矮垂头菊乙醇提取物的体外自由基清除活性及其对高原缺氧小鼠的保护作用研究

景临林，马慧萍，樊鹏程，何 蕾，贾正平

兰州军区兰州总医院药剂科 全军高原环境损伤防治重点实验室，兰州 730050

矮垂头菊(Cremanthodium humileMaxim)是菊科垂头菊属的多年生草本植物，生长于海拔2400～5600 m 的高山草甸和碎石区，主要分布于西藏、青海、甘肃和云南等地［1］。传统藏医理论认为矮垂头菊具有清热解毒、祛风除湿的功效［1］。最新研究发现矮垂头菊还具有一定的抗肿瘤活性［2］。课题组前期对多种青藏高原植物筛选发现，矮垂头菊具有一定的抗缺氧活性［3］。本实验拟对矮垂头菊乙醇提取物的总黄酮和总多酚的含量、体外自由基清除活性及其对缺氧小鼠保护作用进行研究，从抗氧化的角度阐明其抗缺氧作用机制，为进一步将其开发成为抗高原缺氧药物提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 药物

矮垂头菊购自青海西宁三江宝商贸有限公司，经兰州大学药学院生药学研究所杨永建教授鉴定为菊科垂头菊属Cremanthodium humileMaxim 的花;干燥的矮垂头菊200 g，粉碎后加入10 倍量70%乙醇浸泡过夜，超声提取1 h，重复三次，合并提取液，过滤，减压浓缩干燥得浸膏30 g，为矮垂头菊乙醇提取物(Ethanol extract ofCremanthodium humile，EECH)。

1.2 动物

清洁级BABL/C 雄性小鼠，体重18～22 g，由兰州军区兰州总医院动物实验科提供，许可证号SYXK(军)2014-0029。

1.3 试剂

乙酰唑胺(100114)购自武汉远城科技发展有限公司，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)购自Sigma 公司;还原型辅酶I(NADH)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、抗坏血酸(VC)、硫代巴比妥酸(TBA)、硝普钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺购自阿拉丁试剂公司;芦丁标准品(100080-200707)、没食子酸标准品(110831-200804)购自中国食品药品检定研究院;其余均为国产分析纯试剂。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4 主要仪器

Spectramax i3 多功能酶标仪(Molecular Devices公司);RE-3000A 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SK3300L 超声清洗器(上海精密仪器仪表有限公司);AE204 型电子天平(美梅特勒-托利多仪器有限公司);UV2800SPC 紫外可见分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，FLYDWC50-IIC 低压低氧动物实验舱(贵州风雷航空军械有限公司)。

2 实验方法

2.1 DPPH 清除实验

向125 μL 不同质量浓度的样品溶液中分别加入125 μL 0.1 mmol/L DPPH 70%乙醇溶液，室温下暗处反应30 min，以70%乙醇溶剂做空白对照，测量其在波长517 nm 处的吸光度Ai。将125 μL 70%乙醇溶液分别与125 μL DPPH 70%乙醇溶液和125 μL 样品溶液混合后，测定其在波长517 nm 处的吸光度，分别计为A0和Aj。按式(1)计算其清除率，并计算其IC50。

2.2 羟自由基清除实验

向500 μL 不同质量浓度样品溶液中依次加入50 μL 28 mmol/L 脱氧核糖(溶于pH=7.0 的0.2 mmol PBS)、50 μL EDTA(1 mmol/L)、50 μL 的FeCl2(1 mmol/L)和50 μL H2O2(1 mmol/L)，最后加入50 μL 抗坏血酸(1 mmol/L)启动反应，37 ℃水浴孵育1 h 后依次加入250 μL 三氯乙酸(10%)和250 μL TBA(0.5%，溶于25 mmol/L 的NaOH 溶液)，沸水中孵育0.5 h，测定532 nm 处吸光度Ai，用500 μL 蒸馏水代替样品溶液，测得吸光度A0，用PBS 代替脱氧核糖测得吸光度Aj。按式(1)计算其清除率，并计算其IC50。

2.3 超氧阴离子清除实验

向100 μL 不同质量浓度的样品溶液中依次加入50 μL NADH(500 μmol/L，溶解于0.2 mol/L pH=7.4 的PBS 中)、50 μL NBT(200 μmol/L)和50 μL PMS(20 μmol/L)。混合均匀后室温下反应8 min，测定其在560 nm 处的吸光度Ai。用100 μL 70%乙醇替代样品，混合后测定其560 nm 处的吸光度A0;用50 μL 水取代PMS，混合后测定其在波长560 nm 处的吸光度Aj。按式(1)计算其清除率，并计算其IC50。

