HPLC法检测异甜菊醇钠注射剂中的有关物质

康秋红，李俊晓，谭文

HPLC法检测异甜菊醇钠注射剂中的有关物质

康秋红，李俊晓，谭文

(华南理工大学生物科学与工程学院/生物医药前孵化器研究中心/广东省发酵与酶工程重点实验室，广东广州510006)

目的建立高效液相色谱法检查异甜菊醇钠注射剂(STVNa注射剂)中的有关物质。方法采用C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以水和乙腈为流动相进行线性梯度洗脱，流速为0.8 mL/min，柱温为40℃，检测波长为210 nm。结果空白溶剂及空白辅料均不干扰检测，本方法可将异甜菊醇(ISV)粗品和STVNa注射剂经破坏性试验所得样品中的杂质进行有效分离；重复性考察的RSD值为13%；在0.003 ～1 mg/mL质量浓度范围内与峰面积响应值呈良好的线性关系，相关系数为0.999 6。结论本方法专属性强、重复性好，可用于STVNa注射剂中有关物质的检查。

异甜菊醇；有关物质；HPLC法

从甜菊叶中提取分离得到的甜菊糖苷是一种低卡路里的甜味剂，其甜度大约是0.4%(质量浓度)蔗糖溶液的300倍，属于二萜类化合物大家族。甜菊糖苷具有抗高血压、抗感染、抗肿瘤和免疫活性等多种药理活性[1]，在其原产地南美巴拉圭、巴西等地，已有几百年的食用历史，至今没有关于其不良反应的报道。

异甜菊醇(isosteviol，ISV)是从甜菊糖苷中提取分离得到的化学单体，异甜菊醇钠(isosteviol sodium，STVNa)是ISV的钠盐形式。异甜菊醇及其钠盐对于心肌缺血再灌注损伤具有较好的保护作用[2-4]，是较为理想的治疗心脑血管疾病的药物，与同类药物相比，在发挥药理效应的同时不影响心率和血压，在增强心功能的同时不增加耗氧量，填补了缺血保护药的空白。因此STVNa是一个极具开发前景的新药，但关于其有关物质的检测分析方法文献鲜有报道。本中心研究开发出一种适用于静脉注射的STVNa注射剂，并对其有关物质的检测方法进行开发及考察，以期为STVNa及含STVNa制剂的有关物质检测提供参考。

1 仪器与试药

LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司，包括SPD-M20A检测器、CBM-20A色谱数据处理系统)；ML 104/02万分之一分析天平(METTLER TOLEDO公司)；MILLI-Q 10A纯水仪(THERMO SCIENTIFIC公司)。

STVNa原料药(东莞凯法生物医药公司，批号: 140219-1，质量分数＞99.9%)，STVNa注射剂(珠海润都制药有限公司，批号:140224、140225、140226，规格:2.5 mg/mL)，ISV粗品(东莞凯法生物医药公司，批号:080715-1，质量分数为97%)，甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 主药储备液的制备 精密称取STVNa原料药适量，加甲醇制成质量浓度为2.5 mg/mL的溶液，作为主药储备液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取STVNa注射剂适量，加0.2%(体积分数)甲酸甲醇溶液稀释制成每1 mL中含有2 mg的溶液，作为供试品溶液。

2.1.3 阴性溶液的制备 按处方量量取除主药外的辅料，按“2.1.2”项下方法制备成阴性溶液。

2.1.4 对照溶液 精密量取供试品溶液适量，加甲醇稀释制成每1 mL中含0.02 mg的溶液，作为对照溶液。

2.2 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱为C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为水和乙腈，按表1程序进行线性梯度洗脱，流速为0.8 mL/min，柱温为40℃，检测波长为210 nm。精密量取供试品溶液进样量为20 μL。理论塔板数按STVNa峰计大于8 000，拖尾因子1.05，空白溶剂及空白辅料不干扰有关物质的测定。

表1 梯度洗脱程序表Table 1 Gradient elution mobile phase

2.3 专属性试验

2.3.1 粗品中有关物质的分离 取ISV粗品[5]适量，精密称定，加甲醇溶解配制成质量浓度5 mg/mL的溶液，按“2.2”项下色谱条件检测，检出杂质23个，分别标记为杂质1～18和杂质20～24。ISV粗品中主峰与附近的杂质峰、各杂质峰之间能达到有效分离，见图1。

