药物基因组学方程对上海患者华法林抗凝治疗稳定剂量预测准确性的评估

庄文芳，陈燕红，罗瑞萍，吴婧，宣彬彬，曹雅楠，杨莉，盛慧明

(上海交通大学医学院附属同仁医院检验科，上海200335)

药物基因组学方程对上海患者华法林抗凝治疗稳定剂量预测准确性的评估

庄文芳，陈燕红，罗瑞萍，吴婧，宣彬彬，曹雅楠，杨莉，盛慧明

(上海交通大学医学院附属同仁医院检验科，上海200335)

目的在接受华法林抗凝治疗肺栓塞和心颤患者的上海患者人群中，验证华法林药物基因组学稳定剂量预测方程的准确性。方法收集已达华法林稳定剂量的198例患者完整的临床资料，采集每位患者枸橼酸钠抗凝1∶9抗凝的外周血1.8 mL，抽提全血基因组DNA后采用高分辨率溶解曲线法检测其VKORC1-1173C＞T和CYP2C9*2、CYP2C9*3基因型。采用较多使用的符合筛选条件的4个华法林稳定剂量预测模型[包括IWPC模型(基于混合种群构建)、WEN模型(基于中国台湾人群构建)、HUANG模型(基于中国大陆人群构建)及OHNO模型(基于日本人群构建)]。采用绝对误差均值(MAE)和预测百分比2个指标评价并比较各模型预测准确性。结果在4个预测模型中，HUANG、OHNO及WEN 3个预测模型及固定剂量方案计算的MAE＜±1.0 mg/d，理想预测百分比＞40%，其中MAE最低的模型为HUANG模型。理想预测百分比最高的模型为OHNO。结论采用亚洲人群建立的基因导向结合基本临床资料的华法林稳定剂量预测模型可以较好预测服用华法林的部分上海患者的药物剂量，具有一定临床应用价值。

华法林;基因型;药物基因组学;剂量预测模型;CYP2C9;VKORC1

华法林是临床上广泛应用的抗凝剂，可用于治疗房颤、深静脉血栓、肺栓塞和瓣膜移植等的血栓形成[1]，且价格便宜。但是华法林个体药物代谢能力的差异很大，治疗安全范围狭窄，影响其药效的因素又很多，使得华法林个体剂量的变动性很大(0.5～60 mg/d)，存在严重的潜在出血和抗凝不足导致栓塞的风险，使得华法林治疗的管理具有挑战性[2-3]。影响华法林稳定剂量的因素有多种，包括年龄、身高、体重、饮食、疾病状态、合并用药、吸烟、喝酒、遗传因素等。其中遗传因素是导致不同种族以及同一种族不同个体间剂量差异的最主要原因[3]。

为了减少不良反应发生，实现个体化给药目标，全球范围内已经发表了多种华法林稳定剂量预测模型[4-9]，这些模型大多为基于VKORC1和CYP2C9基因型以及一些非遗传因素而构建的多元线性回归方程，可以解释约40%～60%的华法林个体差异。由于对这些模型验证的病例数不多，且未见针对上海人群的验证，而我们的前期研究证明不同地区的人群不仅基因分布不同，其模型进行的外部验证的效果也不同[3]。为此，我们针对上海地区就诊于本院的肺栓塞和心颤患者，且已达到华法林稳定剂量，从已有模型中选取4个华法林稳定剂量预测的典型模型进行预测准确性的验证。

材料和方法

一、研究对象与病例入选标准

2012年5月至2013年2月共收集上海交通大学医学院附属同仁医院服用华法林进行抗凝治疗的肺栓塞和心颤患者198例，其中男100例、女98例，年龄22～89岁，身高130～183 cm，体重38～100 kg。所有患者在服用华法林稳定剂量下，连续监测国际标准化比值(international normal ratio，INR)至少2次，每次监测间隔超过1周，且INR均在目标范围(1.5～3.0)内。

就诊的肺栓塞或心颤患者年龄≥18岁，肝肾功能、血小板计数均正常，稳定抗凝3个月以上，达到华法林稳定剂量，目标INR在1.5～3.0范围内。所有患者均无合并肿瘤或严重出血病史，且无服用胺碘酮等与华法林产生相互作用的药物。所有患者均签署知情同意书。本研究经上海交通大学医学院附属同仁医院伦理委员会批准。