2.4 一氧化氮清除实验

将100 μL 不同浓度的样品溶液与100 μL 的硝普钠(10 mmol/L，溶解在磷酸缓冲液中0.05 mol/L，pH 7.4)混合均匀后，室温下孵育2.5 h，向混合溶液中加入900 μL 蒸馏水和0.5 mL 对氨基苯磺酸(33%，溶解在20% 的乙酸溶液中)，室温放置5 min，最后加入0.5 mL 盐酸萘乙二胺(0.1%，w/v)，室温放置30 min 后，测定540 nm 处的吸光度Ai。用磷酸缓冲液代替硝普钠时测得吸光度Aj，用70%乙醇代替样品溶液时测得吸光度A0。按式(1)计算其清除率，并计算其IC50。

2.5 总黄酮含量测定

将50 μL NaNO2溶液(5%)加入到500 μL 的不同质量浓度的芦丁标准品溶液(0～140 μg/mL)中，混合均匀。室温下静置6 min 后加入50 μL Al(NO3)3溶液(10%)，混匀后再静置6 min，最后加入250 μL NaOH 溶液(4%)，再次混合均匀后静置15 min，测定其在518 nm 处吸光值，每个样品重复三次，取平均值。根据实验结果建立标准曲线。根据芦丁标准曲线，按照相同方法求得样品中总黄酮含量。

2.6 总多酚含量测定

将1 mL Folin-Ciocalteu 试剂分别与100 μL 的不同质量浓度的没食子酸标准品溶液(0～140 μg/mL)充分混合后，加入1 mL Na2CO3溶液(7%)，室温放置5 h，测定其在760 nm 处吸光值，每个样品重复三次，取平均值。根据实验结果建立标准曲线。根据没食子酸标准曲线，按照相同方法求得样品中总酚含量。

2.7 常压密闭缺氧实验

将50 只清洁剂级雄性BABL/C 小鼠随机分成5 组，缺氧模型组、乙酰唑胺组(300 mg/kg)、EECH低、中、高剂量组(125、250、500 mg/kg)，每组10只，连续灌胃给药5 d，最后一次给药60 min 后，将小鼠分别放入250 mL 广口瓶内(瓶内含5 g 钠石灰)，密封瓶口，立即开始计时，待小鼠停止呼吸时记录小鼠存活时间。利用存活时间和延长率评价药物的抗缺氧作用，确定EECH 最佳给药剂量。延长率=(药物组存活时间-缺氧模型组存活时间)/缺氧模型组存活时间。

2.8 低压低氧实验

将24 只SPF 级雄性BABL/C 小鼠随机分成4组，正常组、缺氧模型组、乙酰唑胺组(300 mg/kg)、EECH 高剂量组500 mg/kg，每组6 只。给药方式同2.7。最后一次给药后，除正常组外，将其他3 组置于低压低氧动物实验舱中，以100 m/min 的速度减压至模拟8000 m 海拔高度，并维持低压低氧9 h，随后快速升压至正常气压。立即将小鼠脱臼处死，取大脑和心脏组织，用4 ℃生理盐水制成10%的组织匀浆用于相关生化指标的测定。

2.9 指标检测

MDA 含量、SOD、CAT 和GSH-Px 活性测定按照相应的试剂盒说明书进行。

2.10 统计学处理

3 实验结果

3.1 EECH 对DPPH 清除作用

结果如图1 所示，EECH 对DPPH 自由基的清除作用存在较好的剂量依赖性。在浓度为120 mg/mL 时，其对DPPH 的清除率达到了79.92%，EECH和Vc 的IC50分别为80.90 ± 0.47 和30.39 ± 0.43 μg/mL。以上结果表明，EECH 对DPPH 自由基具有较好清除能力，但是其活性明显弱于Vc。

图2 EECH 对·OH 的清除率Fig.2 Hydroxyl scavenging effect of EECH

3.2 EECH 对羟自由基清除作用

从图2 结果可以看出:随着EECH 浓度的升高，其对·OH 的清除能力逐渐增强，具有明显的剂量依赖性，经计算其IC50为263.54 ± 6.82 μg/mL，显著高于Vc(50.78 ± 2.45 μg/mL)。随着浓度的增加，Vc 对·OH 的清除能力增加缓慢，而EECH 增长迅速，但仍弱于Vc。