图1 ISV粗品检测的HPLC图Figure 1 HPLC Chromatogram of ISV

2.3.2 强酸破坏试验 精密量取本品、阴性溶液和主药储备液各8 mL，分别置10 mL容量瓶中，加1 mol/L HCl 1 mL，2 h后加1 mol/L NaOH 1 mL，收集样品，滤过，取续滤液20 μL，按“2.2”项下条件进样分析，记录色谱图。见图2A。

2.3.3 强碱破坏试验 精密量取本品、阴性溶液和主药储备液各8 mL，分别置10 mL容量瓶中，加1 mol/L NaOH 1 mL，2 h后加1 mol/L HCl 1 mL，收集样品，滤过，取续滤液20 μL，按“2.2”项下条件进样分析，记录色谱图。见图2B。

2.3.4 氧化破坏试验 精密量取本品、阴性溶液和主药储备液各8 mL，分别置10 mL容量瓶中，加30%(体积分数)双氧水1 mL，2 h后加0.2%甲酸甲醇溶液稀释定容，滤过，取续滤液20 μL，按“2.2”项下条件进样分析，记录色谱图。

2.3.5 高温破坏试验 精密量取本品、阴性溶液和主药储备液各8 mL，分别置10 mL容量瓶中，130℃下放置4 h后，加0.2%甲酸甲醇溶液稀释定容，滤过，取续滤液20 μL，按“2.2”项下条件进样分析，记录色谱图。

2.3.6 强光破坏试验 精密量取本品、阴性溶液和主药储备液各8 mL，分别置10 mL容量瓶中，置强光(8 000 lx)下照射24 h，加0.2%甲酸甲醇溶液稀释定容，滤过，取续滤液20 μL，按“2.2”项下条件进样分析，记录色谱图。

2.3.7 破坏性试验结果分析 根据破坏性试验的色谱行为分析，样品经酸、碱破坏后新产生了8个较明显的杂质峰，分别标记为杂质10、11、12、15、23、25、27、28，其中强酸、强碱破坏均产生杂质15、27，杂质21和26存在于未破坏的样品中，但经酸碱破坏后其峰显著增大。杂质13来源于阴性溶液，杂质11、12、15、23来源于ISV粗品，原料药经强碱破坏试验后产生杂质11，各组分峰与辅料峰的分离度均符合要求。样品经强光、高温及强氧化破坏仅杂质峰21、26显著增大，其他未改变。破坏性试验的代表性图谱见图2。

图2 样品、阴性、主药降解前后的HPLC分离图谱Figure 2 HPLC chromatograms of the sample，negative，the primary drug before and after degradation

2.4 线性关系的考察

精密称量STVNa 50 mg至25 mL容量瓶中，加0.2%甲酸甲醇溶液稀释制成2 mg/mL储备液，摇匀，加甲醇分别稀释制成质量浓度为0.003、0.005、 0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/mL的溶液，分别按“2.2”项下条件测定，记录色谱图。以STVNa质量浓度(ρ)为横坐标，STVNa峰面积(A)为纵坐标作图，计算线性回归方程。结果表明STVNa在0.003 ～1 mg/mL范围内与峰面积响应值线性关系良好，标准曲线方程为A＝1.0×106ρ＋2.289 5×103，r2为0.999 6。

2.5 检测限和定量限的测定

精密称量STVNa 50 mg至25 mL容量瓶中，加0.2%甲酸甲醇溶液稀释制成2 mg/mL储备液，摇匀，将储备液用甲醇逐级稀释，并将稀释后的溶液分别进样检测，记录色谱图。以信噪比10∶1时的质量浓度为定量限，信噪比3∶1时的质量浓度为检测限。结果显示STVNa的定量限为3 μg/mL，检测限为1 μg/mL。

2.6 供试品溶液的稳定性考察

分别精密吸取“2.1”项下的供试品溶液和对照溶液20 μL，按“2.2”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、10 h测定，记录峰面积并计算RSD值。结果待测定溶液在10 h内基本稳定，样品可检出杂质21、26，10 h内未出现其他杂质，测定有关物质平均质量分数为0.19%，RSD值为13%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.7 样品的测定

分别取 3批 STVNa注射剂(批号:140224、140225、140226)，按“2.1”项下方法制备供试品溶液及对照溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定，计算有关物质。结果3批样品均可检出杂质21和26，分别为 0.09%、0.09%；0.10%、0.11%；0.08%、0.11%，STVNa原料药中无杂质检出，杂质21和26 在STVNa注射剂中间体(过滤前样品)中未检出，推测可能来源于过滤工艺中。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

