阴沟肠杆菌16S rRNA甲基化酶基因分布

唐翠连，王芳，陈芳军，张文斌

(1.湖南邵阳医学高等专科学校附属医院，湖南邵阳422000;2.湖南邵阳新宁县人民医院，湖南邵阳422000; 3.湖南邵阳武冈市人民医院，湖南邵阳422000;4.湖南邵阳县人民医院，湖南邵阳422000)

阴沟肠杆菌16S rRNA甲基化酶基因分布

唐翠连1，王芳2，陈芳军3，张文斌4

(1.湖南邵阳医学高等专科学校附属医院，湖南邵阳422000;2.湖南邵阳新宁县人民医院，湖南邵阳422000; 3.湖南邵阳武冈市人民医院，湖南邵阳422000;4.湖南邵阳县人民医院，湖南邵阳422000)

目的了解湖南邵阳地区耐氨基糖苷类抗菌药物的阴沟肠杆菌中16S rRNA甲基化酶基因分布特点及其与氨基糖苷类抗菌药物耐药性的关系。方法收集2012年8月至2014年5月邵阳地区新宁县人民医院、武岗市人民医院、邵阳县人民医院和邵阳医学高等专科学校附属医院临床样本中分离的241株阴沟肠杆菌，采用API20E进行菌种鉴定，同时用纸片扩散法进行体外药物敏感性试验。采用聚合酶链反应(PCR)进行armA、npmA、rmtA、rmtB、rmtC和rmtD基因检测，分析耐药基因与耐药表型的关系。结果241株阴沟肠杆菌中200株对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素和奈替米星4种氨基糖苷类抗菌药物耐药，其耐药率分别为41.9%、68.5%、70.1%和63.5%。基因检测结果提示，241株阴沟肠杆菌检出2种16S rRNA甲基化酶基因，分别为armA(96株，39.8%)和rmtB(17株，7.1%)，未检出npmA、rmtA、rmtC和rmtD基因。结论16S rRNA甲基化酶与氨基糖苷类抗菌药物的耐药性有相关性。不同地区分离的对氨基糖苷类药物耐药的阴沟肠杆菌菌株携带16S rRNA甲基化酶的基因型有一定差异，湖南邵阳地区阴沟肠杆菌以携带armA基因为主。

阴沟肠杆菌;16S rRNA甲基化酶;耐药性

阴沟肠杆菌是肠杆菌科中具有代表性的细菌之一，近年来在临床其分离率呈现上升趋势，仅次于大肠埃希菌，可从多种类型的标本分离获得，已经成为本地区医院感染的重要病原菌之一。氨基糖苷类药物是具有氨基糖和氨基环醇结构的一类抗菌药物[1]，临床上主要用于治疗包括阴沟肠杆菌在内的敏感革兰阴性杆菌所引起的感染。由于该类抗菌药物的广泛应用，临床上分离出的耐氨基糖苷类抗菌药物的阴沟肠杆菌阳性率不断增加，其主要原因为产氨基糖苷类修饰酶、细菌16S rRNA甲基化酶和氨基糖苷类作用靶位16S rRNA基因突变及核糖体蛋白编码基因突变[2]。本研究侧重分析其他地区已有报道的armA、npmA、rmtA、rmtB、rmtC和rmtD 6种16S rRNA甲基化酶基因在阴沟肠杆菌中的分布。

材料和方法

一、菌株来源

241株来自邵阳地区新宁县人民医院、武岗市人民医院、邵阳县人民医院和邵阳医学高等专科学校附属医院2012年8月至2014年5月临床分离的非重复菌株。质控菌株:大肠埃希菌(ATCC 25922)、肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)。

二、仪器与试剂

聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪(英国HYBAID公司);GDS-8000凝胶成像系统(美国UVP公司)。水解酪蛋白胨培养基、药物敏感性纸片(英国OXOID公司);16S rRNA甲基化酶基因引物(上海生工生物工程技术有限公司);MasterMixPCR扩增试剂(北京天根生化科技有限公司)。