图3 EECH 对的清除率Fig.3 Superoxide radical scavenging effect of EECH

3.3 EECH 对超氧阴离子清除作用

结果如图3 所示，当浓度低于200 μg/mL 时，随着浓度的升高，EECH 和Vc 对的清除能力增加迅速，当浓度大于200 μg/mL 时，二者的清除能力增长速度明显放缓，特别是Vc。总的来说，EECH 对的清除能力要高于Vc。其IC50值为291.43 ± 2.45 μg/mL，显著低于Vc 的IC50值(462.81 ± 3.24 μg/mL)。

3.4 EECH 的对NO 的清除能力

图4 EECH 对NO 的清除率Fig.4 Nitric oxide radical scavenging effect

结果如图4 所示，EECH 和Vc 对NO 清除作用与对的清除作用类似，随着浓度的升高，清除能力逐渐增加，但是增长的幅度越来越小。EECH的IC50(285.26 ± 4.45 μg/mL)明显高于Vc(176.33 ± 5.76 μg/mL)，表明其对NO 的清除能力弱于Vc。

3.5 EECH 中总黄酮与总多酚含量

经检测，EECH 中总黄酮的含量高达378.35 ±7.04 mg 芦丁/g 提取物，多酚含量为114.58 ±0.99 mg 没食子酸/g 提取物。

3.6 EECH 对常压密闭缺氧小鼠存活时间的影响

从表1 结果可以看出:缺氧模型组小鼠在250 mL 广口瓶内的存活时间为32.15 ±1.08 min，阳性药乙酰唑胺组可以显著延长存活时间至42.24 ±1.63 min(P＜0.01)，延长率为31.38%。EECH 三组存在明显则剂量依赖性，低剂量组的存活时间略长于模型组，但是低于乙酰唑胺组，中剂量组的存活时间为44.12 ±3.25 min，效果与乙酰唑胺相当，而高剂量组的存活时间达到47.37 ±2.56 min，延长率为47.34%，显著高于缺氧模型组(P＜0.01)和乙酰唑胺组(P＜0.05)。因此，在后续实验中采用高剂量进行相关指标测定。

表1 EECH 对常压密闭缺氧小鼠存活时间的影响(n=10，±s)Table 1 Effects of EECH on the survival time of mice under normobaric hypoxia condition (n=10，±s)

表1 EECH 对常压密闭缺氧小鼠存活时间的影响(n=10，±s)Table 1 Effects of EECH on the survival time of mice under normobaric hypoxia condition (n=10，±s)

注:与模型组相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与乙酰唑胺组相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。Note:Compared with model group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;Compared with Acetazolamide group，#P ＜0.05，##P ＜0.01.

3.7 EECH 对低压低氧小鼠心脑组织中MDA 含量的影响

结果如图5 所示，对所有组别而言，脑组织中MDA 含量显著低于心肌组织。与正常组比较，缺氧模型组小鼠心、脑组织MDA 含量显著升高(P＜0.01)，经乙酰唑胺和EECH 预处理后，缺氧小鼠心、脑组织中MDA 含量显著降低(P＜0.01 或P＜0.05)。

图5 EECH 对低压低氧小鼠心脑组织中MDA 含量的影响(n=6，±s)Fig.5 Effects of EECH on the MDA content in brain and heart of mice under hypobaric hypoxia condition (n=6，±s)

3.8 EECH 对低压低氧小鼠心脑组织中SOD、CAT和GSH-Px 活性的影响

结果如表2 所示，与正常组比较，缺氧模型组小鼠心、脑组织中SOD、CAT 和GSH-Px 活性显著降低(P＜0.01);与模型组比较，经乙酰唑胺和EECH 预处理后，小鼠心、脑组织中SOD、CAT 和GSH-Px 活力均显著升高。但是EECH 的效果显著优于乙酰唑胺。

4 讨论

表2 EECH 对低压低氧小鼠心脑组织中SOD、CAT 和GSH-Px 活性的影响(n=6，±s)Table 2 Effects of EECH on the levels of SOD，CAT，GSH-Px and T-AOC in brain and heart of mice under hypobaric hypoxia condition (n=6，±s)

表2 EECH 对低压低氧小鼠心脑组织中SOD、CAT 和GSH-Px 活性的影响(n=6，±s)Table 2 Effects of EECH on the levels of SOD，CAT，GSH-Px and T-AOC in brain and heart of mice under hypobaric hypoxia condition (n=6，±s)

