艾纳香口腔护理液的处方筛选及其抑菌效果研究

邹婧，杨全，庞玉新，王凯，范佐旺，李海艳

艾纳香口腔护理液的处方筛选及其抑菌效果研究

邹婧1，2，3，杨全1，庞玉新2，3，王凯2，3，范佐旺1，2，3，李海艳1，2，3

(1.广东药学院 中药学院，广东 广州510006；2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室，海南儋州571737；3.海南省艾纳香工程技术研究中心，海南儋州571737)

目的对艾纳香口腔护理液进行处方筛选，并对其抑菌效果及抑菌稳定性进行考察，为后期产品开发提供理论依据。方法以艾纳香提取物为原料，以溶液澄清度、口感、除臭效果为评价指标，采用正交试验设计筛选最优处方。对艾纳香口腔护理液进行体外抑菌试验，并考察在37℃下放置5个月的抑菌稳定性。结果筛选得出的最佳溶剂为体积分数15%的乙醇，最佳促溶剂为聚氧乙烯氢化蓖麻油。正交试验优选得到的最佳处方为:艾纳香提取物∶甘油∶木糖醇∶食用香精的质量比为0.03∶5∶0.7∶0.02。采用优化处方制备的艾纳香口腔护理液初始抑菌率≥90%，具有较强的抑菌作用；经37℃、相对湿度＞75%下放置5个月后，抑菌率仍达到80%以上。结论本文所制得的艾纳香口腔护理液澄清透明、口感良好，抑菌作用稳定，具有较高的潜在市场应用价值。

艾纳香提取物；口腔护理液；溶解度试验；处方筛选；抑菌作用；抑菌稳定性

口腔为消化道的第一通道，因直接与外界接触，是最容易滋生细菌和微生物的部位。目前，相对于其他口腔护理产品，口腔护理液不但具有携带方便、清除口腔异味、抑制牙菌斑等多种优点，而且还能治疗多种口腔疾病及其并发症，如因口疾引起的睡眠不良、精神紧张、消化不良等。在各种口腔护理液中，含精油类的口腔护理液天然无毒，具有渗透性强、使用后不会出现牙龈变色、菌群失调、继发感染等优点，虽含有酒精成分，但对口腔局部无害，市场上使用广泛。口腔护理液中的精油主要来源于植物各个部位的提取物，它们具有良好的挥发性和独特的芳香。这类口腔护理液因抗菌谱广、毒性低、过敏反应少、可以联合应用，在减少牙菌斑生长过程中，比传统口腔护理液更安全、刺激性更小，且因具有天然芳香气味及良好口感，能提高患者顺应性，受到越来越多消费者的青睐[1-3]。

艾纳香Blumea balsamifera(L.)DC.为菊科艾纳香属多年生木质草本植物，主要分布于我国海南、贵州、广西、广东、云南等省区。植物艾纳香芳香独特，以全草或地上部分入药，在黎族、苗族、壮族等少数民族地区有悠久的用药历史，是一种重要的民间药物[4-5]。艾纳香性温，味辛、苦，入肝、肾、膀胱经，具有温中活血、调经、镇痛、祛风除湿、祛痰止咳、治疗皮肤烧烫伤、晒后修复及透皮促渗透等多种功效。艾纳香中主要含有挥发油和黄酮类成分，具有较好的抑菌止痒、抗氧化、镇痛等药理活性[6-8]。

结合上述口腔护理液在治疗口腔疾病、维护口腔卫生的优势以及植物艾纳香的多种功效和活性，本研究拟制备一种以艾纳香提取物为原料的艾纳香口腔护理液，通过正交试验对其处方进行筛选，并通过体外抑菌试验考察其抑菌效果，为后续研究提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CPA225D电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；JB-3恒温定时磁力搅拌器(上海雷磁创益仪器仪表有限公司)；DHG-9070A电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；KQ-500DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；LAB DANCER S25旋涡混合器(德国IKA Lab Dancer)。

1.2 材料

菊科植物艾纳香叶的提取物采自贵州省罗甸县罗苏乡，经中国热带农业科学院庞玉新副研究员鉴定为菊科植物艾纳香Blumea balsamifera(L.)DC.叶水蒸气蒸馏法所得的初提物；乙醇(食品级，批号: 150118-85，河南浩宇食品添加剂有限公司)；甘油(批号:40690388-GA，连云港友进食品添加剂技术开发有限公司)；聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40，批号:32177616KO，德国BASF SE)；A.SAP(以大豆萃取液作为主成分的天然有机抗菌剂，批号:110420，福州圣德莉信息技术有限公司)；木糖醇(食品级，批号:13101606，山东福田药业有限公司)；食用香精(食品级，批号:20140926，上海华宝孔雀香精香料有限公司)。

试验菌种为金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC (F)98001]及肺炎克雷伯菌[ATCC13883]，以上菌种均由美国医学菌种保藏中心提供并经鉴定确定。

