全反式维甲酸及其衍生物对乳腺癌细胞株MDA-MB-231凋亡的影响

周佳丽，颜蕴文，江巧玲，吴 燕，周 青，汪渊

全反式维甲酸及其衍生物对乳腺癌细胞株MDA-MB-231凋亡的影响

周佳丽，颜蕴文，江巧玲，吴 燕，周 青，汪渊

目的研究全反式维甲酸（ATRA）及其衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯（ATPR）对人乳腺癌细胞MDAMB-231体外凋亡的影响。方法 不同浓度ATRA及其衍生物ATPR分别处理MDA-MB-231细胞48 h后，Hoechst染色及流式细胞术检测细胞凋亡的变化，RT-PCR检测凋亡蛋白Caspase-3 mRNA水平的变化，Western blot法检测相关凋亡蛋白表达水平的变化。结果与ATRA相比，相同浓度的ATPR能明显促进MDA-MB-231细胞的凋亡，随着浓度的增加，凋亡作用越加显著（P＜0.05）。RT-PCR显示ATPR作用后Caspase-3 mRNA水平显著上调（P＜0.05）。Western blot法显示ATPR能下调抗凋亡蛋白Bcl-2、NF-κB、survivin的表达（P＜0.05），上调促凋亡蛋白Bax、Grim-19、Caspase-3的表达（P＜0.05）。结论ATPR比ATRA更明显地促进人乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡。

乳腺癌；MDA-MB-231；ATPR；凋亡

全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）是维生素A（视黄醇、视黄醛、视黄酸）的活性代谢物［1］，对维持机体正常生长发育以及生理活动是必不可少的，同时也具有重要的临床应用价值。ATRA现已用于治疗各种肿瘤如急性粒细胞白血病、卡波氏肉瘤、卵巢癌、神经母细胞瘤等，此外还具有抗血管生成和抗炎作用［2］。但是ATRA在治疗中也会产生一定的副作用，如皮肤损伤、血脂异常、甲减、头痛、维甲酸综合征等［3］。因此研发高效低毒的维甲酸衍生物已成为当今的研究热点。4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯（4-amino-2-trifluoromethylphenyl ester，ATPR）是本校新合成的维甲酸衍生物，研究［4］已表明ATPR能有效抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖和迁移。该研究旨在探究ATPR对乳腺癌细胞株MDA-MB-231凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料ATRA购于美国Sigma公司，ATPR由安徽医科大学药学院提供，均用DMSO配制成40 mmol／L的母液，分装后避光保存于－20℃冰箱；高糖DMEM购于美国Gibco公司；胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司；Hoechst凋亡试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；Annexin V Apoptosis Detection Kit FITC试剂盒购于美国eBioscience公司；RT-PCR试剂盒购于美国Fermentas公司；引物及内参由上海生工生物工程公司合成；鼠抗人Bax、Grim-19、Bcl-2、Caspase-3、β-actin、兔抗人NF-κB、羊抗人survivin均购于美国Santa Cruz公司；其余二抗均购于北京中杉金桥生物技术有限公司；BCA定量试剂盒和ECL显色试剂盒均购于美国Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 人乳腺癌细胞MDA-MB-231购于美国ATCC公司，由本实验室保存。MDA-MB-231用含有10%胎牛血清、100 U／ml链霉素、100 μg／ml青霉素的高糖DMEM培养在37℃含5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中，当细胞密度为90%～95%并处于对数生长期时，用0.25%的胰酶消化传代。

1.2.2 Hoechst染色将处于对数生长期的MDAMB-231接种于含有灭菌盖玻片的6孔板内，细胞密度调整为4×104个／孔，次日用20、40 μmol／L的ATRA和ATPR处理细胞，并设细胞对照组，37℃培养48 h后小心取出盖玻片于载玻片上，加固定液固定20 min，PBS洗3遍，加入Hoechst染色液染色5 min，再用PBS洗3遍，荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察细胞核形态并拍照。

