珍珠菜中黄酮及Megastigmane 类化学成分研究

梁 东，刘彦飞，郝志友，陈若芸，于德泉*

1中国医学科学院北京协和医学院药物研究所 天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050;2广西师范大学化学与药学学院 药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室培育基地，桂林 541004

珍珠菜Lysimachia clethroides Duby 为报春花科珍珠菜属植物，又名红根草、红头绳(江西)、劳伤药(云南)、酸罐罐(陕西)等［1］。全草入药，广泛分布于华北及长江以南各省区，具有清热解毒、活血调经、利水消肿等功效。现代科学研究证明，珍珠菜属主要化学成分为黄酮和三萜皂苷，主要具有细胞毒、抗菌消炎、免疫调节等多种生物活性［2］。为了有效利用这一资源，本课题组对珍珠菜进行了系统的化学成分研究，前期报道了从中分离得到的14 个三萜皂苷［3］、3 个二苯并-α-吡喃酮［4］、17 个有机酸［5］、4个黄酮苷和1 个δ-truxinate 衍生物［6］以及6 个其他类型化合物［7］。本实验从珍珠菜乙醇提取物中分离得到12 个化合物，分别鉴定为山柰酚(1)、槲皮素(2)、cinchonain Ib(3)、芹菜素-6-C-β-D-吡喃木糖基-8-C-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(4)、芹菜素-6，8-二-Cα-L-吡喃阿拉伯糖苷(5)、芹菜素-6-C-α-L-吡喃阿拉伯糖基-8-C-β-D-吡喃木糖苷(6)、芹菜素-6，8-二-Cβ-D-吡喃木糖苷(7)、芹菜素-6-C-β-L-吡喃阿拉伯糖基-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷(8)、芹菜素-6-C-α-L-吡喃阿拉伯糖基-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷(9)、芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖基-8-C-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(10)、blumenol A(11)、(3S，5R，6R，7E，9S)-大柱香波龙-7-烯-3，5，6，9-四醇3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(12)。其中包括3 个黄酮苷元(1～3)、7 个黄酮碳苷(4～10)和2 个megastigmane 类化合物(11～12)，化合物3～8 和11～12 为首次从该属植物中分离得到。体外活性测试结果显示化合物1～12 均没有明显的细胞毒活性(IC50＞10 μM)。

1 仪器与材料

JASCO J-815 型圆二色散光谱仪;INOVA-600、Bruker-500 和Mercury-300 核磁共振仪测定NMR谱;Agilent 1100 系列LC/MSD Trap-SL 型液质联用仪测定ESI-MS;Lumtech 高效液相色谱仪，YMC C-18(250 × 20 mm，5 μm)色谱柱;Gilson 302 型中压色谱仪;反相柱色谱硅胶RP-18(50 μm)为YMC 公司生产;薄层色谱硅胶GF254及柱色谱硅胶(200～300 目)为青岛海洋化工厂生产;葡聚糖凝胶Sephadex LH-20 为GE Pharmacia 公司生产;所用试剂均为分析纯或色谱纯。

珍珠菜于2009 年9 月采于江西庐山，由九江县森林植物研究所谭策铭研究员鉴定，标本(No.21787)保存于中国医学科学院药物研究所标本室。

2 实验方法

2.1 提取与分离

珍珠菜地上部分10.0 kg，用70%乙醇加热回流提取3 次，合并提取液，减压浓缩得浸膏。将浸膏悬浮于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。乙酸乙酯部分(300 g)经硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮(1∶0～0∶1)、纯甲醇梯度洗脱，得到Frs.A～N 共14 个部分。Fr.H 部分(6.5 g)经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱，以二氯甲烷作为流动相洗脱，得到Frs.H-1～6 共6 个流份。Fr.H-1 经硅胶柱色谱和制备型HPLC，以甲醇-水(40∶60)等度洗脱，得到化合物11(15 mg，tR=45.8 min)。Fr.H-6 经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇(1∶1)作为流动相洗脱得到化合物1(1.5 g)。Fr.K 部分(9.4 g)经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇(1∶1)作为流动相洗脱，得到化合物2(0.8 g)。Fr.N 部分(10 g)经中压ODS 柱色谱，以甲醇-水(9∶1～0∶1)作为流动相梯度洗脱，得到Frs.1～30 共30 个流份。Fr.N-8 经制备型HPLC，以乙腈-水(18∶82)等度洗脱(7 mL/min)，得到化合物3(29 mg，tR=35.5 min)。

