三棱抗氧化提取物提取工艺优化研究

关石凤，管淑玉，李洋，陈典，曾宇，陈超

三棱抗氧化提取物提取工艺优化研究

关石凤1，2，管淑玉1，3，4，李洋1，陈典1，曾宇1，3，4，陈超1，3，4

(1.广东药学院 中药学院，广东 广州 510006；2.广东药学院 附属第一医院，广东 广州510080；3.国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室，广东广州510006；4.广东高校中药质量工程技术研究中心，广东广州510006)

目的优化三棱抗氧化有效成分提取工艺。方法以三棱提取物对1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)清除率为响应值，以乙醇体积分数、提取时间、液料比为考察因素，采用响应面分析法优化三棱的提取工艺。结果响应面分析法得出三棱抗氧化有效成分的最佳提取工艺条件为:乙醇体积分数为72%，液料比为20∶1(mL∶g)，提取时间为1 h，提取2次。在此条件下三棱清除率为57.28%，与理论值56.59%基本相符。结论通过响应面分析法优化三棱抗氧化物质提取工艺条件简单可行，可用于三棱中抗氧化有效成分的提取。

三棱；抗氧化；响应面分析法；提取工艺优化

三棱系黑三棱科植物黑三棱 Sparganium stoloniferumBuch.-Ham削去外皮的干燥块茎，味苦、性平，入肝、脾经，具有破血行气、消积止痛等功效，是活血化瘀的常用中药[1]，临床多用醋制品。本课题组前期研究发现，醋三棱提取物有较强的抗氧化活性，本研究通过响应面分析法优选三棱抗氧化活性成分的提取工艺，为三棱药材资源的开发和综合利用提供依据。

1 仪器与试药

醋三棱药材(批号:141001)购于广东致信中药饮片有限公司，经广东药学院中药学院刘基柱副教授鉴定为黑三棱科黑三棱Sparganium stoloniferum Buch-Ham干燥块茎醋制品，符合《中国药典》2010年版规定；95%(体积分数，下同)乙醇(天津百世化工有限公司，分析纯，批号:20130928)；盐酸(广州市东红化工厂，分析纯，批号:20100320)；1，1-二苯基-2-苦肼基[DPPH，阿拉丁试剂(上海)有限公司，分析纯，批号:K1319045]；水为超纯水。

UV2450紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；HH-4恒温水浴锅(江苏省金坛市杰瑞尔电器有限公司)；FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；FA10048B电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 药材与试剂的前处理

2.1.1 三棱药材的处理 称取三棱药材粗粉1 g，乙醇回流提取2 h，滤过，备用。

2.1.2 0.1 mmol/L DPPH溶液的配制 精密称定DPPH 3.94 mg，加95%乙醇使溶解，并用95%乙醇定容至100 mL量瓶中，置于冰箱，备用。

2.2 DPPH自由基的清除试验

分别量取各提取液2 mL于试管中，分别加入DPPH溶液2 mL，摇匀，置于阴暗处反应30 min，在517 nm处测定吸光度值，记为Ai；再分别量取提取液2 mL，分别加入95%乙醇2 mL，摇匀，置暗处30 min测吸光度值，记为Aj；再分别量取95%乙醇2 mL，分别加入DPPH溶液2 mL，摇匀，置暗处30 min后测吸光度值，记为A0。按以下公式计算清除率:清除率＝[1－(Ai－Aj)/A0]×100%。

2.3 响应面试验设计优化提取工艺

依据预试验结果，固定提取次数为2次，选取乙醇体积分数、液料比、提取时间为响应变量，试验的因素与水平见表1，根据Box-Behnken中心组合设计建立三因素三水平数学模型[2]，以DPPH清除率(Y)为响应值，利用Design Expert 8.05b软件对表2数据进行拟合，得到DPPH清除率(Y)对乙醇体积分数(A)、液料比(B)、提取时间(C)的二次多项回归模型:Y＝49.53－2.76A＋7.19B＋11.08C＋7.20AB－9.93AC－3.29BC－9.06A2－1.33B2－13.66C2。

