不同组合CD3、CD28抗体对CIK细胞诱导培养的探索研究

孙志亚，何 静，陈民佳，赵宗林

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所细胞生物治疗中心消化内科，重庆 400042)

·技术与方法·

不同组合CD3、CD28抗体对CIK细胞诱导培养的探索研究

孙志亚，何 静△，陈民佳，赵宗林

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所细胞生物治疗中心消化内科，重庆 400042)

目的 探索利用CD3、CD28抗体对人外周血单个核细胞(PBMC)体外激活转化增强作用，采用不同包被方法及抗体浓度，以期获得一种更有效的包被方法。方法利用人外周血单个核细胞分离技术、体外细胞培养技术及流式细胞术(FMC)，以CD3抗体固相包被、CD28抗体不同浓度固相包被或悬浮加入，计算经12 d培养获得成熟CIK细胞的数量，测定不同包被方法刺激培养后的细胞表型的变化。结果培养后C组中CD4+细胞百分比明显低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。C组中CD8+细胞所占比例高于A、B组(P<0.05)。C组的T4/T8比值与A、B组差异有统计学意义(P<0.05)。B组NK细胞含量与C组差异有统计学意义(P<0.05)。CD25+细胞在C组中所占比例低于A组(P<0.01)。结论CD3抗体固相包被及CD28抗体悬浮加入组合对人外周血细胞的刺激增强作用强于CD3抗体固相包被CD28+抗体固相包被组合。

流式细胞术；CIK细胞；固相包被

早在1999年就有研究利用CD3、CD28抗体体外扩增活化T淋巴细胞，激活表型为CD8+CD25+的具有杀伤活性的细胞，回输到免疫力低下的肿瘤患者体内，从而提高肿瘤患者的生命质量，延长寿命[1]。CIK细胞是从外周血中分离出的单个核细胞，在体外经多种细胞因子刺激、培养后获得的一群异质细胞群，将其转入宿主体内建立长期的特异性抗肿瘤免疫效应，具有很好的应用前景[2]。本研究利用CD3、CD28抗体对人外周血单个核细胞(PBMC)体外扩增转化增强作用，采用不同包被方法及抗体浓度，相互比较，探索一种更有效的包被方法。

1 材料与方法

1.1 材料 人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限公司)；12孔板、6孔板(NUNC公司，美国)；AB血浆由重庆市血液中心提供；CD3、CD28抗体(Invitrogen公司)；白细胞介素2(IL-2)(北京四环制药有限公司)；白细胞介素7(IL-7)等细胞因子(Invitrogen公司)；GT-T551培养基(宝日医生物技术有限公司)；3111 型CO2培养箱(Thermo公司,美国)；A2型生物安全柜(Thermo公司，美国)；流式细胞仪(美国贝克曼HPC-100)。

1.2 方法 (1)抗体包被：取12孔板，分3组包被：A组抗体CD3浓度2 mg/L、CD28浓度2 mg/L；B组抗体CD3浓度2 mg/L、CD28浓度5 mg/L；C组抗体CD3浓度5 mg/L。分A、B、C3组包被，每组8孔重复，每孔250 μL包被液。室温静置3 h，4 ℃保存备用。(2)取同一肿瘤患者外周血50 mL，利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞[2]，细胞计数，按照1×106个/孔重悬于1号培养基(培养基GT-T551中加入人干扰素γ(γ-IFN)100万IU/L、IL-2 100万IU/L、 IL-1β 100万IU/L、 IL-7 40 μg /L)中，并接种于去除包被有抗体CD3、CD28 的16孔中；同样按照1×106个/孔重悬于2号培养基(培养基GT-T551中加入γ-IFN 100万 IU /L、IL-2 100万 IU /L、 IL-1β 100万 IU /L、 IL-7 40 μg /L、抗体CD28 50 μg/L)中，并接种于去除单独包被有抗体CD3 的8孔中。均加入10%AB血浆，37 ℃、5% CO2恒温培养箱培养。(3)培养至第5天，将各孔细胞重悬，接种于6孔板中。每孔分别补加3号培养基(培养基GT-T551中加入IL-2 100万 IU /L、IL-1β 100万 IU /L、IL-7 40 μg /L)3 mL，并加入10%AB血浆，37 ℃、5%CO2恒温培养箱继续培养。(4)培养至第7天，将6孔板中各孔细胞转移至25 cm2的培养瓶中，每瓶补加12 mL 4号培养基(培养基GT-T551中加入IL-2 100万 IU /L)，并加入10%AB血浆，37 ℃、5%CO2恒温培养箱培养。(5)每天观察细胞生长状态，培养至12 d收集细胞，进行细胞计数，取样检测细胞分型。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism-4.0软件包处理，进行多组间One-Way ANOVA Test，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组细胞的生长状态与培养至第12天收集的细胞数量比较 显微镜下观察可见红细胞逐渐退化，第3天开始细胞由圆形逐渐变为不规则形态，且体积变大，呈聚集态生长。第7天细胞铺满平板，细胞逐渐均一化。第12天细胞成熟，呈圆形，单个细胞饱满透亮，见图1。

