代谢组学技术及其在茶叶研究中的应用

周琼琼，孙威江，2*

1 福建农林大学园艺学院;2福建农林大学安溪茶学院，福州 350002

随着人类基因组测序工作的完成，生命科学研究跨入了后基因组时代，基因功能的研究逐渐成为热点，随之出现了一系列的“组学”研究，包括研究转录过程的转录组学(transcriptomics)、研究某个生物体系中所有蛋白质及其功能的蛋白质组学(proteomics)及研究代谢产物的变化及代谢途径的代谢组学(metabolomics 或metabonomics)。

1 代谢组学概述

代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后兴起的系统生物学的一个新的分支，是通过考察生物体系受外界刺激或扰动后其代谢产物的变化来研究生物体系代谢途径的一门科学［1，2］。它所关注的是相对分子质量为1000 以下的小分子物质，其任务在于检测和量化生物体内各种代谢物组分与含量及其变化规律，揭示生命现象和过程［3］。它是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标，从而对生物体的代谢产物进行定性定量分析。代谢组学的概念自上世纪90年代提出后便迅速发展，并渗透到科学研究的各个领域，在临床研究、药物研发与毒理安全性评价、天然药物质量控制、食品营养与食品品质鉴别、微生物和植物代谢、功能基因组学等方面蓬勃发展，取得了巨大的进展［4-8］。

代谢组学的研究可追溯到上世纪70年代基于代谢谱的分析(metabolic profiling)，由Hornings 引入这一概念［9，10］，最初代谢轮廓分析的定义为描述与生物体代谢分析相关的代谢物的代谢模式的多组分分析的方法［10］。研究者主要是采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对人体代谢产物如类固醇、有机酸及其生物体液中药物的代谢物进行定性、定量分析及对疾病进行分析和诊断，这种在临床上利用代谢谱分析诊断有关疾病的方法一直沿用至今，开创了对复杂样品进行代谢轮廓分析的先河。80年代，人们开始应用高效液相色谱(HPLC)和核磁共振(NMR)的技术来进行代谢轮廓的分析［2］。90年代后，代谢轮廓分析技术一直平稳发展，研究内容主要集中于药物在体内的代谢、转化等方面，其间Sauter等率先将代谢组分析引入植物系统诊断［11］，这种基于代谢组分析来研究外界因素对生物功能影响的研究思路随即被人们认可。Nicholson［1］研究小组于1999年首先提出代谢组学(metabonomics)的概念，其主要以核磁共振技术研究人或动物在疾病作用下代谢产物的变化情况，应用于疾病的早期诊断和治疗等相关领域，使代谢组学得到了极大的充实。2000年，Fiehn［12］等提出了另一种代谢组学(metabolomics)的概念，全面、定量分析生物体系中所有代谢物，并将其应用于植物学的研究，将生物体的代谢产物和生物基因的功能联系起来，指出每种基因型都具有一种独特的代谢轮廓，代谢组学作为一种分析工具扩展和增强了已存在的功能基因组学的研究力量。至此形成了当前代谢组学的两大主流领域metabonomics 和metabolomics。Metabonomics是评价生物体对病理生理刺激或基因修饰产生的代谢物质的质和量的动态变化的研究，一般以细胞或者动物的体液或组织为研究对象［13］，主要用于药物研究和疾病诊断等领域;Metabolomics 是代谢控制论提升的学科，主要用于植物和微生物领域。现在这两个定义已经模糊化，没有特别的区分［14］。

