CD105／CD133筛选鉴定SMMC-7721株干细胞表面标志物的实验研究

吴立胜，鲁 旭，耿小平，卢 寅，张俊松

CD105／CD133筛选鉴定SMMC-7721株干细胞表面标志物的实验研究

吴立胜1，鲁 旭1，耿小平2，卢 寅1，张俊松1

目的 观察人肝癌细胞株SMMC-7721中膜抗原CD133、CD105的表达情况并对不同亚群的生物学性状进行体内外实验研究。方法以含10%胎牛血清的DMEM对SMMC-7721株细胞培养；采用流式细胞仪方法分选检测CD133、CD105在SMMC-7721中表达情况并分选出CD133＋／CD105＋、CD133＋／CD105－、CD133－／CD105＋、CD133－／CD105－4个亚群；CCK-8和Transwell侵袭实验分别检测4个亚群和未分选细胞组的增殖及侵袭能力，软琼脂克隆实验检测5组细胞成球能力；裸鼠成瘤实验了解CD133＋／CD105＋CD133－／CD105－亚群和未分选组的成瘤能力。结果流式细胞仪分选的CD133＋／CD105＋、CD133＋／CD105－、CD133－／CD105＋、CD133－／CD105－4种细胞亚群的比例分别为1.61%、0.01%、97.88%和0.50%。CD133＋亚群的增殖和成球能力较CD133－亚群及未分选细胞组强，而CD105＋亚群侵袭能力较CD105－亚群及未分选细胞组强。CD133＋／CD105＋组与CD133－／CD105－组及未分选细胞组相比成瘤所需的时间短、所需细胞数少、成瘤的体积大。结论 CD133在人肝癌细胞株SMMC-7721中的表达与其增殖成球能力有关，CD105与其侵袭能力有关，CD133＋／CD105＋具有体内高度的成瘤能力。CD133＋／CD105＋亚群在人原发性肝癌细胞株SMMC-7721中具有肿瘤干细胞特性。

CD133；CD105；原发性肝癌；干细胞

肿瘤干细胞也称作肿瘤起始细胞，目前尚无确切的定义，一般认为是一种罕见的具有自我更新、分、化多能性、肿瘤起始和对放化疗抵抗等特性的肿瘤细胞亚群。随着肿瘤干细胞学说的提出和深入研究，原发性肝癌肿瘤干细胞的存在也得到了越来越多的证实［1－4］，但目前发现的不同类型表面标志物是否能够真正代表具有相应的肿瘤生物学特性尚不清楚，如何判断和检测人肝癌干细胞表面标志物仍处于探讨研究状态。该研究旨在通过体内外实验对经流式细胞仪分选后的原发性肝癌细胞株SMMC-7721不同亚群进行分析研究，了解CD133联合CD105表达在人原发性肝癌细胞株SMMC-7721中的肿瘤干细胞特性情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验细胞株和实验动物 人肝癌细胞株SMMC-7721由安徽医科大学药理教研室惠赠；SPF级雄性免疫缺陷裸小鼠（BALB／c裸鼠），4周龄，18～20 g，购自上海市斯莱克实验动物有限公司。

1.1.2主要试剂与仪器 CD133／（AC133）-PE抗体（德国Miltenyi公司）；APC Mouse Anti-Human CD105、Matrigel胶、流式细胞分选仪（美国BD公司）；细胞培养瓶、Transwell小室（美国Corning公司）；DMEM高糖培养基和胎牛血清（美国Hyclone公司）；CCK-8细胞增殖试剂盒（中国贝博公司）；低温冰箱（－80℃、－20℃）、4℃冰箱（中国美菱公司）；超净台（中国苏州净化公司）；酶标仪、恒温水育箱（美国Thermo公司）；离心机（美国CDK公司）；显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及传代 用DMEM高糖培养基对肝癌细胞株SMMC-7721细胞进行培养，培养基内加入10%胎牛血清、含浓度为100 U／L的青霉素、100 mg／ml的链霉素和2 mmol／L的谷氨酰胺，细胞培养瓶置入5%CO2、饱和湿度的恒温（37℃）培养箱，细胞换液2 d 1次，同时观察细胞生长情况，待细胞长满培养瓶底面积约80%～90%时则需要细胞传代，一般需要4～5 d。