正丁醇部分(500 g)经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇-水(10∶1∶0.1～1∶1∶0.1)、100%甲醇作为流动相梯度洗脱，得到Frs.A～H 共8 个部分。Fr.D 部分(66 g)经硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇-水，3∶1∶0.1～1∶1∶0.25，100% 甲醇)得到Frs.a～g 共7个部分。Fr.D-e 部分(15 g)经中压ODS 柱色谱，以甲醇-水(9∶1～0∶1)作为流动相梯度洗脱，得到Frs.1～30 共30 个流份。Fr.D-e-6 经Sephadex LH-20凝胶柱色谱和制备型HPLC，以甲醇-水(24∶76)等度洗脱，得到化合物12(19 mg，tR=58.4 min)。Fr.D-e-10 经制备型HPLC，以乙腈-水(16∶84)等度洗脱，得到化合物8(5 mg，tR=43.3 min)。Fr.D-e-11经制备型HPLC，以乙腈-水(19∶81)等度洗脱，得到化合物4(15 mg，tR=32.7 min)、5(40 mg，tR=37.3 min)、7(5 mg，tR=40.7 min)和6(30 mg，tR=51.5 min)。Fr.D-f 部分(30 g)经凝胶Sephadex LH-20(甲醇)柱色谱，Frs.1～3 共3 个流份;Fr.D-f-2(17.4 g)经反复中压ODS 柱色谱和制备型HPLC，以甲醇-水(27∶73)等度洗脱，得到化合物9(34 mg，tR=90.5 min)和10(27 mg，tR=108.7 min)。

2.2 细胞毒活性(MTT 法)

收集生长良好的HT-29、HePG2、BGC-823、A549、A375 等五种肿瘤细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640 培养基配制成1 ×104cell/mL 细胞悬液，于96 孔培养板内接种，每孔100 μL(含1000 个肿瘤细胞)，置37oC，5% CO2温箱内培养24 h 后加药，实验设空白对照，受试样品设3 个浓度(0.1、1、10 μg/mL)，每浓度3 个平行孔，置37oC，5% CO2温箱内培养4 d。弃去培养液，每孔加入MTT 溶液(0.4 mg/mL，RPMI 1640 配制)100 μL，37oC 孵育4 h。弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL，溶解Fomazan 颗粒，轻度振荡后，用550 型酶标仪在检测波长540 nm，参考波长405 nm 下测定OD 值。结果计算:以药物的不同浓度及对细胞的抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出半数抑制浓度(IC50)。

3 实验结果

3.1 化合物结构鉴定

化合物1 黄色无定型粉末，ESI-MS m/z 285［M-H］-。1H NMR (DMSO-d6，300 MHz)δ:8.03(2H，d，J=8.7 Hz，H-2＇，6＇)，6.91 (2H，d，J=8.7 Hz，H-3＇，5＇)，6.43 (1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.18 (1H，d，J=1.8 Hz，H-6)。上述数据与文献［8］一致，故鉴定化合物1 为山柰酚(kaempferol)。

化合物2 黄色无定型粉末，ESI-MS m/z 301［M-H］-。1H NMR (DMSO-d6，300 MHz)δ:7.67(1H，d，J=2.1 Hz，H-2＇)，7.53 (1H，dd，J=8.4，2.1 Hz，H-6＇)，6.91 (2H，d，J=8.4 Hz，H-5＇)，6.39 (1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.18 (1H，d，J=1.8 Hz，H-6)。上述数据与文献［8］一致，故鉴定化合物2 为槲皮素(quercetin)。

化合物3 无色结晶，ESI-MS m/z 453［M +H］+，475［M+Na］+。1H NMR (acetone-d6，500 MHz)δ:7.05 (1H，d，J=1.5 Hz，H-2＇)，6.82(1H，dd，J=8.0，1.5 Hz，H-6＇)，6.78 (1H，d，J=8.0 Hz，H-5＇)，6.64 (1H，d，J=8.0 Hz，H-5″)，6.58 (1H，d，J=2.0 Hz，H-2″)，6.49 (1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6″)，6.24 (1H，s，H-6)，4.90 (1H，s，H-2)，4.56 (1H，dd，J=6.5，1.5 Hz，H-7″)，4.29(1H，m，H-3)，3.10 (1H，dd，J=15.5，6.5 Hz，H-8″)，2.90 (2H，m，H-4)，2.86 (1H，dd，J=15.5，1.5 Hz，H-8″);13C NMR (acetone-d6，125 MHz)δ:168.3 (C-9″)，156.5 (C-5)，153.0 (C-9)，151.7(C-7)，145.7 (C-3″)，145.3 (C-3＇)，145.1 (C-4＇)，144.6 (C-4″)，135.2 (C-1″)，131.8 (C-1＇)，119.0(C-6″)，118.9 (C-6＇)，116.1 (C-5″)，115.6 (C-5＇)，114.8 (C-2＇)，114.6 (C-2″)，105.7 (C-8)，104.7 (C-10)，96.0 (C-6)，79.3 (C-2)，66.0 (C-3)，38.1 (C-8″)，34.8 (C-7″)，29.1 (C-4)。结合其1H NMR，13C NMR 及相关文献［9，10］，确定化合物3为cinchonain Ib。NOESY 谱中，H-7″ (δH4.56)与H-2＇/ H-6＇的空间相关证实了该化合物的相对构型，如图1 所示［11］。在CD 谱(图2)中，在231 nm和283 nm 处有强烈的负Cotton 效应，在256 nm 处有正Cotton 效应，参照文献［10］，进一步确定了化合物3 的绝对构型。