1.2.3流式细胞术检测 收集处于对数生长期的MDA-MB-231，接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。待细胞贴壁后弃去培养液，用20、40 μmol／L ATRA和ATPR处理细胞，并设细胞对照组，处理48 h后常规消化收集各组细胞于1.5 ml的EP管中。2 000 r／min离心5 min，预冷PBS洗3次后100 μl Binding buffer充分吹打重悬，调整细胞数量为1×105个，取5 μl AnnexinVFITC加入细胞悬液中，混匀，避光放置15 min后每管加入400 μl Binding buffer和5 μl PI，混匀后流式细胞仪检测，FCS express软件分析结果。

1.2.4RT-PCR检测 提取细胞总RNA并逆转录成cDNA，进行PCR扩增。Caspase-3上游引物：5′-AAATGGACCTGTTGACCTGAA-3′，下游引物：5′-CACAAAGCGACTGGATGAAC-3′，片段大小为272 bp；β-actin上游引物：5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物：5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，片段大小为434 bp。PCR扩增条件：Caspase-3为94℃预变性4 min，94℃变性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸20 s，共循环35次；β-actin为94℃预变性4 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，共循环30次。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后小心取出凝胶于紫外灯下观察并拍照。

1.2.5Western blot法检测 将MDA-MB-231均匀接种于细胞培养瓶中，次日用20、40 μmol／L ATRA和ATPR处理细胞，并设细胞对照组。处理48 h后PBS洗涤3次，每瓶加入200 μl RIPA蛋白提取液（Tris-HCl，pH＝7.14；150 mmol／L NaCl；1 mmol／L EDTA；1%Triton X-100；0.1%SDS；5 mg／ml Leupeptin；1 mmol／L PMSF），冰上放置30 min，刮取细胞，移入1.5 ml的预冷EP管中，反复冻融3次（－80℃、4℃），超速离心机14 000 r／min离心30 min，将上清液吸入另一个1.5 ml EP管中。BCA法测定总蛋白浓度并将所有样本调整成相同浓度，加入4×蛋白上样缓冲液，混匀后煮沸变性，－80℃保存备用。配制12.5%SDS-PAGE，加入等量样本后电泳，电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗（β-actin、BCL-2、Bax、NF-κB、Grim-19、survivin，Caspase-3）4℃孵育过夜，PBS洗涤，二抗室温孵育2 h，洗涤后在暗室内加ECL，覆盖上X线片、显影、定影。底片扫描后采用Quantity One分析灰度值。1.3 统计学处理使用SPSS 16.0软件进行分析，数据以±s表示。组间计量资料使用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 ATRA和ATPR对细胞核形态的影响荧光显微镜下，细胞对照组细胞核为均一卵圆形，呈均匀蓝色荧光；ATPR处理组细胞核大小不一、形态不规则、固缩、致密浓染、部分碎裂成凋亡小体，折光性变强。随着浓度的增高，ATPR处理组凋亡小体明显增多，ATRA处理组也有少许凋亡小体。见图1。

2.2 ATRA和ATPR对细胞凋亡的影响流式细胞术结果显示，细胞对照组，20、40 μmol／L的ATRA和ATPR处理组的早期凋亡率（第四象限）和晚期凋亡率（第一象限）之和分别为12.29%、14.59%、16.41%、21.54%、25.02%。表明随着药物浓度的增加，细胞凋亡率呈上升趋势，且ATPR诱导凋亡的作用比ATRA显著，见图2。

2.3 ATRA和ATPR对Caspase-3 mRNA水平的影响与细胞对照组相比，ATPR处理后Caspase-3 mRNA转录明显增加（F＝20.8，P＜0.05）。但ATRA组与细胞对照组比较差异无统计学意义。见图3。

2.4 ATRA和ATPR对凋亡相关蛋白表达的影响与细胞对照组比较，ATPR组抗凋亡蛋白Bcl-2、NF-κB、survivin表达量降低（P＜0.05），促凋亡蛋白Bax、Grim-19、Caspase-3表达量上升（P＜0.05）。ATPR组比ATRA组促凋亡作用更显著，且ATPR组随着浓度升高，促凋亡作用增加（FBcl-2＝233.7、FBax＝101.4、FGrim-19＝88.2、FNF-κB＝483.5、Fsurvivin＝414.0、FCaspase-3＝74.1，P＜0.05），见图4。