2 代谢组学的研究技术

代谢组学研究一般包括样品采集和制备、代谢组数据的采集和预处理、多变量数据分析、目标物识别和途径分析等步骤。

2.1 分析技术平台

样品的采集和制备是代谢组学研究的初始步骤，也是最重要的步骤之一。代谢产物通常用水或有机溶剂(如甲醇、石油醚等)提取，经过萃取、层析、亲和色谱等方法以获得水相提取物和有机相提取物，然后运用色谱、色谱-质谱联用或核磁共振等技术检测提取物中代谢物的种类和含量，获得大量多维复杂数据，之后采用化学计量学方法进行数据分析，识别出有显著变化的代谢标志物，从而研究代谢途径和变化规律，阐明生物体的反应机制。由于代谢产物和生物体系的复杂性，至今为止，没有一种能够适合所有代谢产物的分析技术，大多采用联用技术和多个方法的综合分析。色谱-质谱联用技术、毛细管电泳-质谱联用技术、核磁共振(NMR)、红外光谱等分离分析手段及其组合都出现在代谢组学的研究中，其中全球应用最多的代谢组学分析手段为核磁共振(尤其是1H-NMR)和质谱技术［15］。

质谱技术具有较高的灵敏度和广泛的适用性，基于质谱技术的代谢组学研究在药物开发、临床疾病、食品安全、植物学、微生物学、环境监测等领域发挥着重要作用［16］。目前应用最广泛最有效的研究技术是气相色谱-质谱(GC-MS)和液相色谱-质谱(LC-MS)。

就GC-MS 分析技术而言，可将代谢物分为两类:不需要化学衍生的挥发性代谢物和需要化学衍生的非挥发性代谢物。挥发性代谢物一般是热稳定、易挥发的化合物，非挥发性代谢物如氨基酸、脂肪酸等一般是极性强、挥发性低、热稳定性差的化合物需要进行适当的衍生转化为挥发性的物质才能进行分析。GC-MS 的优势在于能够提供较高的分辨率和检测灵敏度，并且有可供参考、比较的标准谱图库，可以方便地得到待分析代谢物的定性结果。

高效液相色谱更适合于高沸点、大分子和热稳定性差的化合物的分离分析，由于已知的化合物大约有70%是不挥发的，因此液相色谱有着广阔的应用空间，与串联质谱的联用更是实现了对复杂基质中结构相似的化合物的分析，大大提高了分辨率和精确测定的能力。随后发展的超高效液相色谱与质谱联用扩展了分析物的覆盖率，可以获得灵敏度比HPLC-MS 大有改善的分离结果，获得更多、质量更好的信息。多维气质和液质联用的发展，对复杂体系中的目标物分析有着突出的优势。因此这两种技术可以检测包括糖类、氨基酸、有机酸、脂肪酸和芳胺，以及大量次级代谢物在内的数百种化学性质不同的化合物［17］，这是其它任何一项技术无法比拟的。

核磁共振技术(NMR)是一种基于具有自旋性质的原子核在核外磁场作用下，吸收射频辐射而产生能级跃迁的谱学技术。生命科学领域中常用的是氢谱(1H NMR)、碳谱(13C NMR)及磷谱(31P NMR)3 种，可用于体液或组织提取液和活体分析两大类，其中以1H NMR 应用最为广泛［18］。NMR 技术能够实现对样品的非破坏性、非选择性分析，不破坏样品的结构和性质，无辐射损伤;可在一定的温度和缓冲液范围内选择实验条件，可以进行实时和动态的监测;样品处理简单，分析速度快［19］。NMR 技术的不足在于灵敏度低、分辨率不高，动态范围有限，很难同时测定生物体系中共存的丰度相差较大的代谢物。但随着近年新发展的魔角旋转技术、多维核磁共振技术以及LC-NMR 联用，使基于NMR 技术的代谢组学研究日趋完善。

2.2 数据分析平台

代谢组学技术对样品进行分析后得到的是大量的、多维的分析数据，需要借助于化学计量学方法进行数据的分析与解释。目前数据分析常用的两类算法是基于寻找模式的非监督方法和有监督方法。

聚类分析(CA)是一种非常实用的多元统计方法，是将类似的样本聚在一起，从而获得分类，不需要事先确定样本的类型归属，没有可供学习利用的训练样本，因此称为非监督学习方法。主要包括主成分分析(PCA)、非线性映射(NLM)和分级聚类法(HCA)等。