图1 化合物3 的结构Fig.1 Chemical structure of compound 3

图2 化合物3 的CD 谱图Fig.2 The CD spectrum of compound 3

化合物4 淡黄色粉末，ESI-MS m/z 535［M +H］+。1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:8.00 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2＇，6＇)，6.92 (2H，d，J=8.4 Hz，H-3＇，5＇)，6.74 (1H，s，H-3)，4.84 (1H，d，J=9.0 Hz，H-1″＇)，4.59 (1H，d，J=9.6 Hz，H-1″);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)见表1。上述数据与文献［12，13］一致，故鉴定化合物4 为芹菜素-6-C-β-D-吡喃木糖基-8-C-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(apigenin-6-C-β-D-xylopyranosyl-8-C-α-L-arabinopyranoside)。

化合物5 淡黄色粉末，ESI-MS m/z 535［M +H］+。1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:8.13 (2H，d，J=9.0 Hz，H-2＇，6＇)，6.91 (2H，d，J=9.0 Hz，H-3＇，5＇)，6.76 (1H，s，H-3)，4.71 (1H，m，H-1″＇)，4.66 (1H，m，H-1″);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)见表1。上述数据与文献［12］一致，故鉴定化合物5为芹菜素-6，8-二-C-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(apigenin-6，8-di-C-α-L-arabinopyranoside)。

化合物6 淡黄色粉末，ESI-MS m/z 535［M +H］+。1H NMR (DMSO-d6，500 MHz)δ:7.93 (2H，d，J=8.0 Hz，H-2＇，6＇)，6.93 (2H，d，J=8.0 Hz，H-3＇，5＇)，6.82 (1H，s，H-3)，4.70 (2H，d，J=9.0 Hz，H-1″，1″＇);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)见表1。上述数据与文献［12］一致，故鉴定化合物6 为芹菜素-6-C-α-L-吡喃阿拉伯糖基-8-C-β-D-吡喃木糖苷(apigenin-6-C-α-L-arabinopyranosyl-8-C-β-D-xylopyranoside)。

化合物7 淡黄色粉末，ESI-MS m/z 533［MH］-。1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:7.93 (2H，d，J=9.0 Hz，H-2＇，6＇)，6.93 (2H，d，J=9.0 Hz，H-3＇，5＇)，6.76 (1H，s，H-3)，4.79 (1H，d，J=9.6 Hz，H-1″＇)，4.64 (1H，d，J=9.6 Hz，H-1″);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)见表1。上述数据与文献［12，14］一致，故鉴定化合物7 为芹菜素-6，8-二-C-β-D-吡喃木糖苷(apigenin-6，8-di-C-β-D-xylopyranoside)。

化合物8 淡黄色粉末，ESI-MS m/z 563［MH］-。1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:8.00 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2＇，6＇)，6.90 (2H，d，J=8.4 Hz，H-3＇，5＇)，6.73 (1H，s，H-3)，5.29 (1H，br s，H-1″)，4.73 (1H，d，J=10.2 Hz，H-1″＇);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)见表1。上述数据与文献［15，16］一致，故鉴定化合物8 为芹菜素-6-C-β-L-吡喃阿拉伯糖基-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷(apigenin-6-C-β-L-arabinopyranosyl-8-C-β-D-glucopyranoside)。

