紫杉醇-汉防己甲素复合纳米粒的制备及其逆转MCF-7/ADR细胞多药耐药的研究

宁婷，李月，徐翀

(中国医科大学附属第一医院药学部，辽宁沈阳110001)

紫杉醇-汉防己甲素复合纳米粒的制备及其逆转MCF-7/ADR细胞多药耐药的研究

宁婷，李月，徐翀

(中国医科大学附属第一医院药学部，辽宁沈阳110001)

目的制备载有紫杉醇和汉防己甲素的复合纳米粒，并进行逆转肿瘤细胞多药耐药性研究。方法采用纳米沉淀法制备紫杉醇-汉防己甲素复合纳米粒，对其载药量、包封率、粒径进行测定，并对其体外释放行为进行考察。采用体外细胞毒试验和Western blot法考察复合纳米粒逆转多药耐药的效果。结果复合纳米粒的紫杉醇和汉防己甲素载药量分别为0.49%和0.20%，包封率分别为98.3%和99.6%，粒径为(107.3±15.6)nm。体外释放试验表明，紫杉醇和汉防己甲素几乎同步释放。MCF7/ADR细胞毒试验结果显示，相比于游离紫杉醇，紫杉醇-汉防己甲素复合纳米粒的IC50从6.7 μmol/L降为1.1 μmol/L。Western blot试验结果表明汉防己甲素有效地抑制了P-gp的表达。结论中药汉防己甲素能够有效地改善紫杉醇对耐药细胞株的耐药性。

紫杉醇；汉防己甲素；纳米粒；多药耐药性

癌症治疗目前的主要方法是化疗，化疗过程中产生的多药耐药(multidrug resistance，MDR)常常导致达不到预期的化疗效果。导致肿瘤细胞产生MDR现象的机制很多，其中由MDR-1编码的P-糖蛋白(P-gp)过表达是目前公认的主要的耐药机制[1-2]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是临床上应用广泛的一线抗癌药物，在乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤等的治疗中均有应用，PTX对敏感肿瘤具有良好的抗肿瘤效果，但随着MDR的出现，PTX的抗肿瘤效果大打折扣；因此，如何逆转MDR成为PTX临床应用急需解决的关键问题。

汉防己甲素(tetrandrine，TET)是从防己科植物块根中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱，具有直接抑制肿瘤细胞生长、化疗增敏及显著逆转MDR活性的作用[3-6]。聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)是美国FDA批准的可用于人体的生物可降解材料，近年来被广泛用于组织工程及药物载体研究中。本文采用PLGA同时包载PTX和TET，以期逆转PTX 的MDR，增加其临床疗效，采用纳米沉淀法制备双载药PTX/TET PLGA纳米粒，测定其粒径、Zeta电位、包封率、载药量等，并对其体外释放行为以及逆转MDR的性能进行考察。

1 材料与方法

1.1 试剂

紫杉醇(质量分数＞99.5%，武汉赛创科技有限责任公司)；汉防己甲素(质量分数＞99.0%，贝尔卡生物医药有限公司)；RPMI Medium 1640(美国Gibco BRL公司)；聚乳酸-羟基乙酸共聚物(质量比50∶50，相对分子质量90 000，大连美仑生物技术有限公司)；维生素 E聚乙二醇琥珀酸酯(D-alphatocohperyl polyethylene glycol succinate，TPGS，武汉国邦达医药化工股份有限公司)；小牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料研究所)；TRIzoL(Molecular Reseach Center公司)；SDS-PAGE次高分子量标准蛋白质(中国科学院上海生物化学研究所)；RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)；Western blot试剂盒(Protein DetectorTMWestern Blot kit BCIP/NBT System，KPL公司)；P-gp兔多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；抗 β-actin兔多克隆抗体(美国 Abgent公司)；二抗辣根过氧化氢酶(HRP)标记的驴抗兔IgG(美国Santa Cruz公司)；化学发光底物(ECL，美国Pierce公司)。

1.2 细胞株及培养

MCF7/ADR细胞是具有MDR1表型的耐药细胞系，由中国医学科学院血液学研究所提供。细胞接种于含质量分数10%胎牛血清的含双抗的RPMI-1640培养液中，置于37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，2～3 d传代1次。

1.3 载药纳米粒的制备

采用纳米沉淀法制备双载药PTX/TET PLGA纳米粒:将一定量的PTX(和)或TET与PLGA用乙醇溶解，配制成PTX质量浓度为0.5 mg/mL的乙醇溶液，移液枪移取20 μL，在搅拌过程中缓慢注入质量分数0.05%的TPGS水溶液中，持续搅拌2 h，除去乙醇，即得载药纳米溶液。

