汉防己甲素对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响

阮 林 金文香 许阳英 连肖强 李 莉 黄焕森

广州医科大学附属第二医院麻醉科，广东广州510260

汉防己甲素对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响

阮 林 金文香 许阳英 连肖强 李 莉 黄焕森

广州医科大学附属第二医院麻醉科，广东广州510260

目的观察汉防己甲素(Tetrandrine，TET)对小鼠脑缺血再灌注损伤的影响，从内质网应激(ERS)角度探讨其分子机制。方法随机将雄性Balb/c小鼠90只分为假手术组(S组，n=30)、缺血再灌注组(I/R组，n=30)与TET处理组(n=30)，HE染色观察病理结果，神经功能缺陷评分评价脑损伤情况，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测脑梗死体积，干湿重法计算脑含水量，western blot法检测缺血侧大脑皮层ERS和凋亡蛋白表达。结果与S组比较，I/R和TET组神经功能学评分(NDS)评分和脑含水量升高(P＜0.05)，脑梗死体积增大(P＜0.05)，GRP78、CHOP和caspase-12表达上调(P＜0.01);与I/R组比较，TET组NDS评分和脑含水量降低(P＜0.05)，脑梗死体积减小(P＜0.05)，GRP78、CHOP和caspase-12表达下调(P＜0.05)。结论TET显著减轻小鼠脑组织I/R损伤，与降低I/R诱导的ERS和ERS介导的细胞凋亡有关。

汉防己甲素;缺血再灌注;内质网应激;损伤

缺氧缺血、自由基产生及Ca2+稳态破坏等引起内质网功能障碍，触发内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，表现为ERS标志分子物葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78，GRP78)表达和相关细胞凋亡途径，如C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)和半胱天冬酶-12(caspase-12)的激活，加重缺血损伤［1-4］。缺血再灌注是急性脑梗死再通后、心跳骤停、休克常见的病理生理过程。汉防己甲素(Tetrandrine，TET)是防己科粉防己的主要活性成分，为双苄基异喹啉类化合物，具有镇痛、抗感染、改善微循环的作用［5-6］。本研究观察TET是否抑制过度ERS反应而减轻脑缺血再灌注损伤，以阐明减轻缺血再灌注损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组

雄性Balb/c小鼠90只，8周龄，广东省实验动物中心提供，用随机数字表法将其分为三组(n=30):假手术组、缺血再灌注组和TET处理组。假手术组只分离颈总动脉，缺血再灌注组和TET处理组制备模型。后TET处理组于再灌注开始腹腔注射TET 30 mg/kg(上海阿拉丁试剂，纯度＞98%)，假手术组及缺血灌注组给予等体积生理盐水。

1.2 模型建立

线栓法制备小鼠右大脑中动脉缺血再灌注模型。2%异氟醚诱导下，分离右侧颈总动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉，夹闭颈内动脉远心端，颈总动脉分叉下方剪切口，将5-0的尼龙线插入颈内动脉1 cm。缺血2 h，拔掉线栓记为再灌注开始时间。

1.3 神经功能学(NDS)评分

每组取10只小鼠再灌注2 h和24 h行NDS评分。0分:无异常行为学;l分:提尾时左侧前肢不能伸直;2分:行走时向左侧旋转;3分:行走时向左侧倾倒; 4分:无自发活动，神志丧失。神经缺陷评分后进行后续HE染色和脑含水量测定。

1.4 HE染色

每组取5只小鼠于再灌注后24 h时，深麻醉下断头取脑组织，脱水后冰冻切片，HE染色，光镜观察病理结果。

1.5 脑含水量测定

每组分别各取5只小鼠深麻醉下断头取脑组织，缺血再灌注24 h后取缺血侧大脑组织，用电子天平称量其湿重。以120℃烘干。脑含水量=(湿重-干重)÷湿重×100%。

1.6 脑梗死体积测定

每组分别各取5只小鼠深麻醉下断头取脑组织，缺血再灌注24 h后去除嗅球、小脑及低位脑干，-20℃中冷冻20 min，行连续冠状切片，厚约2 mm，置于2% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)中，37℃下恒温避光孵育20 min，正常脑组织染成红色，梗死灶呈白色。4%多聚甲醛中固定20 min，Image Pro Plus 6.0软件分析脑梗死体积百分比。

1.7 western blot测定

每组分别各取15只小鼠，每个蛋白取5只小鼠进行western blot实验，深麻醉下断头取脑组织，缺血再灌注24 h后取缺血侧大脑皮质，裂解后上清BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE变性凝胶电泳，湿转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，GRP78、CHOP和caspase-12抗体(1∶1000，Santa cruz)4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL显色。Quantity One软件分析结果，β-actin为内参。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件包进行数据分析，计量资料数据以均数±标准差()表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，多组间均数两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜HE染色结果

光镜下假手术组小鼠大脑皮质区神经细胞体积未见异常，排列紧密，核仁清晰;缺血再灌注组小鼠缺血侧大脑皮质区神经细胞排列紊乱，出现大量红色神经细胞，出现胞核固缩，胞体缩小变形，尼氏体消失，胞质嗜酸性明显增强;TET处理组小鼠缺血侧大脑皮质区神经细胞体积增大，失去极性细胞，红色神经细胞较缺血再灌注组减少，神经细胞损伤更轻。

2.2 NDS评分结果

与假手术组比较，缺血再灌注组和TET处理组的NDS评分升高(均P＜0.05)。与缺血再灌注组比较，汉防己甲素处理组再灌注2 h和24 h的NDS评分显著降低(均P＜0.05)，见表1。

