红芪中微量元素与活性成分含量的相关性研究

强正泽，王 燕，李成义，李 硕，王明伟

甘肃中医药大学药学院，兰州 730000

中药红芪为甘肃特产药材之一，入药部位为豆科植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrysHand.-Mazz.的干燥根［1］，甘肃武都米仓山红芪被引为“米仓红芪”，蕴藏量丰富，资源优势待开发。红芪药用历史悠久，中医临床上用于治疗气虚乏力，食少便溏，中气下陷等症。现代药理学研究表明，红芪中毛蕊异黄酮、芒柄花素、多糖等是红芪的活性成分，毛蕊异黄酮具有保护内皮细胞［2］、兴奋雌激素受体［3］等作用，芒柄花素具有抑制家兔小肠平滑肌的收缩［4，5］、保护缺氧损伤的成骨细胞［6］及植物雌激素样［7］等作用，而红芪多糖具有有抑制HepG-2 细胞增殖、防治2 型糖尿病胰岛素抵抗及体外抗氧化能力等作用［8-10］，而学者对中药中微量元素与成分的相关性研究发现，微量元素含量不仅影响某些中药的药性与药效［11，12］，而且直接或间接的干预中药中次生代谢产物的合成［13，14］，同时也影响了某些中药的道地性［15］，已经成为中药质量控制不可或缺的特征参数［16］，因此明确红芪中微量元素含量与活性成分含量之间的相关性，为进一步揭示红芪道地性及药效物质基础提供参考依据。

本研究采用原子吸收光谱法、HPLC、紫外分光光度计法测定了甘肃不同产地板蓝根中12 种微量元素和3 种活性成分的含量，分析了微量元素与活性成分含量之间的相关性，旨在为甘肃红芪资源的综合开发利用提供合理依据。

1 材料与仪器

1.1 样品来源

采集甘肃不同产区的红芪样品70 份，经甘肃中医学院李成义教授鉴定，为豆科植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrysHand.Mazz.的干燥根，经搓条晾晒后冲洗干净晾干，备用。样品来源信息见表1。

表1 红芪样品信息Table 1 Informations of Hedysari Radix samples

1.2 仪器

SOLAAR S-2 型原子吸收光谱仪(SOLAAR S-2)、SB450300 型电热板(湖北英山国营无限电元件厂)、101-2 型电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)、BS 224 型分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。实验所需量瓶等玻璃仪器，使用前均用铬酸洗液浸泡24 h，后用自来水、去离子水冲洗干净，50 ℃烘干备用。Agilent 1200 型高效液相色谱仪(安捷伦公司)，DAD 检测器(美国)、OHAUS Corporation DV SERIES 型电子天平(十万分之一，奥豪斯仪器有限责任公司)、AL 104 型电子天平(万分之一，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)、FW200型高速万能粉碎机(北京科伟永兴仪器有限公司)、KQ-250TDB 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、HHS-4S 型电热恒温水浴锅(上海宜昌仪器纱筛厂)、UV-2600 紫外分光光度计(日本岛津)、220AC 型万用电炉(北京科伟永兴仪器公司)、可调式电热套(北京科伟永兴仪器有限公司)、C 型玻璃仪器气流烘干器(河南省予华仪器有限公司)。

1.3 试剂

标准溶液(浓度1000 μg/mL)均购于国家有色金属及电子材料分析测试中心:Fe GSB 04-1726-20049，批号:153029-1;Cu GSB 04-1725-2004，批号:153040-1;Ca GSB 04-1720-2004，批号:152030-2;Mn GSB 04-1736-2004，批号:152021-2;Zn GSB 62025-90(3001)，批号:07 092978;Mg GSB 04-1726-2004，批号:152033-2;Cd GSB 04-1721-2004，批 号:153008-2;Cr GSB 04-1722-2004，批号:153001-1;Co GSB 04-1723-2004(a)，批号: 153111;Na GSB 04-1738-2004，批号:152034-3;Li GSB 04-17-2004，批号:153002-1;Ni GSB 04-1740-2004，批号:153034-1;K GSB 04-1733-2004，批号:153004-1;高氯酸、浓硝酸均为分析纯;毛蕊异黄酮对照品(购于成都曼思特生物科技有限公司，批号:MUST-13030602，纯度为99 %);芒柄花素对照品(购于成都曼思特生物科技有限公司，批号:MUST-13050801，纯度为99%);D-无水葡萄糖(购于成都曼思特生物科技有限公司，批号:MUST-12122601，纯度≥98%);苯酚(天津市凯通化学试剂有限公司，批号:20091008)、浓硫酸(成都科龙化工试剂厂，批号:2014031901);无水乙醇(天津富宇精细化学试剂厂，批号:20131116)、乙醚、丙酮、甲醇(天津市津东天正精细化学试剂厂，分析纯);乙腈(天津市光复精细化工研究所，色谱纯);磷酸(天津市凯信化学工业有限公司，优级纯);水(娃哈哈纯净水)。