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全球每年发病率正在以2%～3%的速度递增［5］，且发病年龄呈年轻化趋势。虽然ATRA在治疗恶性肿瘤方面发挥重要作用，但对乳腺癌的治疗仍处于临床前研究阶段。研究［6］表明维甲酸与控制乳腺癌细胞增殖、生存和侵袭行为的细胞外因子以及细胞内信号通路存在相互作用，但其临床应用效果不尽如人意。ATPR是ATRA的新型衍生物，由本校药学院改造合成，较ATRA具有更好的稳定性和可溶性。本实验室历年研究表明，ATPR可以抑制肺癌、胃癌、结肠癌以及乳腺癌细胞在体外的增殖和迁移，且效果优于ATRA。

Hoechst染色结果显示20 μmol／L的ATPR处理细胞即可出现明显的凋亡小体，且随着浓度升高凋亡小体占总细胞比例显著增高，而ATRA组凋亡小体明显少于ATPR组。流式细胞术检测结果同样显示ATPR诱导乳腺癌细胞凋亡作用高于ATRA，与Hoechst染色结果相符。

细胞凋亡亦称细胞程序性死亡，是一种主动死亡过程，受多种细胞内基因及细胞外因子调控。Bcl-2蛋白家族是重要的细胞凋亡调节因子，其中抗凋亡蛋白有Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等，促凋亡蛋白有Bax、Bak、Bok等［7］。当细胞受到凋亡信号刺激，Bax／Bak聚合物易位至线粒体膜，能在线粒体上形成孔道，使一些线粒体内膜间隙蛋白如细胞色素C释放，进而启动Caspase级联反应，最终导致细胞凋亡［8］。而Bcl-2能封闭Bax形成的孔道，使一些小分子不能自由通透，从而保护细胞凋亡。Grim-19是Grims家族成员之一，目前认为Grim-19的表达促进细胞凋亡，其对维持线粒体的跨膜电位至关重要，而完整的跨膜电位可以保护细胞免于细胞凋亡［9］。NF-κB作为一种核因子，其发生磷酸化后，能进入细胞核内，调节抗凋亡基因的转录。研究［10－11］证明ATRA能通过抑制NF-κB的转录活性诱导人外周血白血病T细胞和恶性胶质瘤细胞凋亡。survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白家族中的最小成员，可能主要通过两条途径来抑制细胞凋亡：一是直接抑制Caspase-3、Caspase-7的活性，阻断凋亡信号转导通路；二是与细胞周期蛋白激酶CDK4结合，导致CDK2／cyclinE激活和核糖体磷酸化，核糖体磷酸化后启动细胞周期，加快G1／S期的转换，抑制细胞凋亡［12］。Caspase家族是半胱氨酸依赖性细胞死亡蛋白酶。作为凋亡终末效应器，Caspase-3可以剪切PARP，其结果是导致细胞不能进行DNA修复，从而启动DNA的降解，引起细胞凋亡。该实验Western blot法结果显示ATPR处理组Bcl-2表达量降低而Bax上升，抗凋亡蛋白NF-κB、survivin下降、促凋亡蛋白Grim-19、Caspase-3的表达上升。而ATRA处理组凋亡蛋白的表达与ATPR组趋势相同但不如ATPR显著。

综上所述，ATRA与ATPR均能促进乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡。但与ATRA相比，ATPR促进细胞凋亡的效果更加显著，其可能通过调控相关凋亡蛋白的表达诱导乳腺癌细胞凋亡。细胞凋亡是一个极其复杂且受严格调控的过程，由多种细胞因子及信号通路参与调控，其具体机制有待进一步研究。

［1］ 王爱丽，徐爱晖.维甲酸及其衍生物抗肺肿瘤作用的研究进展［J］.临床肺科杂志，2009，14（1）：85－6.

［2］ Siddikuzzaman，Guruvayoorappan C，Berlin Grace V M.All trans retinoic acid and cancer［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol，2011，33（2）：241－9.