表1 响应面试验的因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

表2 响应面法设计与试验结果Table 2 The design and test results of the response surface method

由表3可知，回归模型的P＜0.01，表明该模型整体达到高度显著水平，即用该回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，因变量与全体自变量之间的关系是显著的，说明该方法是可靠的。失拟项P＝0.065 7＞0.05，差异没有统计学意义，表明无失拟因素存在，因此可以用该模型分析和预测三棱抗氧化有效成分提取。各因素中一次项A(乙醇体积分数)和二次项A2对抗氧化成分的提取影响差异有统计学意义(P＜0.01)，一次项C(液料比)和二次项AB、B2对抗氧化成分的提取影响差异有统计学意义(P＜0.05)；而B、AC、BC、C2对抗氧化成分的提取影响差异没有统计学意义(P＞0.05)，表明各影响因素与抗氧化成分提取率之间不是简单的线性关系。此外，从P值可看出各因素对三棱抗氧化提取物提取率的影响从大到小排列次序为A＞C＞B，即乙醇体积分数＞液料比＞提取时间。

表3 响应面分析拟合回归模型的方差分析结果Table 3 The results of variance analysis of fit regression model by response surface

响应面坡度陡峭程度和等高线椭圆形状反映出交互效应的强弱趋势，如果响应面坡度相对较平缓，表示可以忍受处理条件的变异，而不影响响应值大小；相反，如果坡度非常陡峭，表明处理条件的变异对响应值的影响非常大，即响应值对于处理条件的改变非常敏感[3]。如果等高线呈椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反[4]。为确定乙醇体积分数、液料比、提取时间3个因素和交互作用对三棱抗氧化提取物清除率的影响，固定乙醇体积分数、液料比、提取时间3个因素中任意一个变量为0，分别考察其余2个变量对三棱抗氧化提取物清除率的影响，结果见图1～图3。可见，3个因素之间的交互作用对三棱抗氧化活性成分的清除率的影响均不显著，表现为曲线较平滑，与方差分析结果相一致。

图1 乙醇体积分数和液料比对清除率影响的响应面和等高线Figure 1 The response surface and contour of ethanol volume fraction and the ratio of feed to liquid on the removal rate

图2 提取时间和乙醇体积分数对清除率影响的响应面和等高线Figure 2 The response surface and contour of the extraction time and ethanol volume fraction on the removal rate

图3 液料比和提取时间对清除率影响的响应面和等高线Figure 3 The response surface and contour of the ratio of material to liquid and extraction time on the removal rate

2.4 最佳提取工艺及验证

通过Design Expert 8.05b软件得到的三棱抗氧化最佳提取工艺为乙醇体积分数72.44%，液料比20∶1(mL∶g)，提取时间为1.06 h，提取2次，清除率理论值为56.59%，考虑实际操作方便性，选择最佳提取工艺参数:乙醇体积分数为72%，液料比为20∶1 (mL∶g)，提取时间为1 h，提取2次。按最佳工艺进行3次平行验证试验，得到DPPH自由基平均清除率为57.28%，与Design Expert 8.05b软件得到的理论值相比，相对误差为1.21%，表明优化结果可靠。

3 讨论

据文献报道，多数活血化瘀药如红花、丹参等均具有抗氧化活性。红花具有一定的清除羟自由基和超氧阴离子自由基的能力，尤其对羟自由基的清除效果很好，清除率达98.31%[5]。丹参中丹参素、原儿茶醛、咖啡酸和丹酚酸B均有较好清除超氧阴离子活性[6]。三棱是常用的活血化瘀药，其抗氧化活性尚未见文献报道，本研究首次发现三棱的抗氧化活性，为寻找高效、低毒的抗氧化新药及天然抗氧化剂提供理论依据。