A：第0天；B：第3天；C：第7天；D：第12天。

图1 细胞生长状态(×100)

2.2 12 d后淋巴细胞数量变化及活率 经过12 d诱导培养后，3组细胞数量迅速扩增，其中C组达到(0.66±0.03)×108个,显著高于A组[(0.58±0.04)×108个，P<0.05]，较B组[(0.61±0.02)×108个]差异无统计学意义(P>0.05)。3组细胞经过12 d培养后，细胞活率均达到97%以上，组间差异无统计学意义(P>0.05)。

*：P<0.05，C组与A组比较。

图2 T4细胞比例

*：P<0.05，与C组比较。A：C组T8细胞流式检测；B：T8细胞比例。

图3 T8细胞

2.3 诱导PBMC后流式分析 抗体诱导培养后的细胞经流式细胞仪检测，3组细胞总成熟的T细胞百分比均达到90%以上，但3组间差异无统计学意义(P>0.05)。培养后C组中CD4+细胞百分比明显低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)，其他组间差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。而C组中CD8+细胞所占比例高于前两组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。T4/T8比值作为CIK细胞的重要指标，C组明显低于前两组，且与A组差异有统计学意义(P<0.01)，与B组差异有统计学意义(P<0.05)。

经流式检测，CIK细胞中含有部分NK细胞，但所占比例不高，B组与C组差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。具有免疫抑制功能的CD25+细胞在C组中所占比例低于A组，且差异有统计学意义(P<0.01)，见图5。

*：P<0.05，B组与C组比较。

图4 NK细胞比例

*：P<0.01，A组与C组比较。

图5 CD3+CD25+细胞比例

3 讨 论

T细胞在机体内发挥着重要的作用。它不仅有直接的免疫功能，而且能够产生多种细胞因子及表达黏附分子等，与其他的免疫细胞共同作用发挥强大的免疫共调节作用。目前国内外已将体外诱导活化的T淋巴细胞用于过继性免疫治疗[3-4]。

本试验比较了相同浓度CD3固相包被与不同浓度CD28固相包被及悬浮加入刺激诱导培养后CIK细胞的生长状态、增殖能力、细胞表型。试验结果表明：CD28抗体悬浮加入培养的CIK 细胞经流式检测CD4+、CD3+CD25+均明显低于CD28抗体固相包被方式培养的CIK细胞，而前者中的CD8+细胞比例却高于后者，CD3固相包被、CD28悬浮加入的效果比CD3固相包被、CD28固相包被的效果好。镜下观察外周血单个核细胞在细胞因子的刺激诱导下，细胞迅速增殖，形态发生改变，呈聚集生长并逐渐均一化，培养至12 d成熟，细胞透亮饱满，与之前研究报道相一致[5]。

CD3抗体刺激T细胞活化(即包被)，原理是固相结合的高密度CD3抗体可引起T细胞TCR-CD3复合体的交联，产生活化信号，刺激T细胞活化增殖。研究证实，液相单一加入CD3单抗在不同浓度下均不能刺激单个核细胞增殖[6-7]，故本试验中使用CD3单抗固相包被。CD3单抗包被浓度依据细胞生长的需要来选择[8]。常用包被抗体浓度是5 mg/L，高浓度可以快速刺激T细胞活化增殖，但活化诱导的凋亡作用(AICD)也很明显。结合临床CIK细胞的培养方法，本试验中CD3单抗包被浓度分别选择了2 mg/L及5 mg/L。细胞12 d诱导成熟，未见明显凋亡现象，且5 mg/L组效果优于2 mg/L组。