化合物9 淡黄色粉末，ESI-MS m/z 565［M +H］+。1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:8.02 (2H，d，J=8.7 Hz，H-2＇，6＇)，6.89 (2H，d，J=8.7 Hz，H-3＇，5＇)，6.81 (1H，s，H-3)，4.71 (1H，d，J=9.9 Hz，H-1″)，4.75 (1H，d，J=10.2 Hz，H-1″＇);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)见表1。上述数据与文献［12］一致，故鉴定化合物9 为芹菜素-6-C-α-L-吡喃阿拉伯糖基-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷(apigenin-6-Cα-L-arabinopyranosyl-8-C-β-D-glucopyranoside)。

化合物10 淡黄色粉末，ESI-MS m/z 565［M +H］+。1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:8.04 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2＇，6＇)，6.92 (2H，d，J=8.4 Hz，H-3＇，5＇)，6.73 (1H，s，H-3)，4.78 (1H，m，H-1″＇)，4.72 (1H，m，H-1″);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)见表1。上述数据与文献［12］一致，故鉴定化合物10为芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖基-8-C-α-L-吡喃阿拉伯 糖 苷 (apigenin-6-C-β-D-glucopyranosyl-8-C-α-Larabinopyranoside)。

表1 化合物4-10a 的13C NMR 数据Table 1 13C NMR data of compounds 4-10a

a13C NMR data (δ)were measured in DMSO-d6at 125 MHz for 6 and at 150 MHz for 4-5，7-10.

化合物11 白色结晶(CDCl3)，ESI-MS m/z 449［2M+H］+。1H NMR (CDCl3，300 MHz)δ:5.90(1H，br s，H-4)，5.82 (1H，dd，J=15.9，5.4 Hz，H-8)，5.77 (1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，4.41 (1H，m，H-9)，2.44 (1H，d，J=17.1 Hz，H-2a)，2.23 (1H，d，J=17.1 Hz，H-2b)，1.89 (3H，s，Me-13)，1.29(3H，d，J=6.3 Hz，Me-10)，1.07 (3H，s，Me-11)，1.00 (3H，s，Me-12);13C NMR (CDCl3，75 MHz)δ:41.2 (C-1)，49.6 (C-2)，198.4 (C-3)，126.8 (C-4)，163.3 (C-5)，79.0 (C-6)，135.6 (C-7)，129.0(C-8)，68.1 (C-9)，23.7 (C-10)，24.0 (C-11)，22.9 (C-12)，19.0 (C-13)。上述数据与文献［17］一致，故鉴定化合物11 为blumenol A，为一megastigmane 类型的降倍半萜。

化合物12 白色无定形粉末，ESI-MS m/z 429［M+Na］+。1H NMR (CD3OD，500 MHz)δ:0.79(3H，s，H3-12)，1.09 (3H，s，H3-11)，1.14 (3H，s，H3-13)，1.21 (3H，d，J=6.5 Hz，H3-10)，1.52(1H，dd，J=12.4，1.9 Hz，H-2b)，1.69 (1H，t，J=12.0 Hz，H-2a)，1.71 (1H，dd，J=12.5，11.7 Hz，H-4b)，1.89 (1H，dd，J=12.9，1.9 Hz，H-4a)，3.09 (1H，t，J=8.1 Hz，H-2＇)，3.62 (1H，dd，J=11.9，5.0 Hz，H-6＇b)，3.80 (1H，dd，J=11.9，2.0 Hz，H-6＇a)，4.14 (1H，m，H-3)，4.28 (1H，quint d，J=6.0，1.0 Hz，H-9)，4.35 (1H，d，J=7.8 Hz，H-1＇)，5.73 (1H，dd，J=15.9，6.3 Hz，H-8)，5.99(1H，d，J=15.9 Hz，H-7);13C NMR (CD3OD，125 MHz)δ:40.7 (C-1)，44.5 (C-2)，73.2 (C-3)，42.4(C-4)，77.7 (C-5)，79.1 (C-6)，131.0 (C-7)，136.2 (C-8)，69.5 (C-9)，24.2 (C-10)，27.5 (C-11)，26.2 (C-12)，27.2 (C-13)，102.2 (C-1＇)，75.1(C-2＇)，78.1 (C-3＇)，71.6 (C-4＇)，77.8 (C-5＇)，62.7 (C-6＇)。上述数据与文献［18，19］一致，故鉴定化合物12 为(3S，5R，6R，7E，9S)-大柱香波龙-7-烯-3，5，6，9-四醇3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷{(3S，5R，6R，7E，9S)-megastigman-7-ene-3，5，6，9-tetrol 3-O-β-Dglucopyranoside}。

3.2 化合物1～12 的细胞毒活性

采用MTT 法，测定了化合物1～12 的细胞毒活性。测试结果显示化合物1～12 均没有明显的细胞毒活性(IC50＞10 μM)。

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