肝纤维化大鼠阴虚证表征的观察及一贯煎的干预作用

刘文兰 油红捷 赵青舟 欧阳罗丹 高变娥 张 欣 车念聪

首都医科大学中医药学院，北京100069

肝纤维化大鼠阴虚证表征的观察及一贯煎的干预作用

刘文兰 油红捷 赵青舟 欧阳罗丹 高变娥 张 欣 车念聪

首都医科大学中医药学院，北京100069

目的检测肝纤维化大鼠的阴虚证表征，观察滋补肝肾中药一贯煎对阴虚证表征的影响。方法将48只雄性Sprague-Dawlay大鼠随机分为4组，正常对照组、模型组、阳性对照组、一贯煎组，每组12只。除正常对照组外，均建立CCl4致肝纤维化大鼠模型，在CCl4停止注射后3 d，一贯煎组每只动物给予相应浓度的一贯煎浓缩液2mL/200 g灌胃，1次/d。阳性对照组给予秋水仙碱灌胃，0.25mg/kg，1次/d。正常对照组和模型组按相同方法灌服等量生理盐水。4周后，检测各组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)等肝功能指标;通过HE染色评价肝脏炎症活动度(G)和纤维化程度(S);检测大鼠体重、舌面干湿度、舌面温度、舌微循环血流速度、饮水、大小便等阴虚证表征。结果①一贯煎在改善肝功能、减轻炎症、抗肝纤维化方面作用较好:一贯煎组ALT［(41.66±3.72)U］较模型组［(61.00±0.00)U］降低，差异有统计学意义(P＜0.05);一贯煎组AST［(146.03± 46.41)U］较模型组［(218.90±12.56)U］降低，差异有统计学意义(P＜0.05);一贯煎组炎症活动度［(1.00±0.00)］较模型组［(3.00±0.00)］降低，差异有统计学意义(P＜0.05);一贯煎组纤维化程度［(1.00±0.00)］较模型组［(2.00±0.00)］降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。②肝纤维化大鼠具有阴虚证的表征，一贯煎能够改善阴虚证的症状。体重:模型组的体重［(380.66±37.29)g］较正常对照组［(507.00±17.69)g］减少(P＜0.05);一贯煎组体重［(473.66±13.86)g］较模型组增高(P＜0.05)。舌面干湿度:模型组的舌面干湿度［(0.000 36±0.000 28)g］较正常对照组［(0.007 32± 0.001 26)g］减少(P＜0.05);一贯煎组舌面干湿度［(0.012 83±0.005 85)g］较模型组增高(P＜0.05)。舌面温度:模型组的舌温度［(34.48±1.24)℃］较正常对照组［(30.63±0.80)℃］增高(P＜0.05);一贯煎组舌温度［(31.40±2.10)℃］较模型组降低(P＜0.05)。舌血流速度:模型组的舌血流速度［(69.78±21.44)AU］较正常对照组［(31.43±1.58)AU］增高(P＜0.05);一贯煎组舌血流速度［(40.50±3.89)AU］较模型组降低(P＜0.05)。饮水:模型组饮水量［(37.52±10.46)mL］较正常对照组［(59.65±6.05)mL］显著减少(P＜0.05);一贯煎组饮水量［(53.69±8.74)m L］较模型组显著增多(P＜0.05)。大便:模型组大便［(1.00±0.00)分］较正常对照组［(2.00±0.00)分］分值减少(P＜0.05);一贯煎组大便［(2.00± 0.00)分］较模型组分值增多(P＜0.05)。小便:模型组小便［(2.00±0.00)分］较正常对照组［(1.00±0.00)分］分值增高(P＜0.05);一贯煎组小便［(1.33±0.57)分］较模型组分值减少(P＜0.05)。结论肝纤维化大鼠具有阴虚证的特点，滋补肝肾中药一贯煎不仅能改善肝纤维化大鼠的病理，还能改善阴虚证的症状。该研究为肝纤维化大鼠阴虚证的诊断和药理机制的研究提供了新的思路。