［3］ Su Y C，Dunn P，Shih L Y，et al.Retinoic acid syndrome in patients following the treatment of acute promyelocytic leukemia with all-trans retinoic acid［J］.Chang Gung Med J，2009，32（5）：535－42.

［4］ Wang B，Yan Y，Zhou J，et al.A novel all-trans retinoid acid derivatives inhibits the migration of breast cancer cell lines MDAMB-231 via myosin light chain kinase involving p38-MAPK pathway［J］.Biomed Pharmacother，2013，67（5）：357－62.

［5］ 冯小伟，叶兆祥.乳腺癌筛查的现状及进展［J］.国际医学放射学杂志，2012，35（2）：131－4.

［6］ Garattini E，Bolis M，Garattini S K，et al.Retinoids and breast cancer：from basic studies to the clinic and back again［J］.Cancer Treat Rev，2014，40（6）：739－49.

［7］ Gómez-Fernández J C.Functions of the C-terminal domains of apoptosis-related proteins of the Bcl-2 family［J］.Chem Phys Lipids，2014，183：77－90.

［8］ Czabotar P E，Lessene G，Strasser A，et al.Control of apoptosis by the BCL-2 protein family：implications for physiology and therapy［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2014，15（1）：49－63.

［9］ 张照果，李 静.细胞死亡调节因子GRIM-19的研究进展［J］.辽宁医学院学报，2010，31（3）：274－7.

［10］Zhang R，Banik N L，Ray S K.Combination of all-trans retinoic acid and interferon-gamma suppressed PI3K／Akt survival pathway in glioblastoma T98G cells whereas NF-κB survival signaling in glioblastoma U87MG cells for induction of apoptosis［J］.Neurochem Res，2007，32（12）：2194－202.

［11］Nawata H，Maeda Y，Sumimoto Y，et al.A mechanism of apoptosis induced by all-trans retinoic acid on adult T-cell leukemia cells：a possible involvement of the Tax／NF-κB signaling pathway［J］.Leuk Res，2001，25（4）：323－31.

［12］徐丽丽，高世勇，季宇彬.细胞凋亡相关蛋白的研究进展［J］.齐齐哈尔医学院学报，2008，29（11）：1361－2.

The influence of ATRA and its derivative on the cell apoptosis of breast cancer cell line MDA-MB-231

Zhou Jiali，Yan Yunwen，Jiang Qiaoling，et al
（Dept of Biochemistry and Laboratory of Molecular Biology，Anhui Medical University；Dept of Key Laboratory，Gene Resource Utilization for Severe Disease of Anhui Province，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the influence of all-trans retinoic acid（ATRA）and its derivative 4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl ester（ATPR）on the apoptosis of breast cancer cell line MDA-MB-231.MethodsMDAMB-231 was treated with different concentrations of ATRA and ATPR for 48 h.Hoechst staining and flow cytometry were used to observe cell apoptosis.The mRNA level of apoptosis-related protein Caspase-3 was analyzed by RTPCR.Western blot was performed to detect the expression of apoptosis-related proteins.ResultsCompared with ATRA，the same concentrations of ATPR promoted the apoptosis of MDA-MB-231 more obviously（P＜0.05），and the effect was dose-dependent.RT-PCR showed ATPR significantly raised the mRNA level of Caspase-3（P＜0.05）.Western blot displayed that ATPR decreased the expression of anti-apoptotic protein such as Bcl-2，NF-κB，survivin（P＜0.05）and increased the expression of pro-apoptotic protein Bax，Grim-19，Caspase-3（P＜0.05）.ConclusionContrasted to ATRA，ATPR is able to promote the cell apoptosis of MDA-MB-231 more markedly.

breast cancer；MDA-MB-231；ATPR；apoptosis

R 739.5；R 966；R 34

1000－1492（2015）02－0154－05

2014－10－23接收

国家自然科学基金（编号：81272399）；安徽省自然科学基金（编号：090413116）

安徽医科大学分子生物学实验室、生物化学与分子生物学教研室、安徽省／省部共建教育部重要遗传病基因资源利用重点实验室，合肥 230032

周佳丽，女，硕士研究生；汪 渊，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：aydesm-1＠163.com