三、细菌鉴定

采用法国生物梅里埃公司生产的API20E对241株细菌进行再次鉴定。

四、体外药物敏感性试验

运用纸片扩散法对庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素和奈替米星进行体外药物敏感性试验。

五、耐药基因检测

1.DNA提取采用蛋白酶K消化法制备DNA扩增模板。

2.16S rRNA甲基化酶基因PCR扩增16S rRNA甲基化酶基因引物序列参照文献[3-4]设计，由上海生工生物工程技术有限公司合成。引物序列见表1。PCR扩增反应体系为25 μL，包括13 μL MIX、7 μL H2O、1 μL上游引物、1 μL下游引物、3 μL DNA模板。PCR扩增条件:95℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸5 min。用英国HYBAID扩增仪扩增，扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，SYBR Green染色，凝胶成像仪观察结果并照相。

3.产物测序及分析对扩增阳性的16S rRNA甲基化酶基因PCR产物经纯化后由上海生工生物工程技术有限公司应用ABI 3700自动序列分析仪进行测序，测序结果登陆网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)进行比对分析。

表1 16S rRNA甲基化酶PCR扩增引物序列

结果

一、药物敏感性试验

241株阴沟肠杆菌中200株对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素和奈替米星4种氨基糖苷类抗菌药物呈现1种或数种不等的耐药，41株对4种氨基糖苷类抗菌药物均敏感。对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、奈替米星4种氨基糖苷类抗菌药物的耐药率分别为41.9%、68.5%、70.1%和63.5%，其中对阿米卡星的耐药率最低。见表2。

表2 241株阴沟肠杆菌对4种氨基糖苷类抗菌药物的耐药性[例(%)]

二、耐药基因检测

241株阴沟肠杆菌中检出2种16S rRNA甲基化酶基因，分别为armA(96株，39.8%)、rmtB (17株，7.1%)，其中有3株同时检出2种基因型。这2种基因的检出或缺失与菌株对氨基糖苷类抗菌药物体外药物敏感性试验结果进行一致性比较，结果见表3。图1、图2分别为部分菌株armA、rmtB基因PCR产物电泳图。

表3 241株阴沟肠杆菌的16S rRNA甲基化酶耐药基因与其对氨基糖苷类抗菌药物的耐药表型相关性比较

图1 armA基因PCR产物电泳图

图2 rmtB基因PCR产物电泳图

讨论

国家的细菌耐药性监测数据显示，阴沟肠杆菌的耐药率逐年上升。深入了解阴沟肠杆菌对抗菌药物的耐药机制对于控制耐药菌株的流行和播散及合理使用抗菌药物具有重要意义。16S rRNA甲基化酶是细菌适应生存环境的一种能力，它能将细菌细胞16S rRNA解码区A位点上的特定核苷酸进行甲基化处理，阻碍氨基糖苷类抗菌药物结合到30S核糖体亚基上，从而导致细菌对该类抗菌药物产生耐药[5]。曾有研究显示该酶能在人和动物之间播散[6]。

本研究发现湖南邵阳地区临床分离的阴沟肠杆菌对氨基糖苷类药物的耐药性较强，对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、奈替米星的耐药率分别为41.9%、68.5%、70.1%和63.5%，应引起临床高度重视。

质粒编码的16S rRNA甲基化酶介导氨基糖苷类抗菌药物耐药，已经在不同地区有所报道。浙江省台州地区研究数据显示16S rRNA甲基化酶基因型流行以rmtB为主[7]，昆明市延安医院产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum betalactamases，ESBLs)革兰阴性肠杆菌中16S rRNA甲基化酶基因的携带率约为10%[8]。而本次研究采用PCR对湖南邵阳地区临床分离的241株阴沟肠杆菌进行16S rRNA甲基化酶基因检测，检出2种16S rRNA甲基化酶基因(armA、rmtB)，以armA(39.8%)耐药基因介导为主。16S rRNA甲基化酶基因的携带对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性有较高的阳性预测值(＞90%)，显然这些耐药基因的存在与该菌对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性密切相关。在本次调查中，多数菌株耐药表型与基因型结果相一致，但也有个别菌株有差异，如有2株armA基因阳性而表型为敏感，1株rmtB基因阳性而表型为敏感，这有待于进一步研究;104株表型耐药而未检出甲基化酶基因，我们分析可能存在其他的耐药机制。相关研究显示，不同地区分离的对氨基糖苷类药物耐药的细菌16S rRNA甲基化酶基因型有一定的差异。本次调查在阴沟肠杆菌中发现armA基因为本地区的首次报道。

[1]孙艳，王沭，邵晓迪，等.头孢拉宗与两种氨基糖苷类抗菌药物联用对11株双产酶阴沟肠杆菌的联合药敏研究[J].中国药物应用与监测，2013，10(2): 75-78.