二、临床资料收集

通过查阅病历资料、直接询问、电话咨询等方式收集患者完整的临床资料，包括性别、年龄、身高、体重、合并疾病(高血压、糖尿病、冠心病、心房颤动)以及合并用药情况等。

三、主要仪器及试剂

基因组DNA小量抽提试剂盒(天根生物科技有限公司);Taq DNA聚合酶(Takara大连宝生物公司);SYTO9荧光染料(英骏生物工程有限公司);所有引物均由上海英骏生物工程有限公司合成;Eppendorf基因扩增仪;Rotor-Gene Q荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪(凯杰QIAGEN生物技术有限公司)。

四、方法

1.血标本采集收集入选受试者的静脉血1.8 mL，109 mmol/L枸橼酸钠抗凝，用于检测PTINR值及CYP2C9*2、CYP2C9*3、VKORC 13个SNP位点鉴定。

2.基因组DNA提取及PCR扩增取外周抗凝血2 mL，使用全血基因组DNA小量抽提试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存。CYP2C9*2 (rs1799853)、CYP2C9*3(rs1057910)及VKORC1-1173C＞T(rs9934438)3个SNP位点的PCR引物设计参照文献[3]，见表1。PCR反应体系总体积为20 μL，Premix混合液10 μL;正、反引物均为0.5 μmol/L;基因组DNA 10 ng。PCR采用两步法:95℃预变性3 min;95℃30 s，60℃30 s;72℃延伸1 min;40个循环。

3.高分辨熔解曲线分析PCR结束后，加染料SYTO9绿色荧光核酸染料(invitrogen)进行预杂交(90℃5 s，40℃30 s)，然后从80℃熔解到90℃，温度变化速率为0.1℃/s。应用Rotor Gene 6000 1.7软件进行实时数据检测和分析，依据熔解曲线和熔解峰进行基因分型，野生型和纯合突变型熔解峰为单峰，杂合突变型为双峰。

表1 SNP位点引物序列

4.INR值测定INR测定结果由上海交通大学医学院附属同仁医院血液实验室提供。使用日本东亚CA-7000全自动凝血仪(凝固法)测定。

5.已发表模型的筛选华法林服用剂量的预测模型共有3种不同的内涵[1]:一是稳定剂量预测模型，即最常用的华法林遗传药理学模型;二为起始剂量预测模型;三是稳定剂量的精确模型，即在起始剂量用药后3 d根据INR结果对稳定剂量做出的剂量精确模型。目前，全球范围内已经发表了多种稳定剂量预测模型[4-9]，我们选择了其中经验证适合中国人群的第1种内涵的稳定剂量预测模型的4个公式。非遗传因素为临床上常规采集资料;遗传因素包括VKORC1-1173C＞T (rs9934438)、CYP2C9*2(rs1799853)和CYP2C9 *3(rs1057910)基因型。4个模型中IWPC模型[4]基于混合种群构建，WEN模型[5]基于中国台湾人群构建，HUANG模型[6]基于中国大陆人群构建;OHNO模型[7]基于日本人群(亚洲)构建。各模型特点见表2[9]。

表2 4个典型模型特点列表

五、4个模型的公式

1.IWPC模型IWPC包括9个国家的21个研究小组，提供了用华法林治疗的5 000多例患者的临床和遗传学数据[4]，由此得到的遗传药理学模型预测需要低剂量(≤21 mg/周)或高剂量(≥49 mg/周)治疗的患者，结果显著优于临床模型预测。公式:剂量(mg/d)=5.604 4-0.261 4×年龄+0.008 7×身高(cm)+0.012 8×体重(kg)-0.867 7×VKORC1 A/G-1.697 4×VKORC1 A/A-0.485 4×VKORC1基因型未知-0.521 1×CYP2C9*1/*2-0.935 7× CYP2C9*1/*3-1.061 6×CYP2C9*2/*2-1.920 6×CYP2C9*2/*3-2.331 2×CYP2C9 *3/*3-0.218 8×CYP2C9基因型未知-0.109 2×亚洲人-0.276 0×非洲人-0.103 2 ×未知人种+1.181 6×酶诱导剂-0.550 3×胺碘酮。式中年龄以十进制计算，即1代表10～19岁，2代表20～29岁，3代表30～39岁，依此类推。如果服用卡马西平、苯妥英、利福平等酶诱导剂，就为1，其它则为0。