通过全波长扫描法确定210 nm作为STVNa注射剂中有关物质的检测波长，与其特征最大吸收波长291 nm相比，在210 nm处杂质检出能力强。譬如，在ISV粗品及强酸、强碱破坏性试验样品中，选择210 nm作为检测波长，杂质检出个数分别为23、9、7个，总杂质检出量分别为8.1%、14.7%、26%；而选择291 nm作为检测波长，杂质检出个数分别为8、2、1，总杂质检出量分别为2.3%、6.8%、9%。

3.2 流动相的选择

ISV为天然产物提取物，粗品中含有的杂质比较多(23个)，STVNa注射剂破坏试验降解杂质较少(8个)，所以采用ISV粗品优化色谱条件。通过对流动相比例、柱温、流速的调整[6-7]，根据杂质洗脱数量及分离度等情况，经筛选调整确定了本文的色谱条件。本条件可将ISV粗品中各成分有效分离，对破坏性试验样品中的杂质分离度亦较好，结果令人满意。

3.3 粗品中杂质与破坏性试验中杂质的关系

本研究通过破坏性试验，共分离出8个杂质，分别为杂质10、11、12、15、23、25、27、28，其中杂质11、12、15、23来源于ISV粗品，杂质的结构和降解机理有待进一步研究[8]。在强酸、强碱破坏试验中，均收集到2个样品，因样品加入强酸强碱后变浑浊，遂取浑浊样品滤过得样品1，取浑浊样品加甲醇助溶后滤过得样品2，图2显示的是样品2的检测色谱图。样品2较样品1检测出的杂质数目多且量大，可能是因为强酸、强碱破坏产生的杂质水溶性差，需加甲醇助溶后才被检测到。

[1]CHATSUDTHIPONG V，MUANPRASAT C.Stevioside and related compounds:Therapeutic benefits beyond sweetness [J].Pharm Therapeut，2009，121(1):41-54.

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[4]XU DY，DU WF，ZHAO L，et al.The neuroprotective effects of isosteviol against focal cerebral ischemia injury induced by middle cerebral artery occlusion in rats[J].Plant Medica，2008，74(8):816.

[5]《化学药物杂质研究的技术指导原则》课题研究组. GPH3-1化学药物杂质研究的技术指导原则[EB/OL]. (2005-03-18)[2015-05-21].http://www.sfda.gov.cn/ WS01/CL0844/10368.html.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部[M].北京:中国医药科技出版社，2010:附录29-31.

[7]许哲，周宁，许旭，等.使用大环糖肽抗生素键合固定相高效液相色谱法直接拆分卡巴拉汀[J].分析化学研究简报，2007，35(7):1043-1047.

[8]张蜀，陈睿妍，邓红，等.愈酚伪麻待因口服溶液中有关物质检查方法的研究[J].广东药学院学报，2009，25 (4):365-367.

(责任编辑:刘晓涵)

Determination of impurities in isosteviol sodium injection by HPLC

KANG Qiuhong，LI Junxiao，TAN Wen
(School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；Pre-incubator for Innovative Drugs and Medicine Center，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；Guangdong Provincial Key Laboratory of Fermentation and Enzyme Engineering，Guangzhou 510006，China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of impurities in isosteviol sodium (STVNa)injection.MethodsThe separation was performed on C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)column eluted with a linear gradient mobile phase of water and acetonitrile.The flow rate was 0.8 mL/min and column temperature was 40℃.The detection wavelength was set at 210 nm.ResultsBlank solvents and accessories caused no interference.The impurities were separated well in crude ISV samples and destructive testing of STVNa injection.RSD was 13%in the repeatability experiments.The calibration curve was linear within the range of 0.003-1 mg/mL，and the correlation coefficient was 0.999 6.ConclusionThis method is specific and reproducible for the determination of impurities in STVNa injection.

isosteviol；impurities detection；HPLC

R917

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.009

1006-8783(2015)05-0598-04

2015-05-21

东莞松山湖创新生物医药产业集群建设项目(2012B011000050)

康秋红(1989—)，女，2012级硕士研究生，从事医药生物学研究，Email:18620175384＠163.com；通信作者:谭文(1956—)，男，博士生导师，从事医药生物学研究，Email:went＠scut.edu.cn。

时间:2015-10-19 14:59

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20151019.1459.002.html