1.2.2表型分析及流式细胞术分选 取对数生长期的SMMC-7721细胞用胰蛋白酶消化1.5 min，PBS液洗涤后制成单细胞悬并精确计数，调整细胞密度至5×106个／ml。取4只流式管，分别标记为A、B、C、D，其中A、B和C管分别加入100 μl制备好的单细胞悬液，D管加入1 ml单细胞悬液，再分别向A管中加入5 μl抗CD105的抗体，B管中加入5 μl抗 CD133的抗体，C管中加入25 μl抗CD105抗体和50 μl抗CD133的2种抗体，D管中则不加任何抗体；置入培养箱中孵育15 min；按D、A、B、C的顺次上流式细胞分选仪，分析人肝癌细胞株SMMC-7721单细胞悬液中的CD133＋／CD105＋、CD133＋／CD105－、CD133－／CD105＋和CD133－／CD105－各细胞亚群的比例情况。

1.2.3体外增殖能力检测 将已调整好细胞密度1×103个／ml的分选后人肝癌细胞株SMMC-7721的亚群细胞按CD133＋／CD105＋、CD133＋／CD105－、CD133－／CD105＋、CD133－／CD105－和未分选细胞顺序标识为5组，再分别将各组细胞以200 μl／孔接种至96孔板中，其中每组均设置3个平行孔，共接种5板；接种完毕的96孔培养板置于37℃、5% CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养，于每日上午约10点取1板避光条件下加入20 μl CCK-8试剂，培养箱孵育1 h后酶标仪在450 nm波长处测各亚群细胞的光密度（optical density，OD）值。

1.2.4克隆生长能力检测 取1.2%低熔点琼脂糖10 ml与等体积的2×DMEM充分混匀，以混合液1 ml／孔铺至24孔板底层（冰上操作）制备底层琼脂胶并冷凝成胶冻状；调整细胞密度，用2×DMEM培养基对经流式细胞术分选后培养的SMMC-7721细胞4种亚群和未经流式分选的细胞进行计数调整，使各组细胞密度为2×102个／ml；取0.7%低熔点琼脂糖与2×DMEM等比例混合液1 ml铺至24孔板底层（在冰上操作）制备顶层琼脂胶并冷凝成胶冻状，每组均设置3个平行实验孔；置24孔板于培养箱中培养14 d，计算每组软琼脂凝胶中大于50个细胞的克隆数，分别计算，取得平均值及标准差。

1.2.5Transwell小室侵袭实验 按购买的Transwell小室说明书进行人工基底膜的制备。用无血清DEME培养基将已分选获得的各SMMC-7721亚群和未分选细胞制成单细胞悬液，再计数调整细胞密度为5×105个／ml浓度。在已制备好的上室各孔加入100 μl细胞，每组细胞设置3个平行孔（冰上操作），下室加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培养基，将培养板置于37℃、5%CO2温箱中孵育24 h以上后取出上室，吸尽上室内的培养基，用棉签擦去聚碳酸酯膜上表面的细胞，然后将小室置于2%多聚甲醛中固定15 min，再用苏木精－伊红染液染色2 min，PBS洗涤后随机选择5个视野，于200倍光镜下计数穿膜细胞数，计算均值及标准差。每组试验重复3次。

1.2.6裸鼠皮下接种移植瘤 雄性免疫缺陷裸小鼠18只（BALB／c裸鼠），在SPF级动物实验室经过2个阶段1周的饲养，过度到无特殊病原体的饲养标准。按随机数字表然后将18只裸鼠随机分为3组，每组6只，选取将经过流式细胞仪分选得到CD105＋／CD133＋、CD105－／CD133－亚群细胞和未分选细胞3组细胞重悬于无血清的DMEM中，调整各组细胞悬液浓度为目标浓度后再接种到裸鼠背部皮下。每只裸鼠注入0.2 ml，继续饲养，从接种时间算起，每2周观察和测量每只裸鼠的移植瘤的情况，记录有无移植瘤和移植瘤的体积大小；对于接种约1个月没有明显肿瘤形成的小鼠，再接种较高浓度的细胞悬液至肿瘤形成。典型的成瘤实验结果拍照纪录。所有的成瘤实验于接种3个月后终止，将18只BALB／c裸鼠按颈椎脱臼法处死，手术完整剥离裸鼠移植瘤，游标卡尺逐个测量移植瘤的长径（a）、短径（b），计算移植瘤体积。移植瘤体积（mm3）＝（a×b2）÷2。

