内质网应激标志性蛋白Caspase-12在四氯化碳诱导大鼠肝纤维化逆转恢复模型中的作用研究

黄 艳，李晓慧，吴正升，王 欢，汪应红，李海迪，孙仕伟，李 俊

内质网应激标志性蛋白Caspase-12在四氯化碳诱导大鼠肝纤维化逆转恢复模型中的作用研究

黄 艳1，2，李晓慧1，2，吴正升3，王 欢1，2，汪应红1，2，李海迪1，孙仕伟1，李 俊1，2

目的探讨内质网应激（ERS）标志性蛋白天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶12（Caspase-12）在大鼠肝纤维化形成与逆转恢复病程中的作用。方法建立四氯化碳（CCl4）诱导大鼠肝纤维化模型，苏木精－伊红染色和Masson胶原纤维染色观察肝脏病理组织学改变；免疫组化法检测肝组织肝纤维化标志性蛋白α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）以及钙激活蛋白酶（Calpain）的表达；Western blot检测不同时期肝脏组织中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表达变化。结果肝脏病理组织学检测提示肝纤维化逆转恢复模型成功。免疫组化结果显示，与正常组比较，模型组大鼠肝脏组织中α-SMA和Calpain抗原阳性细胞明显增多、着色明显加深，且多分布在肝实质肝细胞区域。逆转恢复期，α-SMA抗原表达阳性细胞与模型组比较逐渐下降。Calpain抗原表达阳性细胞主要分布在肝脏的小叶中央静脉、汇管区、肝窦间隙等部位。Western blot结果显示，模型组肝脏Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白的表达与正常组相比显著升高。与模型组相比，逆转恢复2、4和8周组肝组织Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白的表达降低，但仍高于正常组。结论 ERS标志性蛋白Caspase-12诱导的细胞凋亡存在于大鼠肝纤维化病程中，可能与肝纤维化的发生、发展和恢复逆转密切相关。

肝纤维化；内质网应激；凋亡；Calpain；Caspase-12

内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是继死亡受体活化和线粒体损伤之后第3条介导细胞凋亡的信号转导通路。ERS诱导的3条主要凋亡通路为CHOP／GADD153基因的激活通路、氨基末端蛋白激酶（c-jun NH2-terminal protein kinasec-jun，JNK）激活通路和内质网特有的Caspase-12激活通路。目前研究［1－2］表明多种肝脏疾病的发生与Caspase-12介导的细胞凋亡有关。但Caspase-12介导的细胞凋亡是否存在于肝纤维化的进展、逆转恢复期中，其作用如何尚未有文献报道。该实验建立在四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）诱导的大鼠肝纤维化逆转恢复模型基础上，观察ERS标志性蛋白Caspase-12在CCl4诱导肝纤维化、逆转恢复期中的变化及其可能作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物50只雄性SD大鼠，SPF级，180～220 g，由安徽医科大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂CCl4购自汕头西陇化工厂；细胞组织裂解液RIPA和蛋白酶抑制剂PMSF购自上海碧云天公司；毒胡萝卜素（thapsigargin，TG）、衣霉素（tunicamycin，TN）、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺购自美国Sigma公司；Cleaved-Caspase-3抗体购自美国Cell signaling公司；Cleaved-Caspase-12抗体购自美国Biovision公司；Calpain和β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根酶（horseradish peroxidase，HRP）标记抗兔和抗鼠免疫球蛋白（immunoglobin G，IgG）购自北京中杉金桥公司；ECL化学发光试剂盒购自美国Pierce公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与模型建立 大鼠随机分为正常组、模型组、逆转恢复2周组、逆转恢复4周组和逆转恢复8周组，每组10只。除正常组外，每组大鼠按1 ml／kg皮下注射CCl4溶液（按体积比CCl4：花生油＝1∶1），一周2次，共12周。正常组以相同方法注射等量花生油作对照。模型组、逆转恢复2周组、逆转恢复4周组、逆转恢复8周组分别于造模结束后第0、2、4、8周分批处死大鼠，取肝组织样本迅速冷冻保存。

1.3.2病理学检查 肝组织用10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋，做常规组织切片，苏木精－伊红（HE）染色和Masson胶原纤维染色，镜下观察并比较不同时期组织的病理变化。