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[3]YOKOYAMAK，DOIY，YAMANEK，etal.Acquisition of 16S rRNA methylase gene in Pseudomonas aeruginosa[J].Lancet，2003，362(9399):1888-1893.

[4]MA L，LIN CJ，CHEN JH，et al.Widespread dissemination of aminoglycoside resistance genes armA and rmtB in Klebsiella pneumoniae isolates in Taiwan producingCTX-M-typeextended-spectrumbetalactamases[J].Antimicrob Agents Chemother，2009，53(l):104-111.

[5]DOI Y，ARAKAWA Y.16S ribosomal RNA methylation: emerging resistance mechanism against aminoglycosides[J].Clin Infect Dis，2007，45(1):88-94.

[6]陈琳，陈杖榴，刘健华.氨基糖苷类药物耐药新机制——16S rRNA甲基化酶的研究进展[J].中国兽医科学，2006，36(11):935-939.

[7]周勇，张春玲，陈文举，等.16S rRNA甲基化酶在肺炎克雷伯菌中流行情况调查[J].中国预防医学杂志，2013，14(12):933-935.

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Distribution of 16S rRNA methylase gene of Enterobacter cloacae

TANG Cuilian1，WANG Fang2，CHEN Fangjun3，ZHANG Wenbin4.(1.The Affiliated Hospital of Shaoyang Medical College，Hunan Shaoyang 422000，China; 2.The People's Hospital of Xinning County，Hunan Shaoyang 422000，China;3.The People's Hospital of Wugang，Hunan Shaoyang 422000，China;4.The People's Hospital of Shaoyang County，Hunan Shaoyang 422000，China)

ObjectiveTo know the distribution characteristics of 16S rRNA methylase gene of Enterobacter cloacae being resistant to aminoglycoside antibiotics and the relationship between 16S rRNA methylase gene and aminoglycoside drug resistance in Shaoyang，Hunan.MethodsA total of 241 isolates of Enterobacter cloacae were collected from the Affiliated Hospital of Shaoyang Medical College，the People's Hospital of Xinning County，the People's Hospital of Wugang and the People's Hospital of Shaoyang County from August 2012 to May 2014，and were identified by API20E.The drug sensitivity test in vitro was performed by K-B method.The armA，npmA，rmtA，rmtB，rmtC and rmtD genes were determined by polymerase chain reaction(PCR).The relation between drug resistant gene and resistant phenotypes was analyzed.ResultsIn the 241 isolates of Enterobacter cloacae，200 isolotes of them were resistant to aminoglycoside antibiotics，including 41.9%isolates being resistant to amikacin，68.5%to gentamicin，70.1%to tobramycin，and 63.5%to netilmicin.Two kinds of 16S rRNA methylase genes were detected，among which were armA(96 isolates，39.8%)and rmtB(17 isolates，7.1%)，and no npmA，rmtA，rmtC and rmtD genes were detected.Conclusions16S rRNA methylase is closely related with the drug resistance of aminoglycoside antibiotics.Genotypes carried by 16S rRNA methylases are somewhat different in bacterial isolates from different areas，and armA is a main kind of 16S rRNA methylase gene in Shaoyang.

Enterobacter cloacae;16S rRNA methylase;Drug resistance

1673-8640(2015)07-0691-03

R446.5

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.07.006

2014-07-07)

(本文编辑:姜敏)

湖南省教育厅科研项目(12C1219);湖南邵阳市科技局科研项目(J1212)

唐翠连，女，1978年生，学士，副主任技师，主要从事微生物学检验研究。