肝纤维化;阴虚证;一贯煎

阴虚证是指阴液亏虚，不能制阳所致的虚热证候，又称虚热证［1］。其临床表现有咽干口燥，形体消瘦，潮热盗汗，颧红，五心烦热，小便短赤，大便干结，舌红少津少苔，脉细数。阴虚证是慢性乙型肝炎的常见证候［2］。肝纤维化是慢性乙型肝炎的常见病理表现［3］，肝纤维化大鼠是否具有阴虚证的表征?滋补肝肾中药除了改善肝纤维化病理外，对阴虚证表征是否存在影响?本研究制备CCl4致肝纤维化大鼠模型，观察该模型阴虚证的表征，提示滋补肝肾中药一贯煎除了改善肝组织病理外，对阴虚证表征也具备改善作用。

1 材料与方法

1.1 动物

Sprague-Dawlay大鼠，雄性，体重250～350 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK(京)2012-0001，共48只，饲养在首都医科大学实验动物科学部SPF级动物室。

1.2 仪器

激光多普勒血流仪，英国moorVMS-LDF;电子天平，德国Sartorius TE1502S;红外测温仪，SHANFENG型号SF530。

1.3 试剂

秋水仙碱:西双版纳药业有限责任公司，批号120412。橄榄油:阿果萨特级初榨橄榄油，原产国:西班牙(原装进口)，最大酸度0.4%，批号14001952。四氯化碳:四氯化碳分析纯专用试剂，纯度≥99.5%，北京现代东方精细化学品有限公司，批号20060132。一贯煎浓缩液的制备:根据一贯煎原方药物剂量和比例，选取北京同仁堂药店的标准中药北沙参9 g、麦冬9 g、当归9 g、生地黄20 g、枸杞子12 g、川楝子4.5 g，将饮片置煎煮容器内，加相当于药材量5～7倍的冷水浸泡1～2 h，煮沸30min，过滤。药渣加3～5倍量水继续煎煮，煮沸20min，过滤。合并2次滤液，按照体表面积计算，大鼠每100 g体重所需生药为0.65 g，将一贯煎浓缩液按照100 g大鼠灌胃1 m L的体积配成相应浓度，冷却装入灭菌药瓶，高温灭菌后，对pH值、比重、卫生学进行检测，置4℃冰箱保存备用。

1.4 实验方法

将实验大鼠随机分为4组，即正常对照组、模型组、阳性对照组、一贯煎组，每组12只。动物适应性饲养1周后，模型组、阳性对照组、一贯煎组每只动物制备CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型:大鼠腹腔注射50%CCl4橄榄油溶液(0.2 mL/100 g)，每周2次，共2周;随后腹腔注射0.1m L/100 g的CCl4橄榄油溶液，每周2次，共2周;接着腹腔注射0.05 mL/100 g的CCl4橄榄油溶液，每周2次，共2周。同时，正常对照组则以同样方法注射等量橄榄油。在CCl4停止注射后3 d，一贯煎组每只动物给予相应浓度的一贯煎浓缩液2mL/200 g灌胃，1次/d，连续4周。阳性对照组给予秋水仙碱灌胃，0.25 mg/kg，1次/d，连续4周。正常对照组和模型组按相同方法灌服等量生理盐水。

1.5 观察指标

治疗4周后，测量大鼠体重、食物、饮水量，记录大便、小便情况。大便干为1分，正常为2分，稀为3分;小便白为1分，黄为2分。在恒温的实验室，动物处于麻醉状态下，使用红外测温仪检测舌面温度;使用pH试纸和精密电子天平检测舌面干湿度;使用激光多普勒血流仪检测舌面微循环血流速度;使用SXOUTⅡ半自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)等肝功能指标;对石蜡包埋的组织切片进行HE染色，由同一名病理专家依据2000年中华医学会传染病与寄生虫病学分会和中华医学会肝病学分会联合修订的慢性肝炎分级分期标准［4］，对大鼠的肝脏炎症活动度(G)和纤维化程度(S)进行病理分级和分期诊断。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差()表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝功能检测