2 方法与结果

2.1 处方筛选

2.1.1 艾纳香提取物溶剂与促溶剂的筛选 因艾纳香提取物难溶于水，故选择一定体积分数的乙醇作为溶剂，并添加表面活性剂作为促溶剂。固定艾纳香提取物的质量分数为0.24%，以溶液澄清透明、无机械杂质为评价指标，考察采用15%、30%、40%(体积分数，下同)的乙醇作为溶剂时，Tween 80(吐温-80)、RH40(聚氧乙烯氢化蓖麻油)及SDS(十二烷基硫酸钠)3种应用较广的表面活性剂完全溶解艾纳香提取物所需的用量，结果见表1。

由表1可知，乙醇体积分数越高，溶解相同质量分数艾纳香提取物所需表面活性剂的用量越小；在相同乙醇体积分数下，溶解艾纳香提取物所需用量最小的表面活性剂是RH40；但乙醇体积分数较高时，口感刺激性较大，综合考虑，最终选定以体积分数15%的乙醇作为溶剂，RH40为促溶剂。

表1 采用不同体积分数乙醇作为溶剂时所需表面活性剂的用量Table 1 The comparison of content of surfactants in different concentrations of ethanol

2.1.2 艾纳香口腔护理液的制备方法 将艾纳香提取物用表面活性剂RH40及适量15%乙醇混合溶解后，再与质量分数0.2%的天然抑菌剂A.SAP及保湿剂、甜味剂等其他添加剂按比例充分混合，再用15%乙醇定容至50 mL，静置、滤过、灌装，即得。

2.1.3 正交试验筛选处方 在上述溶剂与促溶剂筛选的基础上，处方中进一步添加了保湿剂甘油、矫味剂木糖醇等辅料。本文以口感、澄清度、除臭效果为评价标准(随机抽取不同年龄段、不同性别的受试者50例，受试者在清晨未进食、进水、抽烟，不使用其他口腔护理产品漱口的情况下，直接使用艾纳香口腔护理液进行漱口，用1～5分记分:口感，很好5分，较好4分，一般3分，不好2分，极差1分；澄清度，澄清5分，较澄清4分，一般澄清3分，浑浊2分，非常浑浊1分；除臭效果诊断采用感观分析法[9]，用鼻进行辨析，5分为无气味，4分为很难闻到气味，3分为轻微不愉快气味，2分为中度不愉快气味，1分为强烈刺鼻气味)，采用4因素3水平的正交试验对艾纳香提取物、甘油、木糖醇及食用香精的加入量进行筛选，因素水平见表2，试验结果及方差分析结果见表3～表4。

表2 正交试验的因素与水平Table 2 The factors and levels of orthogonal test m/g

由表3～表4可知，各因素的影响大小为A＞C＞B＞D，即艾纳香提取物的加入量对处方的影响最大，具有统计学意义(P＜0.05)，其次是木糖醇加入量和甘油加入量，影响最小的是食用香精加入量，此3个因素的影响均无统计学意义。综合以上分析，确定艾纳香口腔护理液最佳处方配比为A1B2C3D2，即艾纳香提取物∶甘油∶木糖醇∶食用香精的质量比为0.03∶5∶0.7∶0.02。

表3 正交试验设计与结果Table 3 Results of orthogonal test

表4 正交试验方差分析结果Table 4 Results of variance analysis

2.2 抑菌性能及稳定性考察

本文选择金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌及肺炎克雷伯菌4种易引起口腔感染、炎症及口腔溃疡的细菌，分别考察艾纳香口腔护理液对上述4种细菌的抑菌效果，及在37℃恒温箱中、保持相对湿度＞75%放置5个月后的抑菌稳定性。

2.2.1 组别设置 以上述处方筛选得到的最佳配比制备的艾纳香口腔护理液作为供试液，对照液为生理盐水。

2.2.2 菌悬液的制备 分别将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌及肺炎克雷伯菌的24 h斜面培养物用PBS洗下，制成悬液，浊度为1麦氏(3× 108cfu/mL)。

2.2.3 菌液稀释 取上述菌液10 μL，用10 mL容量瓶定容，得到3×105cfu/mL菌液。

2.2.4 抑菌反应 分别取上述所得菌液0.1 mL，加至含有5 mL供试液及对照液的试管内，作用时间为2 min。分别取上述反应时间下的各溶液0.5 mL加入至含5 mL PBS的试管内，充分混匀，称为终止反应。分别取终止反应下的各溶液与适量PBS混匀，分别稀释1倍、5倍和10倍。取上述不同比例的稀释液各0.5 mL，至培养皿内，用放凉到40～45℃的营养琼脂培养基(细菌)或沙氏葡萄糖琼脂培养基(真菌)15 mL作倾注，转动培养皿，使充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，(35±2)℃培养24 h(白色念珠菌为48 h)，作活菌菌落计数。

2.2.5 抑菌稳定性 将上述艾纳香口腔护理液在37℃温箱、相对湿度＞75%条件下，放置5个月，重复“2.2.4”项试验步骤，测定抑菌率，考察抑菌作用的稳定性。根据《一次性使用卫生用品卫生标准》规定，抑菌率计算方式为:抑菌率＝(对照样品菌落数－供试样品菌落数)/对照样品菌落数×100%；评价标准为:产品经37℃存放3个月，相对湿度＞75%，抑菌率为50%～90%表明有抑菌作用，抑菌率≥90%表明有较强抑菌作用。