注:与假手术组比较，aP＜0.05;与缺血再灌注组比较，bP＜0.05;TET:汉防己甲素

2.3 脑含水量结果

缺血再灌注组再灌注24 h的脑含水量为(85.49± 0.78)%，而汉防己甲素处理组再灌注24 h的脑含水量为(82.68±0.19)%，与假手术组［(77.36±0.19)%］比较，缺血再灌注组和TET处理组的脑含水量升高(P＜0.05);与缺血再灌注组比较，TET处理组再灌注24 h的脑含水量显著降低(P＜0.05)。

2.4 脑梗死体积结果

假手术组不存在脑梗死区域，因此脑梗死体积为0。与假手术组比较，缺血再灌注组和TET处理组的脑梗死体积增大(P＜0.05)。缺血再灌注组和TET处理组再灌注24 h的脑梗死体积分别为(75.1±1.2)%、(37.2±6.3)%。与缺血再灌注组比较，TET处理组再灌注24 h的脑梗死体积显著减小(P＜0.05)。

2.5 western blot结果

与假手术组比较，缺血再灌注组和TET处理组再灌注24 h缺血侧大脑皮质GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表达上调(P＜0.01);与缺血再灌注组比较，TET处理组缺血侧大脑皮质GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表达下调(P＜0.05)。见表2。

表2 三组小鼠缺血侧大脑皮质GRP78、CHOP和caspase-12表达水平比较()

表2 三组小鼠缺血侧大脑皮质GRP78、CHOP和caspase-12表达水平比较()

注:与假手术组比较，aP＜0.01;与缺血再灌注组比较，bP＜0.05;TET:汉防己甲素;GRP78:葡萄糖调节蛋白78;CHOP:C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白;caspase-12:半胱天冬酶-12

组别只数GRP78 CHOP caspase-12假手术组缺血再灌注组TET处理组15 15 15 1.52±0.16 7.45±0.24a2.75±0.16ab1.36±0.33 10.76±0.54a2.68±0.24ab1.68±0.22 9.61±0.35a1.90±0.17ab

3 讨论

TET具有抗感染、降血压、抗脂质过氧化、逆转心脏和血管的重塑、防止细胞受损、改善微循环及Ca2+拮抗等作用［7-10］。笔者前期研究结果表明TET具有神经保护作用，但是具体的保护机制尚不清楚［11］。本研究显示，脑缺血再灌注小鼠经TET处理，再灌注后2 h和24 h时NDS评分降低，缺血侧脑梗死体积百分比减少，病理学损伤减轻，提示TET处理能减轻小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤。

脑缺血再灌注后内质网受到刺激，导致内质网内有大量错误蛋白蓄积，可以激活信号通路增加GRP78的转录，使GRP78的表达上调，引发UPR，发挥内质网自身保护作用，代偿不良刺激导致的细胞损害［12-15］。ERS引发的细胞凋亡通过激活下游的凋亡信号分子产生，包括CHOP和caspase-12［16-17］。CHOP是ERS特异的转录因子，属C/EBP转录因子家族成员，在没有发生ERS时表达量很低，产生ERS后，通过过表达诱导细胞凋亡。ERS引发细胞凋亡的另一个重要途径是caspases-12途径。caspase-12激活的主要分子机制就是钙机制，由于caspase-12位于内质网胞浆面，当内质网应激发生时，钙大量释放促使procaspase-12裂解，释放出caspase-12［18］。结果发现TET作用于缺血再灌注模型，使其脑组织GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表达水平降低，推论可能是通过减轻ERS反应来达到减轻缺血再灌注损伤的目的，起到神经保护的作用。

本研究为TET临床治疗脑缺血再灌注损伤提供了有力的理论依据，但有关TET在炎症、细胞凋亡等方面对脑缺血再灌注损伤的确切机制还有待进一步的深入研究。

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Effects of Tetrandrine on cerebral ischemia-reperfusion injury in mice

RUAN Lin JIN Wenxiang XU Yangying LIAN Xiaoqiang LI Li HUANG Huansen
Department of Anesthesiology,the Second Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University,Guangdong Province, Guangzhou 510260,China

ObjectiveTo investigate the protective effects of tetrandrine(TET)after mice ischemia reperfusion injury and analyze the molecular mechanism in the view of endoplasmic reticulum stress.MethodsThe male Balb/c mice were randomly divided into 3 groups:Sham group(Sgroup,n=30),Ischemia-reperfusion group(I/R group,n=30), and tetrandrine group(TET group,n=30).The pathological results were investigated by HE staining and the cerebral injury situation was evaluated by neurological deficit scores.Infract volume was measured by TTC staining,brain water content was measured by wet-dry weight method and expression of GRP78,CHOP and caspase-12 were measured by western blot.ResultsCompared with the S group,infarct volume,water content and expression of GRP78,CHOP and caspase-12 were significantly increased in I/R group and TET group(P＜0.05 or P＜0.01).Compared with the I/R group,infarct volume,water content,brain injury and expression of GRP78,CHOP and caspase-12 were significantly decreased in TET group(P＜0.05).ConclusionTET significantly alleviates focal cerebral ischem ia-reperfusion injury in mice and relates to inhibition of the endoplasmic reticulum stress and apoptosis.

Tetrandrine;Ischemia-reperfusion;Endoplasmic reticulum stress;Injury

R285

A

1673-7210(2015)03(a)-0004-03

2014-11-26本文编辑:卫轲)

广东省广州市卫生局中医药、中西医结合科研课题(编号20112A011038)。

阮林(1979.7-)，女，博士;研究方向:麻醉与器官保护。

黄焕森(1966.12-)，男，硕士，主任医师;研究方向:麻醉与器官保护。