近年来，对T细胞活化的研究已从单一分子机制发展到多分子的综合研究[9-10]。CD28分子已充分被证实是经由TCR/CD3激活T细胞的重要共刺激分子，在TCR被抗CD3单抗预激活的细胞中，当CD28与其配体结合后，诱导细胞内酪氨酸磷酸化，使T细胞充分活化[1]。研究证实CD28单抗呈非剂量依赖型，当采用10 μg/L低剂量时即可协同CD3引起较强的扩增效果，在100 μg/L时达到高峰[11]。本试验中CD28单抗也采用了固相包被与液相加入两种方法。为避免高浓度引起细胞凋亡，故CD28单抗液相加入浓度采用50 μg/L，结果证实CD28单抗液相加入效果明显优于固相包被，具体原理有待深入研究。本研究将进一步研究不同时相点细胞的增殖速度计数量变化，从而为临床培养CIK细胞提供了一种可参考的方法。

[1]骆群，吕明，于鸣，等．抗CD28抗体协同刺激增强抗CD3抗体体外激活T淋巴细胞并降低TGF-β的表达[J]．中国实验血液学杂志，2006，14(3)：547-551．

[2]李娟，张国俊．CIK细胞过继免疫治疗的现状及研究新进展[J]．中国实用医刊，2012，39(10)：92-94．

[3]王惠成，冯毅，戴国华．CIK细胞免疫治疗原发性肝癌的研究进展[J]．国际消化病杂志，2011，31(4)：223-227．

[4]沈丽琴，戴宏，庄志祥．GIK细胞在肿瘤免疫治疗中的作用[J]．苏州大学学报:医学版，2009，29(3)：494-496．

[5]王岩，刘蓉芳，晁玉琴．包被抗人CD3单克隆抗体对CIK细胞生长影响的研究[J]．检验医学与临床，2012，9(4)：413-414,417．

[6]Shi Y,Wu W,Wan T,et al.Impact of polyclonal anti-CD3/CD28-coated magnetic bead expansionMethodson T cell proliferation,differentiation and function[J].Int Immunopharmacol,2013,15(1):129-137.

[7]Majowicz A,Van Der Marel S,Te Velde AA,et al.Murine CD4+CD25+cells activated in vitro with PMA/ionomycin and anti-CD3 acquire regulatory function and ameliorate experimental colitis in vivo[J].BMC Gastroenterol,2012,12:172.

[8]骆群，黎燕．CD3、CD28抗体增强淋巴细胞转化功能的研究[J]．军医进修学院学报，2005，26(6)：479-480．

[9]Cermák L,Símová S,Pintzas A,et al.Molecular mechanisms involved in CD43-mediated apoptosis of TF-1cells[J].J Bioll Chem,2002,277(10):7955-7961.

[10]李静，王菲，刘艳芬，等．不同刺激物对细胞因子诱导的杀伤细胞分泌细胞因子的影响[J]．郑州大学学报:医学版，2014，49(2)：166-168．

[11]罗志刚，谢江波．CD3McAb、CD28McAb、CpG ODN刺激PBMC活化的研究[J]．南华大学学报:医学版，2003，31(4)：379-382,385．

The effect of monoclonal antibody coated with anti-human CD3 and CD28 on CIK cells growth

SunZhiya,HeJing△,ChenMinjia,ZhaoZonglin

(CellBiologicalCenter,DepartmentofGastroenterology,DapingHospital,ResearchInstituteofSurery,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042，China)

Objective To explore the enhancing effect of monoclonal antibody coated with anti-human CD3 and CD28 on activation and transformation of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) in vitro.MethodsHuman peripheral blood mononuclear cells were separated.Cells was cultured in vitro,and determined by flow cytometry.The solid phase with CD3 and CD28 antibody was coated and added in.The mature CIK cells were obtained after 12 days culturing.ResultsThe CD4+cells was lower in group C than those in group A(P<0.05).The CD8+cells was higher in group C than that in group A and B(P<0.05).There was significant difference of T4/T8 between group C and group A and B(P<0.05).There was significant difference of NK cells between group B and group C(P<0.05).The CD25+cells was lower in group C than that in group A (P<0.01).ConclusionCD3 antibody solid coated combined with CD28 antibody added to the suspension has more strong activation than both CD3 antibody and CD28 antibody solid coating on peripheral blood mononuclear cell.

flow cytometry;CIK cell;immobilization on solid phase materials

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.22.026

孙志亚(1982-)，助理研究员，硕士，从事肿瘤细胞免疫治疗研究。△

，E-mail:hejingwang@126.com。

R-331

A

1671-8348(2015)22-3096-03

2015-02-18

2015-07-09)