有监督的模式识别方法是利用一组已知分类的样本作为训练集，利用计算机获取分类的基本模型，进而利用这一模型对未知样本进行类型判断。常用的方法有K 最邻近法(K-NN)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)、软独立建模分类法(SIMCA)和人工神经元网络(ANN)分析等数据分析方法。近年来，由于支持向量机(SVM)对于数据高维的特点不敏感，因此特别适合于处理样本数量较少而维数很高的生物数据，因此在代谢组学后期数据的判别分析中也应用较多。

3 代谢组学在茶叶研究中的应用

植物代谢组学是代谢组学的一个重要分支。植物代谢组学是对植物的某一组织或细胞在特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析［20］。得益于高通量检测技术的日益成熟和成本的降低，植物代谢组学的应用也从描述单一代谢途径走向与其它组学技术相结合，通过基因组、转录组、蛋白组和代谢组对传统遗传学和生物表型进行直接联系，并将现有的数据库相关联，围绕特定的生物学问题，共同揭示植物生命活动的奥秘。

伴随着茶叶贸易全球化，各区域茶叶消费呈现多元化态势，消费者对茶叶的质量与安全追求日益提高，如何利用新的科学研究方法(如代谢组学、基因组学等)，不断的提高茶叶工艺水平，提高茶叶质量，是现如今茶学科研工作者的重要课题。

3.1 茶树生长发育的研究

不同的栽培管理，不同的生长发育阶段影响茶树本身理化成分的代谢方式，进而改变茶叶的品质。Ku KM［21］等利用代谢组学方法研究了遮荫处理下茶树次级代谢产物的变化以及抗氧化活性的能力。Lee［22，23］等利用1H-NMR 和多元分析研究同一品种不同采摘位置茶叶和茎的化学成分，发现随着茶树叶片生长发育，茶氨酸、咖啡碱和没食子酸水平上升，而儿茶素类、葡萄糖和蔗糖水平下降;茶茎则具有很高的茶氨酸水平和很低的儿茶素类水平，揭示了叶片和茎存在不同的代谢模式，合理利用茶叶和茶茎，可使产品的主要化学成分更加协调合理;同样，利用代谢组学方法探讨了不同气候条件下茶叶代谢产物的变化。郝亚利［24］基于代谢谱手段分析了不同光质处理对茶鲜叶品质形成的影响，监测不同生育期茶鲜叶样品中的氨基酸、儿茶素、生物碱和黄酮组分及其含量的动态变化。杨亦扬［25］等采用基于1H-NMR 的代谢组学非靶标分析与高效液相色谱法进行的定量靶标分析两种方法，比较白天和夜晚所取不同施氮水平的茶树新梢第2 叶的代谢产物差异，探讨代谢组学研究方法应用于茶叶品质成分形成机理研究的可行性。由此说明，生长环境、栽培管理方式对植物的生长代谢是有很大影响的。

3.2 茶树品种及产地溯源

茶叶种类繁多，种质资源丰富，同一产地不同品种或同一品种不同茶地加工的茶叶品质往往会有较大的差异，利用代谢组学分析手段对原料品种、产地等的溯源有利于维护市场秩序，防止以假乱真，促进与茶叶相关的农业文化遗产保护，从而为茶叶的地理标志性保护提供依据。