1.3 统计学处理采用SPSS 17.0软件进行分析，数据以±s表示。细胞克隆能力、生长能力、侵袭能力的比较采用单因素方差分析方法，组间比较采用两独立样本t检验，体内实验移植瘤体积比较采用配对样本t检验。

2 结果

2.1 CD133、CD105在SMMC-7721细胞株中流式细胞仪分选流式细胞仪表型测定检测显示人肝癌细胞株SMMC-7721细胞CD105＋／CD133＋、CD105－／CD133＋、CD105＋／CD133－、CD105－／CD133－亚群的比例分别为1.61%、0.01%、97.88%和0.50%。见图1。单独以CD133＋标识肝癌SMMC-7721细胞的比

例为1.62%，而CD105＋的流式分选结果为99.49%。

2.2 人肝癌细胞株SMMC-7721各亚群及未分选细胞的增殖能力检测采用CCK-8检测分选获得的4种SMMC-7721细胞亚群及未分选细胞。结果显示，在细胞接种于96孔板后的第一个24 h，各组细胞的数目（以OD450表示）的差异无统计学意义（P＝0.059）；而48 h以后各组细胞的数量的差异有统计学意义（P＜0.01）。此外，通过分析可知CD133＋细胞亚群（包括CD105＋／CD133＋和CD105－／CD133＋）的数量多于CD133－的细胞亚群及未分选细胞；而两种CD133＋亚群及两种CD133－亚群之间细胞数量的差异无统计学意义。见图2。

2.3 软琼脂克隆培养实验软琼脂克隆培养14 d后，计数4种细胞亚群及未分选细胞的克隆数分别为（50.3±7.4）、（35.0±3.5）、（25.3±1.5）、（11.3 ±2.1）和（18.0±2.6），各组间克隆数的差异有统计学意义（F＝3 938.213，P＜0.05）。其中，CD133＋／CD105＋与CD133＋／CD105－形成的克隆数之间差异无统计学意义（P＝0.06），CD133－／CD105＋和CD133－／CD105－之间差异无统计学意义（P＝0.315）。见图3。

2.4 Transwell小室侵袭实验Transwell小室在常规条件下培养24 h，固定、染色聚碳酸酯膜下表面的细胞。计数CD133＋／CD105＋、CD133－／CD105＋、未分选细胞、CD133＋／CD105－和CD105－／CD133－细胞组的跨膜细胞数分别为（109.3±1.15）、（96.7± 3.79）、（80.0±1.00）、（33.3±1.53）、（28.3± 1.15），各组间细胞数量差异有统计学意义（F＝1 002.852，P＝0.029）。进一步分层分析，两组CD105＋细胞亚群之间的跨膜细胞数量差异有统计学意义（P＝0.045）；而两组CD105－的细胞亚群之间差异无统计学意义（P＝0.285）。见图4。

2.5 动物实验

2.5.1 观察裸鼠皮下移植瘤 所有的成瘤实验于接种3个月后终止，饲养及实验过程中无裸鼠死亡，将18只BALB／c裸鼠按颈椎脱臼法处死，手术完整剥离裸鼠皮下移植瘤。实验过程中观察到1 000个CD133＋／CD105＋细胞在第1个月就能在2只（本组共6只）裸鼠内产生肿瘤，而注射同样细胞数的CD133－／CD105－亚群和未分选组则未能观察到肿瘤产生；然后调整细胞数量至3 000个细胞数进行各组注射，结果提示，CD133＋／CD105＋亚群在第3个月6只均有肿瘤生成，而未分选组则有4只有肿瘤生成，CD133－／CD105－亚群在第3个月仅3只有肿瘤生成。实验结果表明，分选后的CD133＋／CD105＋亚群裸鼠的皮下移植瘤生长具有明显性，而分选后的CD133－／CD105－亚群和未分选组裸鼠的皮下移植瘤生长明显缓慢。见图5、6。

