狼牙刺种子总生物碱提取工艺优化

黎丹，白吉庆，王小平，胡锦苹，王金，王芳

狼牙刺种子总生物碱提取工艺优化

黎丹，白吉庆，王小平，胡锦苹，王金，王芳

(陕西中医药大学药学院，陕西咸阳712046)

目的优化狼牙刺种子总生物碱的提取工艺。方法采用正交试验方法考察提取时间、料液比、提取次数对狼牙刺种子总生物碱的提取率的影响，优选狼牙刺种子总生物碱较佳提取工艺。结果优选得到的狼牙刺种子总生物碱最佳提取工艺为:提取时间2 h，料液比1∶15(g∶mL)，提取次数为2次。按优化条件提取狼牙刺种子总生物碱的提取率为48.71 mg/g。结论优选得到的工艺稳定、可行，提取得到狼牙刺种子总生物碱质量分数高。

狼牙刺；种子；生物碱；正交试验

狼牙刺(Sophora viciifolia Hance)又名白刺花，为豆科槐属多年生灌木，分布于我国的河北、陕西、山西、河南、甘肃、四川、贵州等省，多生于海拔1 000 ～1 500 m的阳坡或河谷地带[1-2]，具有清热燥湿、凉血解毒、利湿消肿的功效，主要用于咽喉肿痛、热症出血、痈肿疗毒等[1]。狼牙刺含有苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱等多种生物碱[3-4]。文献报道此类生物碱具有杀虫抑菌、抗感染、抗心律不齐、抗肿瘤等多种活性[5-9]。目前，狼牙刺种子的文献报道主要集中在生物碱类成分的含量测定[2-4]，尚未见其总生物碱提取工艺的报道。为了考察狼牙刺种子总生物碱提取的最佳条件，通过预试验发现狼牙刺种子生物碱主要集中在亲水性较强部位，因此本文采用水提工艺，以正交试验设计优化狼牙刺种子总生物碱的水提工艺。

1 仪器与试剂

BT125D型双量程电子分析天平(赛多利斯股份有限公司)；UV-6100紫外可见分光光度仪(上海美谱达仪器有限公司)；Direct-Q 3UV纯化水机(默克密理博)。狼牙刺种子经陕西中医药大学白吉庆副教授鉴定为狼牙刺(Sophora viciifolia Hance)的种子；苦参碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号:110805-200508)；溴百里香草酚蓝、三氯甲烷、甲醇均为分析纯，水为纯化水。

2 方法

2.1 提取方法

选取提取时间(h)、料液比(g∶mL)、提取次数为考察因素，每个因素设3个水平，按L9(34)正交表进行试验，以总生物碱的提取率为评价指标，优化最佳提取工艺条件。正交试验的因素与水平见表1。

表1 正交试验的因素与水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

2.2 总生物碱质量分数的测定[10]

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取苦参碱对照品1.0 mg，置10 mL的容量瓶中，加无水甲醇溶解，定容至刻度，即得对照品溶液。

2.2.2 酸性染料缓冲溶液的制备 缓冲溶液的配制:取KH2PO427.22 g，加水溶解并稀释成1 000 mL，取50 mL，加0.2 mol/L NaOH溶液42.4 mL，再加水稀释至200 mL，即得[11]。

溴麝香草酚蓝缓冲溶液(pH7.6)的配制:精密称取溴百里香草酚蓝0.025 g，加入上述缓冲溶液200 mL，摇匀，即得。

2.2.3 苦参碱标准曲线的绘制 分别精密移取上述对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，置10 mL具塞试管中，分别加入溴麝香草酚蓝缓冲溶液3 mL，摇匀，再加入三氯甲烷5 mL，密塞，振摇2 min，转入分液漏斗中，静置30 min，分取三氯甲烷层，以相应的试剂为空白，在413 nm处测定吸光度，以苦参碱对照品的质量浓度(ρ)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程A＝0.055 1ρ＋0.003 9，r＝0.999 6(n＝5)，苦参碱对照品在1.00～10.03 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.4 样品测定 分别取狼牙刺种子2 g，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，按正交试验表进行试验，所得提取液即为供试品溶液。取以上供试品溶液适量，置10 mL具塞试管中，照“2.2.3”项下的方法，自“加入溴麝香草酚蓝缓冲溶液3 mL”起同法操作，依法测定吸光度，并计算提取率，即得。

2.2.5 验证试验 取狼牙刺种子2 g共3份，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，加15倍量的水，回流提取2次，每次2 h，合并滤液作为提取液，按照“2.2.4”项下的方法测定，计算总生物碱的提取率。

3 结果

3.1 提取工艺筛选结果

正交试验结果见表2，方差分析见表3。可见，影响总生物碱提取的主次因素为A＞C＞B，即提取时间＞提取次数＞料液比，3个因素对狼牙刺种子总生物碱提取率的影响均无统计学意义(P＞0.05)。结合生产实际情况以及正交试验结果，选择最佳提取工艺为A2B2C2，即提取时间为2 h，料液比(g∶mL) 为1∶15，提取次数为2次。

表2 正交试验设计与结果Table 2 Results of orthogonal test

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Results of variance analysis