李万春［20］等采用衍生化GC-MS 方法，对福建省安溪县境内8 个乡镇的铁观音及其它三个乌龙茶品种(黄金桂、本山和毛蟹)进行代谢组学分析研究，通过化学计量学对数据进行处理、建模，确定茶叶的品种及产地，PCA 结果表明安溪县境内不同乡镇的铁观音表型有明显的差异，相邻乡镇的茶叶代谢表型相似，为辨别安溪铁观音真伪奠定了基础。王丽鸳［26，27］等利用多元化学指纹图谱方法对杭州、丽水和新昌三个地区以龙井43、群体种和迎霜品种加工制作的9 类扁形绿茶产品进行判别分析，结果表明同一品种不同产地或同一产地不同品种绿茶样本指纹图谱间存在显著差异;同样，对不同品种、不同产地的武夷岩茶进行了判别分析。成浩［28，29］等研究表明采用化学指纹图谱方法结合判别技术对茶产品的产地属性进行鉴别或验证分析是可行的。周健［30，31］等采用了近红外光谱并结合PCA 和Fisher识别分类法，鉴定成品茶原料品种;之后，同样以近红外光谱分析技术为基础，结合偏最小二乘模型组合分析实现对茶叶原料品种的鉴定与溯源。袁玉伟［32］等利用稳定同位素和矿物多元素检测结合PCA-LDA 法能进行茶叶产地溯源，对福建、山东、浙江等产地的茶叶进行判别，效果较好。Fernández-Cáceres［33］等结合线性判别分析(LDA)、ANN 等化学计量法初步研究了不同产地的绿茶、黑茶、速溶茶中Al、Ca、Ba 等12 种元素的含量差异与产地间的关系。Moreda-Piñeiro［34］等利用电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定来自不同国家茶叶中的微量金属元素与产地土壤中微量元素，结合PCA，CA，LDA 和SIMCA 方法分析元素含量与原产地的相关性，进而判别茶叶产地。Fraser［35］等利用UPLC-MS 结合多元统计分析方法对茶叶的产地、类型进行判别。

3.3 茶叶加工过程在线检测

茶叶原料是茶叶品质的基础，而加工是关键。如今，绝大部分茶叶的加工过程主要依赖于经验丰富的做茶师傅，“看青做青”，没有形成标准化，可复制的加工模式。对此，日本学者Daiki［36］于2011年采用傅立叶变换近红外光谱(FT-NIR)光谱和偏最小二乘(PLS)回归分析，以客观的优化日本蒸青绿茶的加工工艺。赵峰［37］等于2014年尝试采用近红外光谱技术实现对武夷岩茶精制过程的在线检测，分别对武夷岩茶主要品质成分即水分、咖啡因、茶多酚和粗纤维的含量分别建立近红外定量分析模型并检验，满足生产线上对武夷岩茶品质组分快速测定的要求。

3.4 茶类判别分析

不同茶类的快速准确甄别是当前茶叶领域亟待解决的重要课题，也是茶叶国际标准的重要组成部分。

李万春［20］等用衍生化GC-MS 方法还对绿茶、白茶、乌龙茶(铁观音和水仙)和红茶进行代谢组学研究，用主成分分析对数据进行处理，PCA 结果表明不同发酵程度的四种茶叶代谢表型差异显著。蔡健荣［38］等采用近红外光谱结合K 最近邻法(KNN)模式识别方法对茶叶进行识别与分类，正判率高。陈全胜［39］等收集来自全国的红茶、绿茶、乌龙茶等共150 个样品，采集近红外光谱结合SVM 计量方法对三类茶叶分别建模，正判率较高，达到快速判别分析茶类，说明代谢组学方法在茶类判别分析中同样具有应用潜力。

3.5 茶叶等级及质量评价

我国六大茶类品种众多，品质各异，目前茶叶市场上的等级划分存在很大的随意性，等级的判别依然根据国标GB/T 23776 以感官审评为主，主要依靠人的嗅觉、味觉、视觉和触觉等进行茶类等级的快速区分，然而这种评价方法较难实现标准化，审评结果只能相对而论。因此，代谢组学的兴起为茶叶高效率、高精度的等级判别、质量评价提供了一种科学手段。