响应面法的优点是在试验条件优化过程中可以连续地对试验因素的各个水平进行分析，克服了正交试验只能对一个个孤立的试验点进行分析和不能给出直观图形的缺陷，所以响应面法被广泛应用于试验设计与工艺优化研究[7]。本文结果发现，提取三棱抗氧化活性成分影响最主要的因素是乙醇体积分数，最佳提取工艺乙醇体积分数为72%，而提取黑三棱中黄酮类化合物的最佳工艺条件为乙醇体积分数66%[8]，据此推断，三棱抗氧化活性可能与三棱中黄酮类化合物有关，具体成分有待进一步研究。

[1]戴仕林，吴启南，殷婕.中药三棱的现代研究进展[J].中国民族民间医药，2011，17(1):63-64.

[2]侯淑珍，王景媛，王娜，等.响应面分析法优化牛蒡根多糖提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(11): 21.

[3]陈莉，屠康，王海，等.采用响应面法对采后红富士苹果热处理条件的优化[J].农业工程学报，2006，22(2): 159-163.

[4]徐媛，王鲁峰，徐晓云，等.响应面法优化红葡萄柚番茄红素的提取工艺[J].食品科学，2010，31(22):255-259.

[5]冯涛，阎婷婷，阎国荣，等.红花提取物清除自由基能力的初步研究[J].天津农学院学报，2010，17(1):6-9.

[6]夏鑫华，刘梅，张志敏，等.丹参中水溶性成分体外抗氧化活性研究[J].中华中医药学刊，2009，27(5):1085-1087.

[7]徐秀泉，虞倩，徐颖.赶黄草总黄酮超声提取工艺的响应面法优化及其体外抗氧化活性分析[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(18):38.

[8]林敏，李伟，吴冬青，等.基于响应面分析法优化的黑三棱黄酮提取条件[J].中国酿造，2014，33(2):55-58.

(责任编辑:陈翔)

Study on optimization of extraction process of Rhizoma Sparganii antioxidative components

GUAN Shifeng1，2，GUAN Shuyu1，3，4，LI Yang1，CHEN Dian1，ZENG Yu1，3，4，CHEN Chao1，3，4
(1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmacutical University，Guangzhou 510006，China；2.The First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmacutical University，Guangzhou 510080，China；3.Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica of State Administration of TCM，Guangzhou 510006，China；4.Engineering＆Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of the Universities of Guangdong Province，Guangzhou 510006，China)

ObjectiveTo optimize the extraction process of Rhizoma Sparganii antioxidant components was optimized by using Rhizoma Sparganii as raw materials.MethodsRhizoma Sparganii extractive on DPPH scavenging rate as response value，response surface methodology was used to optimize the extraction process by using volume fraction of ethanol，extraction time，liquid-solid ratio as factors.ResultsThe optimum conditions were as follows:the volume fraction ethanol 72%，liquid-solid ratio 20∶1(mL∶g)，extraction duration 1 h and extracting times twice.The Rhizoma Sparganii clearance rate was 57.28%，which was roughly in line with the theoretical value of 56.59%.ConclusionIt is simple and feasible to optimize the extraction of active ingredients of Rhizoma Sparganii antioxidant by using the response surface methodology，which can be used to extract the active ingredients of Rhizoma Sparganii antioxidant.

Rhizoma Sparganii；antioxidant； response surface methodology； extraction process optimization

R284.2

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.005

1006-8783(2015)05-0581-04

2015-07-16

国家自然科学基金项目(81001702)；广州市产学研协同创新重大专项项目(201508020016)

关石凤(1985—)，女，2012级在职硕士研究生，从事中药质量控制研究，Email:fengguan063＠163.com；通信作者:管淑玉(1976—)，女，博士，副教授，从事中药质量控制与生物活性研究，Email:guanshy3＠163.com。

时间:2015-09-25 14:20

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150925.1420.004.html