2.5.2测量裸鼠皮下移植瘤 终止实验后，手术完整剥除各组皮下移植瘤，游标卡尺测量各组的长、短径并按公式计算出裸鼠移植瘤体积。结果显示CD133＋／CD105＋亚群裸鼠皮下移植瘤体积为（1.652±0.014）mm3，CD133－／CD105－亚群裸鼠皮下移植瘤体积为（0.807±0.053）mm3，未分选组裸鼠的皮下移植瘤体积为（0.831±0.069）mm3；CD133＋／CD105＋亚群和CD133－／CD105－亚群及未分选组裸鼠的皮下移植瘤体积比较差异有统计学意义（P＜0.01），而CD133－／CD105－亚群与未分选组裸鼠的皮下移植瘤体积比较差异无统计学意义。

3 讨论

近年来肿瘤干细胞学说的研究不断深入，但仍然缺乏对肿瘤干细胞精确分子标志物的了解。迄今为止，虽已有多种假定肿瘤干细胞相关标志物被鉴定，但相关标志物也并非特异性表达在大多数相应的肿瘤细胞中［5］；原发性肝癌的肿瘤干细胞表面标志物的研究也处于探讨状态。过去几年间，CD133作为原发性肝癌表面标志物被广泛关注，但CD133不能作为原发性肝癌的表面标志物的特异性标记［6］。目前对于肿瘤干细胞标志物的研究多集中于膜表面抗原的联合检测，如检测急性髓细胞白血病的CD34＋／CD38－［7］、检测胰腺癌的ESA＋CD44＋CD24＋［8］。在此实验中也采用膜抗原的联合检测方法。研究［9－10］显示CD105更适合作为人原发性肝癌中血管生成的特殊标志物。前期的体外实验研究［11］探讨了CD133＋／CD105＋在HepG2细胞株中的肿瘤干细胞特性。有学者认为HepG2细胞株来自于肝母细胞瘤，在HepG2细胞株的体外实验结果并不能完整验证CD133＋／CD105＋细胞亚群在肝癌中的肿瘤干细胞特性，SMMC-7721肝癌细胞株有贴壁性强，且容易形成体内实验转移瘤等特点，因此选择SMMC-7721肝癌细胞株进行相关实验。

流式细胞术分选结果表明SMMC-7721细胞膜表面CD133＋／CD105＋的比例为1.61%。生长曲线显示CD133＋细胞亚群的生长速度明显快于CD133－细胞亚群及未分选细胞，CCK-8增殖试验结果显示CD133＋细胞亚群的OD450值为CD133－细胞亚群的1.5倍。通过软琼脂克隆培养试验，2周后CD133＋细胞亚群的克隆数量为CD133－细胞亚群4.55倍，同样证明了CD133＋细胞亚群的生长速度快于CD133－细胞亚群。在细胞增殖实验中细胞膜抗原CD105对人原发性肝癌细胞株SMMC-7721增殖无明显影响，而细胞膜抗原CD133主要诱发或主导细胞增殖加强。克隆实验表明人原发性肝癌细胞株SMMC-7721的成瘤活性与膜抗原CD133密切相关。Transwell小室侵袭实验显示CD105＋细胞亚群穿膜细胞数是CD105－细胞亚群2倍余；进一步分层分析可知，两组CD105－的细胞亚群之间的跨膜细胞数量差异无统计学意义，而两组CD105＋细胞亚群之间则差异有统计学意义；提示人原发性肝癌细胞株SMMC-7721侵袭能力与CD105密切相关，而CD133对其侵袭能力的作用影响有限。