2 实验方法

2.1 微量元素含量测定

2.1.1 样品处理

将70 份不同产地的红芪样品分别用自来水冲洗干净泥土，后用蒸馏水清洗后于60 ℃的恒温干燥箱烘至恒重，用研钵研细。每份样品平行二次，精密称取1.0000 g 粉末于100 mL 烧杯中，准确加入浓硝酸与高氯酸(4∶1，v/v)液20 mL，放置24 h 后于电热板上加热消化处理，使其保持微沸状态，至溶液呈无色透明状，停止加热，冷却后用1%的硝酸定容于50 mL 容量瓶中，备用。空白溶液同样操作。

2.1.2 元素测定条件

钙、钾、锌、锰、钴、锂、铬、镁、铜、铁、钠、镍元素含量测定方法均采用空气-乙炔火焰原子吸收光谱法，各元素测定条件见表2。

表2 元素测定条件Table 2 Determination conditions of trace elements

2.1.3 样品测定

将制备的红芪样品液按2.1.2 项下条件进样，记录各元素的吸光度值，带入标准曲线计算含量。其中钙、钠、钾、镁元素按质量浓度范围分别稀释不同倍数。

2.2 活性成分含量测定

红芪中毛蕊异黄酮、芒柄花素含量测定方法依据文献［17，18］，红芪多糖含量测定方法参考文献［19］。

2.3 数据处理

以70 份红芪样品中12 种微量元素的含量及3种活性成分含量为数据，组建数据矩阵，采用SPSS 13.0 软件对数据进行PERSON 相关性分析和逐步回归分析。

3 实验结果

3.1 方法学考察

3.1.1 标准曲线的绘制

分别取钙、钾、锌、锰、钴、锂、铬、镁、铜、铁、钠、镍的标准储备液2.5 mL 用去离子水定容至50 mL容量瓶中，后分别按表3 所示浓度逐级稀释，按2.2项下条件由低到高进样，记录各金属元素的标准曲线，回归方程、相关系数见表3。在配制镁元素的溶液时，加入5 mL 氯化锶(50 mg/mL)溶液，以消除其它元素的干扰。

表3 各元素标准液浓度回归方程及相关系数Table 3 Regression equation of standard solution concentration and correlation coefficient

3.1.2 精密度试验

分别配制3、4、1.5、2、2、3、2、0.9、5、2、2、5 μg/mL 的钙、钾、锌、锰、钴、锂、铬、镁、铜、铁、钠、镍的标准溶液，按2.1.2 项下条件测定其吸光度值，重复进样6 次，结果各元素吸光度RSD 值分别为1.2%、1.5%、1.2%、0.8%、1.4%、1.1%、0.9%、1.6%、0.4%、1.8%、1.3%、0.7%、0.5%，表明此实验仪器精密度良好。

3.1.3 重复性试验

取武都安化镇米仓山李家庙村红芪栽培样品，平行6 份，按2.1.1 项下方法制备供试品溶液，测定样品中钙、钾、锌、锰、镉、钴、锂、铬、镁、铜、铁、钠元素的含量，结果各元素吸光度RSD 值分别为1.2%、0.6%、1.1%、0.9%、1.5%、1.9%、1.3%、2.4%、1.3%、1.7%、2.6%、1.2%，表明实验方法重复性良好。

3.1.4 稳定性试验

取武都安化镇米仓山李家庙村红芪栽培样品，按2.1.1 项下方法制备供试品溶液，在室温避光条件下，分别于0、8、16、24 h 时进样，钙、钾、锌、锰、镉、钴、锂、铬、镁、铜、铁、钠元素吸光度的RSD 值分别为1.9%、2.4%、1.1%、1.8%、1.5%、1.9%、0.5%、1.4%、2.2%、2.5%、1.6%、2.3%，表明供试品溶液在室温避光条件下24 h 稳定，符合实验要求。

3.1.5 加样回收试验

精密称取武都安化镇米仓山李家庙村红芪栽培样品，平行6 份，分别加入一定浓度的12 种微量元素标准溶液，按2.1.2 条件测定各元素含量，结果见表4。

表4 加样回收实验结果(n=6)Table 4 Results of average recovery test (n=6)