3.2 验证结果

验证试验得到总生物碱提取量分别为48.24、48.76、49.14 mg/g，RSD值为0.93%，表明优选的工艺稳定可行。

4 讨论

4.1 提取方法及溶剂的选择

在预试验中用超声、回流等方法提取狼牙刺种子总生物碱，结果回流法提取所得总生物碱质量分数最高；因此本文采用回流提取法，分别对水、酸水、95%(体积分数，下同)乙醇、60%(体积分数，下同)乙醇几种溶媒进行考察，结果显示95%乙醇提取液中，总生物碱的质量分数最低，水、质量分数0.4%盐酸溶液和60%乙醇提取液中，总生物碱的质量分数差异不大，为了经济与方便，最终选择以水为提取溶媒进行正交试验。

4.2 检测波长的选择

分别取对照品溶液和供试品溶液，按“2.2.3”项下方法显色，于200～800 nm波长范围内进行扫描，结果表明，两者均在413 nm处有最大吸收，故选择413 nm为测定波长。

4.3 测定方法的选择

总生物碱的测定方法主要有酸性染料比色法、雷氏盐比色法和苦味酸盐比色法，最常用的是酸性染料比色法，该法的关键是酸性染料、pH值和萃取有机溶剂的选择；因此，本文对酸性染料的种类进行了选择，通过比较发现溴麝香草酚蓝最稳定，重现性最好，最终选择溴麝香草酚蓝作为染料。同时，对缓冲液pH(pH 6.0～8.0)、酸性染料缓冲液体积(2、3、4、5、6 mL)、萃取剂三氯甲烷的用量(4、5、6、7 mL)进行考察，结果表明，溴麝香草酚蓝pH＝7.6的缓冲溶液3 mL，三氯甲烷5 mL为最佳。4.4 正交试验优化提取工艺

通过对正交试验结果的分析可知，各因素对狼牙刺种子总生物碱的提取效果影响的主次顺序为A(提取时间)＞C(提取次数)＞B(料液比)，方差分析结果表明3个因素的影响均无统计学意义，其中料液比的影响最小，可能是由于溶剂量的增加使其他成分的溶出率增大，从而影响生物碱的溶出，导致提取率变化不大。

[1]徐杨，马志刚，张艳华，等.白刺花的生药学研究[J].中药材，2008，31(1):25-27.

[2]吴三桥，江海，李新生.狼牙刺不同器官中氧化苦参碱含量测定及分布规律[J].江苏农业科学，2009(4):303-305.

[3]李羽翡，江海，吴三桥，等.HPLC测定狼牙刺种子氧化苦参碱和氧化槐果碱含量[J].江苏农业科学，2009(2): 239-241.

[4]江海，吴三桥，李新生，等.HPLC法测定狼牙刺种子中苦参碱和氧化苦参碱含量[J].齐鲁药事，2008，27(12): 722-724.

[5]张娣，张亚梅，舒任庚，等.喹诺里西啶类生物碱的研究概括[J].江西中医药，2011，42(344):73-77.

[6]叶友进，王春雷，芦柏震.植物生物碱抗肿瘤的研究进展[J].医药导报，2012，31(7):901-904.

[7]吴琴，高云.氧化苦参碱药理作用的分子机制研究进展[J].中国药理学通报，2015，31(6):759-762.

[8]刘晶，李菁菁，李义飞，等.氧化苦参碱通过P38MAPK通路抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖[J].中国现代医学杂志，2015，25(10):10-14.

[9]季晓雯，张国伟.苦参生物碱的药理作用及临床应用[J].医学研究与教育，2014，31(6):85-88.

[10]张梅.苦参碱和氧化苦参碱的提取和纯化工艺及其抑菌、复盐研究[D].兰州:兰州理工大学，2012:51-63.

[11]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部[M].北京:中国医药科技出版社，2010:附录111.

(责任编辑:陈翔)

Optimization of extraction technology of total alkaloids in the seeds of Sophora
viciifolia Hance

LI Dan，BAI Jiqing，WANG Xiaoping，HU Jinping，WANG Jin，WANG Fang
(School of Pharmacy Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China)

ObjectiveTo optimize the extraction process of total alkaloids in the seeds of Sophora viciifolia Hance.MethodsThe orthogonal test was designed to evaluate the effects of extraction solvent ratio，time and number of times on total alkaloids yield.ResultsThe optimum extraction process was as follows: extracting for 2 times，solid-liquid ratio 1∶15(g∶mL)，and 2 hours each time，the total alkaloids yield was 48.71 mg/g.ConclusionThis optimized technology was stable and feasible with high extraction rate.

the seeds of Sophora viciifolia Hance；total alkaloids；orthogonal design

R284.2

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.007

1006-8783(2015)05-0589-03

2015-07-13

陕西省科技厅资助项目(2014K14-01-01)；陕西省教育厅资助项目(2013JK0834)

黎丹(1989—)，女，2013级硕士研究生，Email:307819478＠qq.com；通信作者:王小平(1976—)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事中药质量评价及新药开发研究，电话:029-38185165，Email:wangxiaoping323＠126.com。

时间:2015-09-25 14:30

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150925.1430.008.html