注:与正常组相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与模型组相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared with normal group，#P ＜0.05，##P ＜0.01;Compared with model group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

矮垂头菊常年生长在低压低氧的环境中，为了抵抗氧化应激，其体内可能含有具有优异抗氧化活性的物质。为了证明上述猜想，本研究首先考察了EECH 对和NO 的清除作用。DPPH 是一种稳定的含氮自由基，其乙醇溶液呈深紫色，自由基清除剂会使其颜色变浅。该法具有操作简便、灵敏度高的特点，已经广泛用于样品，特别是植物提取物样品的抗氧化活性测定［7］。·OH 被认为是ROS 中活性最强的自由基，它能够无选择性的攻击几乎所有生物大分子，造成细胞损伤。研究表明:心血管疾病、肿瘤、糖尿病以及阿尔兹海默病的发生均与·OH 有关［8］。自身活性较弱，但是其能够在体内转化成活性更强的H2O2和·OH［9］。NO 是体内重要的功能分子，发挥着血压调节、神经信号传递、控制血管舒张和松弛平滑肌等众多生理功能。但是NO 还会与反应生成氧化性更强的过氧亚硝酸根离子(ONOO-)，从而导致组织器官氧化损伤［10］。从文中结果可以看出:矮垂头菊乙醇提取物对DPPH、·OH 和NO 的清除能力弱于Vc，但其对的清除能力明显优于Vc。总的来说，EECH 对四种自由基均表现出一定的清除活性，尽管活性弱于Vc，但仍是一种非常有前景的天然抗氧化剂。

黄酮和多酚是植物体内含有的非常重要的次生代谢产物，也是许多植物提取物抗氧化作用的物质基础［11］。通过对EECH 的总黄酮和总多酚的含量进行测定，结果表明:其高浓度的总黄酮可能其发挥抗氧化作用的物质基础。

尽管低压低氧对机体产生损伤的作用机制尚不完全明确，但是自由基代谢紊乱是损伤产生的重要原因之一。有研究指出:通过摄取抗氧化剂，例如维生素E 和乙酰左旋肉碱等能够减轻低压低氧造成的损伤［12，13］。为此，本研究首先利用小鼠常压密闭缺氧实验考察了自由基清除剂EECH 的抗缺氧能力。结果表明:灌胃给药高、中、低剂量的EECH 均能不同程度地延长缺氧小鼠的存活时间，且呈剂量依赖性，其中，EECH 最高剂量组表现出显著优于乙酰唑胺的抗缺氧效果。

大脑和心脏是机体中氧代谢最为活跃的器官，这也造成它们对低压低氧非常敏感［14，15］。为了阐明EECH 对低压低氧小鼠心脑组织的保护作用，本研究对心脑组织中自由基代谢相关生化指标进行了考察。

MDA 是脂质过氧化的最终产物之一，其含量可以反映脂质过氧化的程度［16］。低压低氧会导致小鼠心脑组织中MDA 含量显著升高，经EECH 预处理后，小鼠心脑组织中MDA 含量降低明显，说明EECH 对低压低氧诱导的脂质过氧化有抑制作用。

SOD、CAT 和GSH-Px 是机体内重要的抗氧化酶，被认为是抵抗氧化应激损伤的第一道防线。SOD 可以通过歧化反应将·OH 转化为H2O2。生成的H2O2又可以进一步被CAT 和GSH-Px 清除，三者协同维持机体内自由基代谢的稳态［17］。低压低氧会导致小鼠心脑组织中SOD、CAT 和GSH-Px的活性显著降低，抗氧化系统被破坏，导致自由基代谢紊乱和ROS 大量蓄积。EECH 能够提高低压低氧条件下小鼠心脑组织中抗氧化酶的活性，维持机体内自由基代谢稳态，减少低压低氧诱导的氧化应激损伤。

综上所述，矮垂头菊乙醇提取物表现出优异的体外自由基清除活性，是一种高效的天然抗氧化剂，其含有的高浓度总黄酮，可以作为获得黄酮类化合物的天然来源。体内实验研究表明:矮垂头菊乙醇提取物能够显著延长缺氧小鼠的存活时间，缓解低压低氧对小鼠心脑组织的损伤，其机制可能与维持机体抗氧化酶的活性、调节自由基代谢有关。

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