在茶叶的等级判别方面，日本学者应用代谢组学技术所做的研究较多。日本学者［40］基于1H-NMR技术和多元分析(PCA、PLS)的代谢组学手段对日本绿茶进行质量评价，可分离等级较好和较差的绿茶，鉴定出滋味标记化合物。Tatsuhiko［41］等通过使用傅里叶变换近红外光谱(FT-NIR)和代谢组学技术在线预测绿茶的质量，指出5500—5200 cm-1的波长范围与茶叶品质有很高的相关性。同样，Pongsuwan［42-44］等分别研究了利用不同的代谢组学手段评估茶叶质量:采用GC-MS 和多变量数据分析结合评估绿茶的品质;采用热裂解气相色谱/质谱法(PRGC/MS)来评估日本绿茶的质量，这种技术不需要制备样品或者衍生，快速、简单、成本低;利用UPLC/TOF-MS 结合化学计量学方法分析绿茶中的代谢物和其质量的关联性，指出除了没食子儿茶素，其它主要的儿茶素(包括表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯)是日本煎茶高等级的显著标志物。中国学者Lin［45］等采用顶空固相微萃取(HS-SPME)和GC-MS技术分析龙井茶的香气成分，建立模型，从而最终预测绿茶质量。然而，茶叶的香气成分在感官审评中占的比例为25%～35%，能否通过香气质量来评估茶叶质量，还有待评估，不过这为茶叶等级的判别提供了一种新的研究思路。周小芬［46］等应用近红外光谱分析技术对大佛龙井茶进行品质评价。

3.6 茶叶年份、季节的预测

Xu［47］等利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)结合化学计量学多元方法，建立了区分的沱茶类型(未发酵的，发酵)和预测沱茶年份的模型。Xu［48］等利用代谢组学结合监督模式识别方法预测茶叶生产的季节，即鉴定该茶叶是春茶或夏茶。

4 代谢组学技术在茶叶研究中的应用前景

茶学是一门综合科学涉及到多个学科、多种研究方法，包括生物学、生态学、植物学、遗传学、化学、食品营养学和经济学等。茶叶实现从田间到茶杯，涉及到诸多复杂的代谢产物的变化，影响茶叶最终质量和品质的因素众多，如何把茶叶从品种选育、栽培、加工到最终产品作为一个整体，对其进行研究，是茶学发展的一个重要课题。代谢组学将茶叶原料质量与安全的控制、栽培管理、工艺优化、品质评价等指标整合，进行代谢产物研究，是一种行之有效的研究方法并在茶叶的研究方面可发挥巨大的作用。

代谢组学概念自提出到应用至今已有将近20年的时间，发展之迅速，应用之广泛。由于代谢组处于系统生物学信息流的底端，是基因表达的最终产物，通过对生物代谢物的分析，能全面了解生物体在当前生理阶段或外界刺激下的真实反应，从而更直观的揭示生物体的遗传背景和环境条件对生物体的决定作用。在茶学科研领域，关联茶叶品质的生物标志物的获取仅仅是代谢组学研究的初级目标，如何将代谢组学的数据库与其他组学(基因组学、转录组学和蛋白质组学)的数据进行整合及构建代谢网络和代谢通路的动态变化规律是研究的最终目的。目前茶叶在代谢组学与其他组学结合的研究方面还相对薄弱，今后应充分利用代谢组学为我们提供的大量植物生化表型的特征信息，通过代谢组学技术促进植物基因功能组学的研究工作，结合生物技术手段，生物信息学分析，加快茶叶品质改良的进程。因此将多种研究方法和技术手段结合起来，尤其将功能基因组学与代谢组学技术结合，将是研究植物次生代谢网络的一条新途径。

1 Nicholson JK，et al.Metabonomics:understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data.Xenobiotica，1999，29:1181-1189.

2 Xu GW (许国旺)，et al.Recent advances in metabonomics.Acta Acad Med Sin(中国医学科学院学报)，2008，29:701-711.

3 Tang HR，Wang YL.Metabonomics:a revolution in progress.Prog Biochem Biophys，2006，33:401-407.

4 Wang TJ，et al.Metabolite profiles and the risk of developing diabetes.Nat Med，2011，17:448-453.

5 Cramer GR，et al.Water and salinity stress in grapevines:early and late changes in transcript and metabolite profiles.Funct integr genomic，2007，7:111-134.