空白PLGA纳米粒同此法操作即得。

1.4 纳米粒的表征

吸取少量PTX/TET PLGA纳米粒混悬液滴至铺有碳膜的铜网上，滴加质量分数2%的pH 6.2磷钨酸溶液负染，自然晾干后，于透射电子显微镜(JEOL 1230)下观察纳米粒形态和粒径。取纳米粒混悬液适量，加10 mmol/L NaCl稀释后用Zetasizer Nano system粒径分析仪测定粒子粒径。

1.5 载药量和包封率的测定

将PTX/TET PLGA纳米粒混悬液1 000 r/min离心5 min，移液枪吸取上清液10 μL，加入乙腈90 μL，涡旋溶解，参考文献[7-8]方法，采用日本岛津的LC10AT高效液相色谱仪(HPLC)分别在 227、282 nm波长处测定PTX和TET的质量分数。

色谱条件:色谱柱为大连依利特Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μmol/L)，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，分离PTX和TET的流动相分别为乙腈-水(体积比35∶65)和甲醇-乙醚-三乙胺(体积比100∶1∶0.05)。按照以下公式计算包封率和载药量[9]:

包封率(EE)＝[上清液中PTX(TET)的量]/[加入的PTX(TET)的总量]×100%，

载药量(LE)＝[上清液中PTX(TET)的量]/[上清液中PTX(TET)的量＋PLGA的量]×100%。1.6 体外释放试验

[10]方法:pH7.4的磷酸盐缓冲溶液(含质量分数0.1%十二烷基硫酸钠)作为释放介质，吸取PTX/TET PLGA纳米粒溶液5.0 mL于透析袋(截留相对分子质量3 500)中，并将透析袋置于250 mL的释放介质中，于(37±0.5)℃、100 r/min条件下进行体外释放试验。定时取样2 mL，并适时补充2 mL新鲜介质，平行测定3次。

1.7 体外细胞毒性试验[11]

分别取对数生长期的MCF7/ADR细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞数约为7 000～8 000个。将细胞板置于37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育，待细胞贴壁生长后，分别加入不同药物浓度(0.01～12.5 μmol/L)的PTX、TET、PLGA空白纳米粒、双载药PTX/TET PLGA纳米粒、PTX与TET的混合物，培养48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，继续培养4 h后，吸出上清液，加入DMSO溶液150 μL，然后放置于培养箱培养10 min。用酶标仪检测各孔490 nm处的吸光度，记录结果，每组重复3次，每个浓度设4个复孔。

1.8 蛋白表达的Western blot检测[9]

1.8.1 细胞总蛋白提取及蛋白含量的测定 将MCF7/ADR接种到100 mm的培养皿中，采用不同载药纳米粒分别处理，48 h后，用细胞刮收集细胞。离心浓缩各实验组细胞，用预冷的PBS溶液漂洗细胞2次，离心弃上清后，加入预冷至0℃的裂解缓冲液1 mL，充分混匀后移入Eppendorf管中，0℃放置30 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清，保存蛋白样品于－20℃。BCA法测定所抽提蛋白浓度。电泳及转移:每道20 μL蛋白样品，加入等量2×SDS上样缓冲液，煮沸5 min后上样，以质量分数12%SDS PAGE电泳(85 V)3 h分离蛋白后，以恒流0.9～1 mA/cm2(硝酸纤维素膜)半干电转移2 h。1.8.2 Western blot方法 转移后的硝酸纤维素膜以质量分数5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗P-gp(1∶200)4℃孵育过夜，之后用1×PBST洗3次，每次5 min，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的驴抗兔多克隆二抗(1∶5 000)室温振摇孵育1 h，用1×PBST洗涤4次除去未结合的二抗，用ECL试剂盒曝光显影。内参选用β-actin。

2 结果

2.1 纳米粒的制剂学性质

通过调节PTX、TET与PLGA的比例，考察不同载药量及载药比纳米粒的包封率和载药量，结果见表1。可见，随着药物与PLGA质量比的增加，PTX/ TET PLGA纳米粒的载药量和包封率都有下降趋势；固定处方中PTX与PLGA的比例，调节TET的比例，结果发现，随着TET的增加，PTX与TET在PLGA纳米粒中的载药量和包封率均有下降趋势；因此，选取处方3进行后续研究，其典型透射电镜图见图1，动态光散射粒径测定结果见图2，平均粒径为(107.3±15.6)nm(n＝3)。