1.3.3免疫组化检测肝组织α-SMA和Calpain蛋白表达 大鼠肝组织用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片。采用SP法染色，切片常规脱蜡，加50 μl过氧化酶阻断溶液，室温孵育15 min；PBS冲洗后加0.1%的胰蛋白酶消化20 min，加50 μl非免疫性动物血清，室温下孵育10 min；加50 μl的一抗，4℃孵育过夜，PBS冲洗后加50 μl生物素标记的二抗，室温下孵育30 min；再加50 μl链霉菌抗生素蛋白－过氧化物酶溶液，室温下孵育30 min；DBA显色、苏木精复染、封片观察。

1.3.4Western blot法检测肝组织Calpain、Cleaved-Caspase-12、Cleaved-Caspase-3蛋白表达 取经处理后的肝组织，加500 μl RIPA细胞裂解液、5 μl PMSF于冰上裂解30 min后4℃、12 000 r／min离心30 min。取上清液，用BCA法进行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移法将蛋白转移至PVDF滤膜上。用5%的脱脂牛奶封闭3 h后，与1∶500一抗4℃孵育过夜。再与1∶5 000的HRP标记的IgG室温孵育1 h，ECL显色，Quantity One软件测定分析结果。采用β-actin作为内参照，分别以相应蛋白与β-actin光密度比值表示该蛋白相对表达水平。1.4 统计学处理使用SPSS 13.0软件进行分析，数据以±s表示，采用方差分析检验。

2 结果

2.1 肝组织病理变化HE染色及Masson胶原纤维染色结果显示正常组大鼠肝脏组织结构完整、清晰，肝小叶结构正常，肝细胞排列成肝索状；模型组可见大量胶原纤维沉积于小叶中央静脉、汇管区、肝窦间隙等部位形成纤维间隔及假小叶，并伴有大量脂肪空泡。停止注射CCl4，经2、4、8周，可见大鼠肝脏组织结构中脂肪空泡逐渐减少，纤维间隔逐渐变窄，纤维沉积程度逐渐减轻，提示CCl4诱导大鼠肝纤维化以及逆转恢复模型成功。见图1。

2.2 肝纤维化不同时期肝组织中α-SMA和Calpain蛋白表达 免疫组化法检测α-SMA和Calpain蛋白在肝纤维化大鼠不同时期肝组织中的表达，阳性染色细胞质呈棕黄色颗粒。结果显示正常组大鼠肝脏组织中α-SMA和Calpain抗原阳性表达较少，模型组大鼠肝脏组织中α-SMA和Calpain抗原阳性细胞明显增多、着色明显加深，且多分布在肝实质区域。逆转恢复2、4、8周组中，α-SMA、Calpain抗原表达阳性细胞与模型组比较，随着逆转恢复期时间延长，阳性表达细胞数量及程度逐渐下降，Calpain抗原表达阳性细胞主要分布在肝脏的小叶中央静脉、汇管区、肝窦间隙等部位，与肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）大致位置相同。提示肝纤维化逆转恢复期表达α-SMA的活化的HSCs逐渐减少，肝细胞凋亡减少。见图2。

2.3 Western blot法检测不同时期肝组织中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表达与正常组大鼠肝脏组织相比，模型组大鼠肝脏组织中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表达明显增多；而与模型组相比，肝纤维化逆转恢复2、4、8周组中，Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），见图3。

3 讨论

肝纤维化是多种慢性肝病发展的共同病理基础，其发病机制与肝细胞大量凋亡和静止的HSCs活化增殖，合成大量胶原为主的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积引起［3］。因此，抑制肝细胞坏死凋亡和促进活化的HSCs凋亡，有助于肝纤维化的逆转恢复［4］。

研究［5－7］表明ERS在肝纤维化的进展期抑制HSCs活化，在肝纤维化逆转恢复期促进活化的HSCs凋亡。研究［8］显示HSCs与ERS诱导剂TG或TN体外共培养，CHOP、JNK和Caspase-12的表达明显变化，其可能与逆转恢复期ERS诱导活化HSCs凋亡增加密切相关。