6 Chen C，et al.LC-MS-based metabolomics in drug metabolism.Drug Metab Rev，2007，39:581-597.

7 Van Doorn M，et al.Evaluation of metabolite profiles as biomarkers for the pharmacological effects of thiazolidinediones in Type 2 diabetes mellitus patients and healthy volunteers.Brit J Clin Pharmacol，2007，63:562-574.

8 Christy AA，et al.The detection and quantification of adulteration in olive oil by near-infrared spectroscopy and chemometrics.Anal Sci，2004，20:935-940.

9 Horning EC，Horning MG.Human metabolic profiles obtained by GC and GC/MS.J Chromatogr Sci，1971，9:129-140.

10 Horning EC，Horning MG.Metabolic profiles:gas-phase methods for analysis of metabolites.Clin Chem，1971，17:802-809.

11 Sauter H，et al.Metabolic profiling of plants-a new diagnostic technique.Synthesis Chem Agrochem，1991，24:288-299.

12 Fiehn O，et al.Metabolite profiling for plant functional genomics.Nat Biotechnol，2000，18:1157-1161.

13 Yang J (杨军)，et al.Metabonomics and its applications.Chin J Biotech(生物工程学报)，2005，21:1-5.

14 Lindon JC，et al.The handbook of metabonomics and metabolomics.Kidlington:Elsevier Press，2011.517-532.

15 Theodoridis GA，et al.Liquid chromatography-mass spectrometry based global metabolite profiling:a review.Anal Chim Acta，2012，711:7-16.

16 Gika HG，et al.Current practice of liquid chromatographymass spectrometry in metabolomics and metabonomics.J Pharm Biomed，2014，87:12-25.

17 Zhou QX (周秋香)，et al.Advances in metabonomics and its applications.Biotech Bull(生物技术通报)，2013，1:009.

18 Solanky KS，et al.Application of biofluid1H nuclear magnetic resonance-based metabonomic techniques for the analysis of the biochemical effects of dietary isoflavones on human plasma profile.Anal Biochem，2003，323:197-204.

19 Cao HT (曹红婷).Preparation，storage and experimental conditions of biofluid samples for NMR based metabonomics.Xiamen:Xiamen University (厦门大学)，MSc.2009.

20 Li WC(李万春).Application of GC-MS in determinating different tea quality.Nanjing:Nanjing University of Science and Technology (南京理工大学)，MSc.2012.

21 Ku KM，et al.Metabolomics analysis reveals the compositional differences of shade grown tea (Camellia sinensisL.).J Agric Food Chem，2009，58:418-426.

22 Lee JE，et al.Metabolic dependence of green tea on plucking positions revisited:A metabolomic study.J Agric Food Chem，2011，59:10579-10585.

23 Lee JE，et al.Geographical and climatic dependencies of green tea (Camellia sinensis)metabolites:a1H NMR-based metabolomics study.J Agric Food Chem，2010，(58):10582-10589.

24 Hao YL (郝亚利).Metabolic profiling reveals the effects of different light qualities on the quality formation of fresh tea(Camellia sinensis)leaves.Hefei:Anhui Agriculture University (安徽农业大学)，MSc.2010.

25 Yang YY (杨亦扬)，et al.Metabonomic analysis on the effects of different Nitrogen application rates and light/dark change on metabolism in tea leaves.J Tea Sci(茶叶科学)，2013，33:491-499.

26 Wang LY (王丽鸳)，et al.Discriminant classification of Wuyi Yan tea based on multiple chemical fingerprint.J Tea Sci(茶叶科学)，2010，30(2):83-88.

27 Wang LY (王丽鸳)，et al.A preliminary attempt to establish the digital multiple chemical fingerprints of green Tea.J Tea Sci(茶叶科学)，2007，27:335-342.

28 Cheng H (成浩)，et al.Discriminant classification of green tea’s raw material cultivar based on multiple chemical fingerprint.Sci Agric Sin(中国农业科学)，2008.41:2413-2418.