2.WEN模型中国台湾的WEN等[5]首先根据CYP2C9与VKORC1的基因型制定了华法林的起始剂量，见表3。然后再根据年龄、体表面积(body surface area，BSA)及预测剂量建立了稳定剂量预测模型。公式:剂量(mg/d)=0.432+ 0.769×预测剂量(mg/d)-0.015×年龄(岁)+ 1.125×BSA(m2)。BSA(m2)=0.006 1×身高(cm)+0.012 8×体重(kg)-0.152 9。

表3 华法林起始剂量预测表(中国人群)

3.HUANG模型HUANG等[6]搜集了266例中国患者标本，通过回归分析建立了预测模型。模型公式:剂量(mg/d)=exp[0.727-0.007×年龄(岁)+0.384×BSA+0.403×(VKORC1 6484TC)+0.554×(VKORC1 6484CC)-0.482× (CYP2C9*1/*3)-1.583×(CYP2C9*3/*3)。式中BSA(m2)=0.006 1×身高(cm)+0.012 8×体重(kg)-0.152 9;VKORC1 6484 TC、VKORC1 6484 CC、CYP2C9*1/*3及CYP2C9*3/*3如果存在就乘以1，不存在则乘以0。

4.OHNO模型日本OHNO等[7]搜集了125例患者标本，经统计学分析得到以下模型:剂量(mg/d)=4.248×(VKORC1-1639GG)+ 1.067×(VKORC1-1639GA)-2.416×(CYP2C9 *3/*3)-0.864×(CYP2C9*1/*3)+1.308 ×BSA-0.025×[年龄(岁)]+2.263。式中BSA(m2)=0.006 1×身高(cm)+0.012 8×体重(kg)-0.152 9;VKORC1 6484 TC、VKORC1 6484 CC、CYP2C9*1/*3及CYP2C9*3/*3如果存在就乘以1，不存在则乘以0。

六、模型预测准确性评价指标

将所有入组患者临床和基因型资料输入各个预测模型公式进行计算预测剂量。VKORC1-1639G＞A和VKORC1-1173C＞T几乎完全连锁，因此将VKORC1-1173C＞T基因型结果作为所有公式中VKORC1结果。上海人群CYP2C9*2几乎缺失，因此如果公式里含有CYP2C9*2则计为0。采用2项指标评价各模型预测准确性:(1)绝对误差均值(mean absolute error，MAE)，为预测值减去实际值的均值;(2)决定系数(coefficient of determination，R2)，R为Pearson相关系数，可通过计算预测剂量与临床实际剂量的相关性获得。

为了验证计算公式的临床有效性，采用预测百分比进行计算:

理想预测(%)=(预测剂量介于实际剂量± 20%的患者数)/总患者数×100%。

高估预测(%)=(预测剂量＞实际剂量120%的患者数)/总患者数×100%。

低估预测(%)=(预测剂量＜实际剂量80%的患者数)/总患者数×100%。

如果模型对总体患者理想预测百分比≥40%，则进一步对其进行敏感性分析，即分析该模型对实际低、中、高剂量患者预测准确性。由于本院在临床上常采用加减0.25片(2.5 mg/片)华法林调整剂量，因此将低、高剂量划分阈值设为1.88 mg/d (即0.75片/d)和4.38 mg/d(即1.75片/d)。

七、统计学方法

结果

一、基因型分布

198例患者中VKORC1-1173T＞C位点TT型164例、CT型32例、CC型2例，T等位基因频率为90.9%、C等位基因频率为9.1%，见表4;与已发表的中国人群频率分布一致。CYP2C9*3的野生型*1/*1(AA)183例、杂合突变型*1/*3 (CA)15例、纯合突变型*3/*3(CC)0例，*1等位基因频率为96.2%，*3频率为4.8%，与已发表的中国人群频率分布[6，8]基本一致。χ2检验表明2个基因均符合Hardy-Weiberg平衡。

