，3例为疑似。见表1。

表1 临床样本PCT检测对比结果

根据计算得到，本研发产品的敏感性为93.2%(68/73)，特异性为97.9%(143/146)。以敏感性为纵坐标，(1-特异性)为横坐标绘制曲线，曲线下面积越大，说明诊断准确性越高。将上述数据进行受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析，得到图1的ROC曲线。ROC曲线下面积达0.991，说明本体系的检测性能优越，有较高准确性。同时，从上述结果我们还可以看到，本研发试剂盒具有更好的检测敏感性、准确度，能够更好地区分患者PCT抗原的阴性、阳性和疑似，从而可为临床提供准确的诊疗依据。

图1 本研发产品检测PCT的ROC曲线

三、讨论

从20世纪90年代起，PCT作为一种新型的诊断细菌感染及其继发合并症的鉴别诊断工具，在脓毒症、脓毒性休克以及严重系统炎症反应等细菌感染类疾病诊断和疗效观察方面具有明显的优势，且特异性高[4]。2001年国际脓毒症会议的脓毒症诊断标准已把PCT作为诊断指标之一[5]。近年来PCT被认为是系统性炎症反应综合征、脓毒症、急性呼吸窘迫综合征等疾病的预警指标[6]。与C反应蛋白、白细胞介素6等传统细菌感染标志物相比，PCT的优势是明显的，特别是在区分细菌感染和非细菌感染方面[7]。在目前国内市场上，生产PCT的厂家很多，采用的方法学也各不相同，测定的敏感性和特异性不同，使PCT真正的临床价值不能得到发挥。法国生物梅里埃VIDAS自动急症检测系统用ELISA荧光标记测定PCT，由于其与参考方法有完全一致的相关性而占据了较大的市场份额。因此，敏感、特异、快速、简单的PCT方法是临床期望的。

本研究的创新点和优势在于采用了混合单克隆多抗体，增强了检测的特异性和敏感性。同时本体系采用一步法温育10 min，显色10 min，在短时间内便能获得高通量的结果。经过验证，与法国生物梅里埃VIDAS PCT试剂盒进行对比试验，敏感性为93.2%，特异性为97.9%，两者检测结果具有良好的一致性。本方法具有良好的依从性，可适于不同规模医疗单位应用。

[1]ASSICOT M，GENDREL D，CARSIN H，et al.High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection[J].Lancet，1993，341(8844): 515-518.

[2]BOUADMA L，LUYT CE，TUBACH F，et al.Use of procalcitonin to reduce patients'exposure to antibiotics in intensive care units(PRORATA trial):a multicentre randomised controlled trial[J].Lancet，2010，375(9713):463-474.

[3]胡可，刘文恩，梁湘辉.降钙素原在细菌感染中临床应用的研究[J].中华医院感染学杂志，2011，21 (1):30-33.

[4]SCHUETZ P，ALBRICH W，MUELLER B.Procalcitonin for diagnosis of infection and guide to antibiotic decisions:past，present and future[J].BMC Med，2011，9:107.

[5]刘慧琳，刘桂花，马青变.降钙素原对急诊脓毒症患者早期诊断的价值[J].中国危重病急救医学，2012，24(5):298-301.

[6]WACKER C，PRKNO A，BRUNKHORST FM，et al.Procalcitonin as a diagnostic marker for sepsis:a systematic review and meta-analysis[J].Lancet Infect Dis，2013，13(5):426-435.

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1673-8640(2015)07-0770-02

R446.61

B

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.07.024

2015-01-14)

(本文编辑:姜敏)

翟栓柱，男，1989年生，硕士，主要从事免疫学研究。