3.2 含量测定

不同产地红芪样品中12 种微量元素含量见表5，由表5 可以看出红芪中Mg、Na、K、Zn、Ca、Fe 元素含量相对于其他元素较为丰富，不同产地红芪中各元素含量高低不同，野生红芪、栽培红芪、商品红芪微量元素含量也存在差异性，各元素含量平均含量高低顺序为Mg ＞Na ＞K ＞Zn ＞Ca ＞Fe ＞Mn ＞Li ＞Cu ＞Co ＞Ni ＞Cr;不同产地红芪样品中三种活性成分含量见表6，分析表6 可得，70 份不同产地、野生、栽培、商品红芪中毛蕊异黄酮、芒柄花素、多糖的含量各不相同，其中毛蕊异黄酮的平均含量为21.9732 μg/g，芒柄花素平均值为214.0117 μg/g，红芪多糖平均值为12.0412%。

3.3 相关性分析

相关性分析结果见表7。结果表明，毛蕊异黄酮与Fe、Mg 元素含量之间存在极显著正相关关系，相关系数分别为0.463、0.477;芒柄花素与Fe、Ca、Ni、Mg 元素含量之间存在极显著正相关关系，相关系数分别为0.314、0.330、0.323、0.331，与K 元素含量之间存在显著正相关关系，相关系数为0.303，而与Cr、Li、Co 元素含量之间存在显著负相关关系，相关系数分别为-0.251、-0.292、-0.301;多糖与Zn元素含量之间存在显著负相关关系，相关系数为-0.239，与Mg 元素含量之间存在极显著负相关关系，相关系数为-0.445。同时相关性结果还显示，红芪中活性成分含量之间也存在相关性，具体表现为毛蕊异黄酮与芒柄花素含量之间存在极显著正相关关系，相关系数为0.769，毛蕊异黄酮与多糖含量之间存在极显著负相关关系，相关系数为-0.358，而芒柄花素与多糖之间存在不显著的负相关关系，系数为-0.193。

3.4 回归分析

逐步回归分析结果:毛蕊异黄酮(Y1)、芒柄花素(Y2)、多糖(Y3)与Mg(X1)，Fe(X2)，Zn(X3)元素具有以下线性关系。

从三个方程可以看出，三个方程均具有统计学意义。其中Mg 元素对毛蕊异黄酮的决定系数为1.909，Fe 元素对毛蕊异黄酮的决定系数为9.115;其中Mg 元素对芒柄花素的决定系数为12.725，Fe元素对芒柄花素的决定系数为58.328;其中Mg 元素对多糖的决定系数为-0.543，Zn 元素对多糖的决定系数为-1.312;此结果与相关性分析的结果基本一致。

表5 不同产地红芪微量元素含量(μg/g)Table 5 The elemental concentrations of Hedysari Radix from different places (μg/g)

表6 不同产地红芪活性成分含量Table 6 The contents of active ingredients in Hedysari Radix from different places

表7 相关性分析结果Table 7 The results of correlation analysis

注:＊＊表示P ＜0.01，* 表示P ＜0.05;MR 代表毛蕊异黄酮，MB 代表芒柄花素，DT 代表多糖。Note:＊＊indicated P ＜0.01，* indicated P ＜0.05;MR:Calycosin;MB:Formononetin;DT:Polysaccharide.

4 结论与讨论

本文测定了红芪中微量元素与活性成分含量，发现野生红芪与栽培红芪在活性成分与微量元素含量上均有不同程度的差别。微量元素与活性成分的相关性及回归分析结果表明，红芪中微量元素含量与活性成分含量之间存在密切的相关关系。毛蕊异黄酮与Fe、Mg 元素含量之间存在极显著正相关关系，说明Fe、Mg 含量的升高可能促进毛蕊异黄酮的累积或合成，Fe 元素为主导元素;芒柄花素与Fe、Ca、Ni、Mg 元素含量之间极显著正相关关系，与K元素含量之间存在显著正相关关系，而与Cr、Li、Co元素含量之间存在显著负相关关系，说明Fe、Ca、Ni、Mg、K 元素含量的升高可能促进芒柄花素的累积或合成，而Cr、Li、Co 元素含量升高可能抑制芒柄花素的累积与合成，其中Fe 元素为主导元素;多糖与Zn 元素含量之间存在显著负相关关系，与Mg 元素含量之间存在极显著负相关关系，说明Zn、Mg 元素含量的升高可能抑制多糖的累积与合成。

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