有研究［9－10］表明，当ERS激活时，内质网将储存的Ca2＋释放到细胞胞质中与钙离子结合位点结合，从而激活Calpain。细胞质钙活化蛋白导致的钙外流的刺激，裂解并且激活Caspase-12，启动下游的凋亡路径Caspase-3，发生凋亡蛋白酶级联反应［11－12］。本实验建立CCl4诱导大鼠肝纤维化逆转恢复模型，采用HE染色、Masson胶原纤维染色验证模型成功。免疫组化法检测α-SMA和Calpain蛋白在大鼠肝组织中的表达。结果表明，随着恢复期时间延长，大鼠肝组织中α-SMA和Calpain阳性表达细胞数量及程度逐渐下降提示HSCs活化降低；而Calpain抗原表达阳性细胞主要分布在肝脏的小叶中央静脉、汇管区、肝窦间隙等部位，与HSCs细胞的大致位置相同，提示Ca2＋依赖性Calpain活化可能参与Caspase-12诱导的大鼠HSCs凋亡。Western blot法结果进一步表明，模型组大鼠肝脏组织中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表达较正常组明显增多；而肝纤维化恢复期2、4、8周组中Calpain、Cleaved-Caspase-12和Cleaved-Caspase-3蛋白表达明显降低，与模型组相比差异有统计学意义。结合实验室前期研究结果：模型组Cleaved-Caspase-12表达显著上升，提示Caspase-12诱导的肝细胞凋亡参与肝纤维进展期；在肝纤维化逆转复期，Cleaved-Caspase-12在活化HSCs中表达增强，诱导活化HSCs凋亡增加，但其整体表达水平逐渐下降，提示其诱导的肝细胞凋亡显著降低。本实验结果表明，ERS存在于大鼠肝纤维化病程中，其可能参与肝细胞和HSCs增殖活化、凋亡的调控，与肝纤维化的发生、发展和逆转恢复密切相关。

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Effect of endoplasmic reticulum stress protein caspase-12 in carbon tetrachloride-induced reversible liver fibrosis in rats

Huang Yan1，2，Li Xiaohui1，2，Wu Zhengsheng3，et al
（1School of Pharmacy，2Institute for Liver Diseases，3Dept of Pathology，Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo detect the effect of endoplasmic reticulum stress（ERS）-related protein Caspase-12 in rat liver fibrosis and spontaneous reversal process.MethodsLiver fibrosis model was induced by CCl4in rats，the protein expressions of Calpain and α-SMA were detected by immunohistochemical staining.The protein expressions of Calpain，Cleaved-Caspase-12 and Cleaved-Caspase-3 in liver tissue were measured by Western blot.ResultsImmunohistochemistryResultsshowed that compared with the normal group，α-SMA and calpain antigen-positive cells of rat liver tissue in model group were significantly increased，distributing in liver parenchymal area.Compared with model group，in recovery model，α-SMA antigen-positive cells decreased.Calpain antigen-positive cells were mainly distributed in the liver lobule central vein，portal area，sinusoidal gap and other parts.Western blotResultsshowed that compared with the control group，expressions of Calpain，Cleaved-Caspase-12 and Cleaved-Caspase-3 were significantly enhanced in the model group.Compared with the model group，expressions of Calpain，Cleaved-Caspase-12 and Cleaved-Caspase-3 were decreased in spontaneous recovery after 2，4 and 8 weeks.ConclusionERS-related protein Caspase-12 might be related to the progression and regrossion of liver fibrosis.

liver fibrosis；endoplasmic reticulum stress；apoptosis；Calpain；Caspase-12

R 575.2

1000－1492（2015）02－0140－04

2014－12－12接收

国家自然科学基金资助项目（编号：81102493、30873081）；国家教育部博士点新教师基金资助项目（编号：20103420120001）；安徽医科大学国家级大学生创新创业训练计划项目（编号：201310366030）

安徽医科大学1药学院基础与临床药理教研室、2肝病研究所，合肥 2300323安徽医科大学第一附属医院病理科，合肥230022

黄 艳，女，博士，副教授，硕士生导师；李 俊，男，博士，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：lijun＠ahmu.edu.cn