二、基因型与华法林稳定维持剂量关系

VKORC1-1173TT基因TT型、CT型和CC型患者华法林平均稳定剂量分别为(2.60± 0.90)mg/d、(3.71±1.46)mg/d、4.00 mg/d，3种基因型之间差异均有统计学意义(P＜0.01)。CYP2C9*3基因*1/*1(AA)型和*1/*3 (CA)型患者华法林平均稳定剂量分别为(2.84± 1.12)mg/d和(2.34±0.83)mg/d，2种基因型之间差异有统计学意义(P＜0.05)。见表5。

4个已发表模型及固定剂量方案对198例患者的预测准确性见表5。HUANG、OHNO和WEN 3个模型计算的MAE＜±1.0 mg/d，理想预测百分比＞40%，其MAE分别为0.73、0.74和0.78 mg/d，理想预测百分比分别为41.9%、42.4%和40.9%。大部分模型计算的低估预测百分比＜高估预测百分比，说明这些模型更容易高估稳定剂量。

表4 不同基因型与华法林剂量的关系

表5 各模型预测准确性比较

三、应用实例

患者邵某，男，58岁，身高160 cm，体重61 kg，未服用其它药物，基因型为CYP2C9*3野生型*1 *1(AA)、VKORC1 1173 C＞T，按IWPC模型，年龄为×5(即58岁)，代入身高、体重，基因型中除VKORC1 A/G(与VKORC1 C/T相关)与亚洲人×1外，其余均为×0，结果剂量(mg/d)=5.604 4-0.261 4×5+0.008 7×160+0.012 8×61-0.867 7 ×1-1.697 4×0-0.485 4×0-0.521 1×0-0.935 7×0-1.061 6×0-1.920 6×0-2.331 2×0 -0.218 8×0-0.109 2×1-0.276 0×0-0.103 2×0+1.181 6×0-0.550 3×0=5.493 3 mg。而实际收集的资料表明稳定剂量为5 mg/d，因此高估+0.493 3 mg，＜1 mg，同时测定患者的INR为1.91。

讨论

目前，临床上华法林的给药方案通常是首先给予一定标准剂量(中国患者多为2.5 mg/d或3.0mg/d，欧美患者多为5.0mg/d或10.0 mg/d)，临床医生根据患者定期监测的INR值的情况，增加或减少剂量，直至INR达到靶标(2～3)[8-9]。但在药物剂量调整过程中，患者要反复抽血进行INR监测，而且剂量调整的周期一般较长，患者也会有较高的发生血栓或出血的风险。而目前的研究显示，某些基因的遗传变异是造成个体间华法林维持剂量差异的主要原因[10]。