表1 PTX和TET与PLGA的比例对双载药纳米粒的载药量和包封率的影响(n＝3)Table 1 The effects of the ratios between PLGA and PTX and TET on the drug loading and the encapsulation efficiency

图1 PTX/TET PLGA纳米粒的透射电子显微镜图Figure 1 The transmission electron microscopy of PTX/TET PLGA nanoparticles

图2 PTX/TET PLGA纳米粒的动态光散射粒径Figure 2 The DLS particle size of PTX/TET PLGA nanoparticles

2.2 体外释放试验

体外释放结果(见图3)表明，PTX/TET PLGA纳米粒PTX和TET的释放均较缓慢，在12 h的累积释放率分别为26.0%和23.3%，72 h的累积释放率分别为58.2%和53.0%，二者释放基本同步，这将保证双载药PTX/TET PLGA纳米粒在肿瘤细胞内同时释放药物，以有效的产生协同作用。

图3 PTX/TET PLGA纳米粒的释放曲线Figure 3 The release profiles of PTX/TET PLGA nanoparticles

2.3 体外细胞毒性试验

从图4可见，空白PLGA纳米粒对MCF7/ADR细胞几乎没有抑制作用，TET的抑制作用也较弱，PTX/TET PLGA纳米粒呈现最强的肿瘤细胞抑制作用。根据抑制率和浓度的关系，采用IC50计算软件计算药物的IC50值，PTX、PTX与TET的混合物、双载药PTX/TET PLGA纳米粒作用于MCF7/ADR细胞48 h后的 IC50值计算结果分别为6.7、2.7、1.1 μmol/L，表明TET显著提高了PTX的体外抗肿瘤活性。

图4 各药物作用于MCF7/ADR细胞48 h后细胞的生长情况Figure 4 The cytotoxicities of the drugs against MCF7/ADR cells after 48 h incubation

2.4 TET对P-gp的影响

据文献[12-14]报道，TET可通过抑制P-gp产生克服MDR的作用；因此，本文分别对PTX、TET、PTX与TET的混合物、以及双载药纳米粒对P-gp的表达量进行了检测，结果见图5。结果显示，PTX给药轻微上调了P-gp的表达量，而TET的加入能显著下调MCF7/ADR细胞中P-gp的表达，纳米粒复合给药后，对P-gp表达的抑制作用更明显，这也是双载药纳米粒细胞毒性显著强于单独游离药物细胞毒性的原因之一。

图5 不同药物对MCF-7/ADR中P-gp表达的影响Figure 5 Effects of MCF-7/ADR cells on P-gp expression of various kinds of formulations

3 讨论

目前，研究耐药的相关机制和寻找有效逆转MDR已经成为肿瘤研究的热点。研究表明，P-gp的过表达是产生耐药性的主要原因之一[1-2]。关于P-gp抑制剂的研究很多，但所报道的抑制剂大多会产生不良作用。中药作为P-gp抑制剂较其他化学抑制剂有很多优点:作用靶点多，具有一定的肿瘤细胞杀伤作用，具有化疗增敏作用等[15-16]。这其中，TET逆转MDR的作用逐渐引起重视[13]。本文结果表明，通过有效抑制P-gp的表达，双载药PTX/TET PLGA纳米粒对MCF7/ADR细胞的杀伤力显著高于其他对照组。

在细胞毒以及对P-gp抑制作用的试验中，发现PTX/TET复合纳米粒的作用效果均比PTX、TET单独给药或者混合给药要好，这可能是由于药物单独给药时，由于药物溶解度小，导致在细胞培养介质中形成沉淀析出，从而导致细胞摄取量减少；而复合纳米粒给药时，药物包封在纳米载体中，可通过内吞作用摄取进入细胞中。

另外，本文结果表明，采用PLGA装载PTX和TET具有良好的同步缓释性能，这为两药协同作用的产生奠定了基础，但是药物的体外行为并不能完全反映其体内行为，还需要进一步对其药动学和体内药效学进行研究。

参考文献:

[1]SINGH M S，LAMPRECHT A.P-glycoprotein inhibition of drug resistant cell lines by nanoparticles[J].Drug Dev Ind Pharm，2015，in press.

[2]KAPSE-MISTRY S，GOVENDER T，SRIVASTAVA R，et al.

Nanodrug delivery in reversing multidrug resistance in

cancer cells[J].Front Pharmacol，2014，159(5):1-22. [3]YU V W，HO W S.Tetrandrine inhibits hepatocellular

carcinoma cell growth through the caspase pathway and G2/M phase[J].Oncol Rep，2013，29:2205-2210.