表5分别为初始试验与放置5个月后测得的艾纳香口腔护理液与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌及肺炎克雷伯菌作用时间为2 min、稀释倍数分别为1倍、5倍、10倍下的抑菌率结果。可见，艾纳香口腔护理液对大肠埃希菌及白色念珠菌的作用效果稍强于金黄色葡萄球菌及肺炎克雷伯菌。另外，该处方下的艾纳香口腔护理液与不同菌种作用2 min，稀释倍数分别为1倍、5倍、10倍时，初始测得的抑菌率均≥90%，在温度37℃、相对湿度＞75%下放置5个月后的抑菌率仍达到80%以上，表明该艾纳香口腔护理液具有较强且稳定的抑菌作用。

表5 艾纳香口腔护理液抑菌试验结果Table 5 Results of bacteriostatic test of Blumea mouthwash

图1分别为艾纳香口腔护理液及生理盐水对照组与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌及肺炎克雷伯菌的作用时间为2 min、稀释倍数为10倍时菌落生长情况的对比图，可见艾纳香口腔护理液抑菌效果明显。

图1 艾纳香口腔护理液对4种细菌的抑菌效果Figure 1 The bacteriostatic effects of Blumea mouthwash on 4 kinds of bacteria

3 讨论

口腔护理液在治疗口腔疾病的同时，亦能清除因口疾引起的多种并发症，是老人、孩子及伴有牙痛的患者口腔卫生保障的首选[10]。本文研究的艾纳香口腔护理液，以芳香独特的艾纳香提取物为主要原料药，通过溶剂与促溶剂的筛选试验确定最终选定15%的乙醇作为溶剂，RH40为促溶剂，并配以相应的辅料及香精，采用三因素四水平正交试验法，以口感、澄清度及除臭效果作为评价指标，对艾纳香口腔护理液处方的用量配比进行筛选，由此筛选出的艾纳香口腔护理液澄清透明、无机械杂质，口感良好。研究表明，目前具有广阔市场前景的口腔护理液为抗菌型口腔护理液[11]，本文针对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌及肺炎克雷伯菌4种细菌对最优处方下的艾纳香口腔护理液进行抑菌试验及抑菌稳定性考察，结果表明由该配方制得的艾纳香口腔护理液具有较强抑菌效果，能有效减少口腔内的有害细菌，放置5个月后的抑菌效果仍达到80%以上，表明该艾纳香口腔护理液具有较稳定的抑菌作用。

综上所述，本研究的艾纳香口腔护理液澄清透明、无机械杂质，口感良好，具有较强的抑菌效果且抑菌作用稳定，能够很好地控制口腔内的致病微生物的数量，维护口腔的卫生健康，具有较高的市场应用和开发价值。

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(责任编辑:陈翔)

Study on the prescription screening and bacteriostatic effects of Blumea mouthwash

ZOU Jing1，2，3，YANG Quan1，PANG Yuxin2，3，WANG Kai2，3，FAN Zuowang1，2，3，LI Haiyan1，2，3
(1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.Tropical Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China，Danzhou 571737，China；3.Hainan Provincial Engineering Research Center for Blumea Balsamifera，Danzhou 571737，China)

ObjectiveTo study the prescription of the Blumea mouthwash，its bacteriostatic effect and the stability of bacteriostatic action in order to provide theoretical basis for the late product development.MethodsBlumea balsamifera extract was selected as raw material.The optimal formulation of the mouthwash was optimized by orthogonal design，which was evaluated by clarity of solution，taste and deodorization effect as major indexes.The bacteriostatic effects test in vitro and stability of bacteriostatic action placed under the 37℃ after five months later of the mouthwash were studied.Results15%ethanol was selected as the optimal solvent，and RH40 was selected as the optimal surfactant.The optimal formulation was obtained by the orthogonal experiment as follows:Blumea balsamifera extract∶glycerol∶xylitol∶edible flavor＝0.03∶5∶0.7∶0.02.The results of bacteriostatic test showed that bacteriostatic action of Blumea mouthwash was good with an initial bacteriostatic rate above 90%and it was stable after 5 months with abacteriostatic rate still above 80%.ConclusionThe formulated mouthwash is a colorless transparent liquid which has a good taste with stable bacteriostasis，so it is promising to have a high market application value.

Blumea balsamifera extract；mouthwash；solubility experiment；prescription screening；bacteriostatic effects；stability of bacteriostatic

R944.1

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.003

1006-8783(2015)05-0571-05

2015-07-03

国家自然科学基金项目(81374065)；贵州省黔科合重大专项项目(2013-6011)

邹婧(1991—)，女，2013级硕士研究生，Email:zj602395791＠126.com；通信作者:庞玉新(1975—)，男，博士，副研究员，主要从事南药资源研究与开发，电话:0898-23300268，Email:blumeachina＠126.com；杨全(1972—)，男，教授，主要从事中药资源方向的研究，电话:020-39352353，Email:yangquan7208＠vip.163.com。

时间:2015-09-25 14:23

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150925.1423.006.html