多项研究[11-10]表明，通过对各种因素的回顾性分析，可以得到华法林维持剂量的数学公式，用来预测个体的华法林剂量，从而减少华法林达到稳定剂量过程的时间及在此过程中可能出现的危险事件。目前已有多篇文献报道[11-12]在临床患者上验证和比较了这些基因导向的预测模型，如有文献[12]将目前报道的12个模型在中国人群中的效果进行了外部验证，其中MAE最低的3个模型分别为GAGE、WEN和OHNO;理想预测百分比最高的3个模型分别为WEN、HUANG和GAGE。敏感性分析显示预测模型对低剂量患者的预测准确性都较差。尽管这些模型具有潜在的应用价值，但是在临床上推广应用这些模型之前，很有必要先验证这些模型对真实患者的预测准确性。在过去的几年中，一些基因导向的华法林稳定剂量给药模型得到了建立及验证。本研究针对上海地区患者人群验证了典型的4种华法林稳定剂量给药模型的准确性。虽然IWPC模型是基于多中心多种族且建模样本最大的一个模型，但其预测的准确性却是4个模型中是最低的，这与以往的部分研究结果有些出入。之前有研究结果显示IWPC模型显示出较好的预测准确性[1，4]。原因可能是虽然其模型建立基于多中心多种族，且纳入样本最大，但另外3个模型的研究对象与本研究中的病患类似，均为基于亚洲人群建立，华法林的稳定剂量较白种人低，因此显示出明显的种族特性。本研究也发现模型本身的R2值(可解释华法林剂量个体差异百分比)与模型的预测准确性无关。本研究理想预测百分比不高，可能原因是:(1)本研究纳入的模型只包含VKORC1-1173C＞T和CYP2C9*3两个基因，其它遗传变异可能也会导致患者需要较低剂量的华法林，如CYP4F2突变等，近些年的研究表明此基因突变的多态性位点对华法林稳定剂量也有一定的影响[13-16]，能够解释一部分华法林稳定剂量的变异;(2)本研究未调查患者具体的饮食情况，上海地域患者可能在日常饮食中与其它地方的饮食习惯不同，可能服用导致INR升高的食物的量不同，如食用绿色蔬菜或富含维生素K饮食的减少会降低维生素K的摄取，从而增加华法林的抗凝效应[17]。本研究结果显示VKORC1-1173TT基因型、CT型和CC型患者之间华法林平均稳定剂量差异均有统计学意义(P＜0.01)，两两比较差异亦有统计学意义(P＜0.05)。CYP2C9*3基因* 1/*1(AA)和*1/*3(CA)患者之间华法林平均稳定剂量差异有统计学意义(P＜0.05)。针对亚洲人群建立的3个稳定剂量预测模型优于IWPC模型，但由于各地人群饮食等生活习惯不同，3个稳定剂量预测模型对于上海人群的预测效果仍然不是十分理想。因此，建立适合于上海人群的华法林稳定剂量预测模型还是有必要的[3]。

综上所述，华法林稳定剂量个体差异受多种遗传因素和非遗传因素影响，基于VKORC1和CYP2C9基因型构建的华法林剂量预测模型可以较好地预测部分患者，具有一定的临床应用价值。但本研究结果显示，此类剂量预测模型对预测人群有一定种族、地域特异性，在临床普遍推广使用这些模型之前，应结合模型性质及患者特征，选择及建立最合适的模型，并且需要进行更多前瞻性的研究检验这些模型。

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Evaluation on the stable dose prediction accuracy of Warfarin anticoagulant therapy by pharmacogenetics among Shanghai patients

ZHUANG Wenfang，CHEN Yanhong，LUO Ruiping，WU Jing，XUAN Binbin，CAO Yanan，YANG Li，SHENG Huiming.(Department of Clinical Laboratory，Tongren Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200335，China)

ObjectiveTo validate the stable dose prediction accuracy of Warfarin anticoagulant therapy by pharmacogenetics among Shanghai patients with pulmonary embolism and heart fibrillation.MethodsThe complete clinical data of 198 patients with stable Warfarin dose were collected.The VKORC1-1173C＞T，CYP2C9*2 and CYP2C9*3 genotypes were detected by polymerase chain reaction-high resolution melting technique after whole blood genomic DNA extraction with peripheral blood 1.8 mL of sodium citrate anticoagulation 1∶9.The 4 prediction algorithms，including IWPC for mixed population，WEN for Chinese Taiwan population，HUANG for Chinese mainland population and OHNO for Japanese，were evaluated and compared by mean absolute error(MAE)and prediction accuracy.ResultsThe MAE of HUANG，OHNO and WEN in 4 prediction algorithms and fixed dose model was＜±1.0 mg/d with ideal prediction percentage＞40%，with the minimum MAE in HUANG.The ideal prediction algorithm with highest percentage was OHNO.ConclusionsThe Warfarin stable dose algorithms by pharmacogenetics for Asian population combined with basic clinical information can predict the dose of Warfarin among Shanghai with clinical application significance.

Warfarin;Genotype;Pharmacogenetics;Dose prediction algorithm;CYP2C9;VKORC1

1673-8640(2015)07-0697-06

R446.11

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.07.008

2014-10-19)

(本文编辑:范基农)

上海市长宁区科委重点项目(CNKW2013Z02)

庄文芳，女，1968年生，学士，副主任技师，主要从事血液学检验工作。

盛慧明，联系电话:021-62909911-1220。