[4]LIU W，KOU B，MA Z K，et al.Tetrandrine suppresses proliferation，induces apoptosis，and inhibits migration and invasion in human prostate cancer cells[J].Asian J Androl，2015，in press.

[5]GAO J L，JI X，HE T C，et al.Tetrandrine suppresses cancer angiogenesis and metastasis in 4T1 tumor bearing mice[J].Evid Based Complement Alternat Med，2013，265 (61):1-12.

[6]CHEN T，JI B，CHEN Y.Tetrandrine triggers apoptosis and cell cycle arrest in human renal cell carcinoma cells[J].J Nat Med，2014，68:46-52.

[7]陈小欢，许杜鹃，夏泉，等.反相高效液相色潽法测定人血浆中紫杉醇的浓度[J].安徽医药，2012，16(1):35-37. [8]胡涛，朱华旭，郭立玮，等.快速膜乳化与喷雾干燥联用制备汉防己甲素纳米复合粒子及其表征[J].药学学报，2014，49(11):1607-1613.

[9]吴俊，严新，邵荣，等.阿霉素-姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯复方纳米粒的研制及逆转MCF-7/ADR细胞多药耐药的研究[J].中国生物工程杂志，2013，33(5):35-43.

[10]ZHANG Z，LEE S H，GAN C W，et al.In vitro and in vivo investigation on PLGA-TPGS nanparticles for controlled and sustained small molecule chemotherapy[J].Pharm Res，2008，25(8):1925-1935.

[11]辛建娟，段萍萍，朱亮，等.联合用药混合纳米胶束的制备与细胞毒性研究[J].广东药学院学报，2012，28(6): 583-587.

[12]ZHU X，SUI M，FAN W.In vitro and in vivo characterizations of tetrandrine on the reversal of P-glycoproteinmediated drug resistance to paclitaxel[J].Anticancer Res，2005，25(3B):1953-1962.

[13]JIN J，WANG F P，WEI H，LIU G.Reversal of multidrug resistance of cancer through inhibition of P-glycoprotein by 5-bromotetrandrine[J].Cancer Chemother Pharmacol，2005，55:179-188.

[14]CHEN L M，LIANG Y J，ZHANG X，et al.Reversal of P-gpmediated multidrug resistance by Bromotetrandrine in vivo is associated with enhanced accumulation of chemotherapeutical drug in tumor tissue[J].Anticancer Res，2009，29(11): 4597-4604.

[15]KARTHIKEYAN S，HOTI S L.Development of fourth generation ABC inhibitors from natural products:a novel approach to overcome cancer multidrug resistance[J]. Anti-cancer Agents Medicin Chem，2015，15(5):605-615. [16]KARS M D，GUNDUZ U，UNEY K，et al.Exploring a natural MDR reversal agent:potential of medicinal food supplement Nerium oleander leaf distillate[J].Asian Pac J Trop Biomed，2013，3:644-649.

(责任编辑:陈翔)

The preparation of paclitaxel-tetrandrine combined nanoparticles and its effect on overcoming multidrug resistance of MCF-7/ADR cells

NING Ting，LI Yue，XU Chong
(Department of Pharmacy，The First Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China)

ObjectiveTo prepare combined nanoparticles loading paclitaxel and tetrandrine and study its effect on overcoming multidrug resistance of tumor cells.MethodsThe combined nanoparticles were prepared using nano-precipitation methods.The drug loading，encapsulation efficiency and particle size were determined，and the release behavior in vitro was investigated.The effect of overcoming multidrug resistance was studied using MTT assay and Western blot assay.ResultsThe loading efficiency of the combined nanoparticles for paclitaxel and tetrandrine were 0.49%and 0.20%，respectively.The encapsulation efficiency of the combined nanoparticles for paclitaxel and tetrandrine were 98.3% and 99.6%，respectively.The mean particle size of prepared nanoparticles was(107.3±15.6)nm.In vitro release experiment showed that paclitaxel and tetrandrine were simultaneously released.Compared with free paclitaxel，the combined nanoparticles decreased IC50value from 6.7 μmol/L to 1.1 μmol/L.Western blot assay showed that the expression of P-gp was inhibited by tetrandrine.ConclusionsTraditional Chinese medicine tetrandrine could overcome the multidrug resistance of paclitaxel effectively.

paclitaxel；tetrandrine；nanoparticles；multidrug resistance

R944.9

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.002

1006-8783(2015)05-0566-05

2015-06-20

宁婷(1981—)，女，硕士，主管药师，主要从事药物新剂型的研究，电话:024-83282494，Email:nting1981＠163.com。

时间:2015-09-28 15:22

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150928.1522.006.html