验证肿瘤干细胞最具有说服力的实验是其体内的成瘤能力［12］，CD133＋／CD105＋细胞亚群在1 000个细胞数和第1个月即能在裸鼠身上能明显成瘤，较CD133－／CD105－和未分选组速度明显增快，CD133＋／CD105＋亚群组的体内成瘤率高，成瘤体积大，所需细胞数少。实验结果表明，分选后的CD133＋／CD105＋亚群裸鼠的皮下移植瘤生长具有明显性，而分选后CD133－／CD105－亚群和未分选组裸鼠的皮下移植瘤生长明显缓慢。成瘤实验的结果证明CD133＋／CD105＋亚群组的体内成瘤能力明显增强。

综上所述，本研究通过体外的增殖能力、侵袭能力实验和体内裸鼠成瘤实验，证实CD133＋／CD105＋细胞亚群的增殖能力、侵袭能力、自我更新能力及致瘤能力均强于其他亚群，说明CD133＋／CD105＋细胞亚群含有更多干细胞样特性的肿瘤细胞，即在SMMC-7721细胞株中，CD133＋／CD105＋更能够精确鉴定肝癌干细胞特性。综合前期在人肝细胞株HepG2中的研究结果，本研究提示CD133＋／CD105＋亚群更能代表人肝癌肿瘤生物学特性的原始细胞。

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CD105／CD133 as cell surface markers for screening and identification of stem cell in SMMC-7721

Wu Lisheng1，Lu Xu1，Geng Xiaoping2，et al
（1Dept of Invasive Surgery，The Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230061；2Dept of General Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveThe objective of this research is to compare the expression of CD105 and CD133 in membrane of human HCC cell line SMMC-7721，different biological characters among the subpopulations in vitro and vivo.MethodsSMMC-7721 cell line was cultured in DMEM containing 10%FBS.Flow cytometry was used to detect CD105，CD133 expression in SMMC-7721 cell in vitro.Four cell sub-populationsCD133＋／CD105＋，CD133＋／CD105－，CD133－／CD105＋，CD133－／CD105－were sorted by flow cytometry.Cell proliferation of these four subpopulations was detected by CCK-8 assay.Sphere formation ability of these four sub-populations was examined by soft agar test.Invasion ability of these four sub-populations was examined by Transwell cell invasion test.In vivo tumorigenicity assay was also performed on these four sub-populations using nude mice.ResultsThe proportions of four sub-populations CD133＋／CD105＋，CD133＋／CD105－，CD133－／CD105＋，CD133－／CD105－were 1.61%，0.01%，97.88%and 0.50%sorted by flow cytometry，respectively.CD133＋subsets cells grew more quickly than those of CD105＋and unsorted cells.The numbers of colonies formed by CD133＋subsets cells were more than those of CD105＋and unsorted cells.Furthermore，the metastatic capacity of CD105＋subset cells observed by Transwell assay was higher than that of the CD133＋subsets cells and unsorted cells.In vivo tumor experiments showed CD133＋／CD105＋needed a shorter time and fewer cells，compared with unsorted group and CD105－CD133－groups were statistically significant（P＜0.05）.ConclusionOur study finds that human live cancer cell line SMMC-7721 can be sorted into four sub-groups CD133＋／CD105＋，CD133＋／CD105－，CD133－／CD105＋and CD133－／CD105－successful by flow cytometry.It is found that CD133＋／CD105＋sub-group shows high proliferative potential，high capacity for self-renewal by proliferation assay，clone forming assay and in vitro invasion assay.In vivo tumor experiment proves CD133＋／CD105＋sub-group shows a higher degree of tumorigenicity.Therefore，CD133＋／CD105＋subset cells are a subpopulation with stem properties in SMMC-7721 cells.

CD133；CD105；primary hepatocellular carcinoma；stem cell

R 735.7

1000－1492（2015）02－0158－06

2014－11－04接收

安徽省科技攻关计划（编号：1301zc04065）；合肥市科技局［编号：2013（26）］

1安徽医科大学第三附属医院（合肥市第一人民医院）微创外科，合肥 2300612安徽医科大学第一附属医院肝脏外科，合肥 230022作者简介：吴立胜，男，博士，副教授，副主任医师，硕士生导师；耿小平，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：xp-geng＠163.net