29 Cheng H (成浩)，et al.Discriminant classification of production area of flatten-shaped green tea based on multiple chemical fingerprint.J Tea Sci(茶叶科学)，2008，28(2):83-88.

30 Zhou J (周健)，et al.Recognition for raw material cultivar of manufactured tea with fisher discriminant classification with principal components analysis.Acta Optica Sin(光学学报)2009，29:1117-1121.

31 Zhou J (周健)，et al.Study on identification and traceability of tea material cultivar by combined analysis of multi-partial least squares models based on near infrared spectroscopy.Spectrosc Spect Anal(光谱学与光谱分析)，2010，10:2650-2653.

32 Yang YW (袁玉伟)，et al.Application of PCA-LDA method to determine the geographical origin of tea based on determination of stable isotopes and multi-elements.Acta Agric Nulc Sin(核农学报).2003，27:47-55.

33 Fernández-Cáceres PL，et al.Differentiation of tea (Camellia sinensis)varieties and their geographical origin according to their metal content.J Agric Food chem，2001，49:4775-4779.

34 Moreda-Piñeiro A，et al.The classification of tea according to region of origin using pattern recognition techniques and trace metal data.J Food Compos Anal，2003，16:195-211.

35 Fraser K，et al.Analysis of metabolic markers of tea origin by UHPLC and high resolution mass spectrometry.Food Res Int，2013，53:827-835.

36 Ono D，et al.Application of Fourier transform near-infrared spectroscopy to optimization of green tea steaming process conditions.J Biosci Bioeng，2011，112:247-251.

37 Zhao F (赵峰)，et al.Online quantitative determination of Wuyi Rock tea quality compounds by near infrared spectroscopy.Trans Chin Soc Agr Eng(农业工程学报)，2014.30:269-277.

38 Cai JR (蔡健荣)，et al.Application of near infrared reflectance spectroscopy in identification of different classified tea.J Anhui Agric Sci(安徽农业科学)，2007，35:4083-4084.

39 Chen Q，et al.Feasibility study on identification of green，black and Oolong teas using near-infrared reflectance spectroscopy based on support vector machine (SVM).Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc，2007，66:568-574.

40 Tarachiwin L，et al.1H NMR based metabolic profiling in the evaluation of Japanese green tea quality.J Agric Food Chem，2007，55:9330-9336.

41 Ikeda T，et al.Prediction of Japanese green tea ranking by Fourier transform near-infrared reflectance spectroscopy.J Agric Food Chem，2007，55:9908-9912.

42 Pongsuwan W，et al.Prediction of Japanese green tea ranking by gas chromatography/mass spectrometry-based hydrophilic metabolite fingerprinting.J Agric Food Chem，2007，55:231-236.

43 Pongsuwan W，et al.High-throughput technique for comprehensive analysis of Japanese green tea quality assessment using ultra-performance liquid chromatography with time-offlight mass spectrometry (UPLC/TOF MS).J Agric Food Chem，2008，56:10705-10708.

44 Pongsuwan W，et al.Quality prediction of Japanese green tea using pyrolyzer coupled GC/MS based metabolic fingerprinting.J Agric Food Chem，2008，56:744-750.

45 Lin J，et al.Volatile profile analysis and quality prediction of Longjing tea (Camellia sinensis)by HS-SPME/GC-MS.J Zhejiang Univ Sci B，2012，13:972-980.

46 Zhou XF (周小芬)，et al.Study on quality evaluation of Dafo Longjing tea based on near infrared spectroscopy.Spectrosc Spect Anal(光谱学与光谱分析)，2012，32:2971-2975.

47 Xu L，et al.Predicting the age and type of tuocha tea by fourier transform infrared spectroscopy and chemometric data analysis.J Agric Food Chem，2011，59:10461-10469.

48 Xu W，et al.Discrimination of the production season of Chinese green tea by chemical analysis in combination with supervised pattern recognition.J Agric Food Chem，2012，60:7064-7070.