模型组的血清ALT、AST水平较正常对照组增高(P＜0.05)，说明该模型建立成功。一贯煎组ALT较模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.05);阳性对照组、一贯煎组AST较模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.05);结果提示，一贯煎能够改善肝纤维化大鼠的肝功能，具有保肝降酶的作用。见表1。

2.2 肝组织病理检测

模型组肝组织炎症活动度、纤维化程度与正常对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示肝纤维化大鼠模型建立成功。一贯煎组炎症活动度较模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.05);一贯煎组肝组织纤维化程度较模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。提示一贯煎能够改善肝纤维化大鼠肝组织的炎症程度和纤维化程度。见表1、图1。

表1 各组肝功能、炎症活动度、纤维化程度、阴虚证表征比较()

表1 各组肝功能、炎症活动度、纤维化程度、阴虚证表征比较()

注:与正常对照组比较，$P＜0.05;与模型组比较，※P＜0.05;ALT:丙氨酸氨基转移酶;AST:天门冬氨酸氨基转移酶;G:炎症活动度;S:纤维化程度

组别只数ALT(U)AST(U)G(级)S(期)体重(g)舌面干湿度(g)正常对照组模型组阳性对照组一贯煎组12 12 12 12 54.30±4.33 61.00±0.00$62.06±10.40 41.66±3.72※173.26±61.08 218.90±12.56$154.46±32.53※146.03±46.41※0.00±0.00 3.00±0.00$3.00±0.00 1.00±0.00※0.00±0.00 2.00±0.00$2.33±0.57 1.00±0.00※507.00±17.69 380.66±37.29$405.66±44.01 473.66±13.86※0.00732±0.00126 0.00036±0.00028$0.00610±0.00420 0.01283±0.00585※组别只数舌面温度(℃)舌血流速度(AU)食物(g)饮水(mL)大便(分)小便(分)正常对照组模型组阳性对照组一贯煎组12 12 12 12 30.63±0.80 34.48±1.24$33.86±0.98 31.40±2.10※31.43±1.58 69.78±21.44$56.73±18.76 40.50±3.89※23.25±1.30 22.50±0.73 26.30±13.17 21.65±4.12 59.65±6.05 37.52±10.46$30.90±0.85 53.69±8.74※2.00±0.00 1.00±0.00$1.00±0.00 2.00±0.00※1.00±0.00 2.00±0.00$2.00±0.00 1.33±0.57※

2.3 体重检测

模型组的体重较正常对照组减少(P＜0.05)，说明该模型形体消瘦。一贯煎组体重较模型组增高，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示一贯煎能够增加肝纤维化大鼠的体重。见表1。

图1 治疗后各组肝组织HE染色(200×)

2.4 舌面干湿度检测

模型组的舌面干湿度较正常对照组减少(P＜0.05)，提示该模型存在口干症状。一贯煎组舌面干湿度较模型组增高，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示一贯煎能够改善肝纤维化大鼠的口干症状。见表1。

2.5 舌温度检测

模型组的舌温度较正常对照组增高(P＜0.05)，提示该模型体温偏高。一贯煎组舌温度较模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示一贯煎能够改善肝纤维化大鼠的阴虚内热症状。见表1。

2.6 舌血流速度检测

模型组的舌血流速度较正常对照组增高(P＜0.05)，提示该模型血流速度偏快。一贯煎组舌血流速度较模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示一贯煎能够降低肝纤维化大鼠的血流速度。见表1。

2.7 食物和饮水检测

各组间食物量差异无统计学意义(P＞0.05)，模型组饮水量较正常对照组显著减少(P＜0.05)，提示该模型动物口干但不欲饮;一贯煎组饮水量较模型组显著增多(P＜0.05)。见表1。

2.8 大便和小便检测

正常对照组大鼠小便颜色淡白，大便正常，模型组大鼠小便颜色变黄，大便干硬，两组评分比较差异有统计学意义(P＜0.05)，提示该模型存在阴津损伤的病理。一贯煎组小便颜色浅黄，大便较正常，与模型组评分比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

3 讨论

虽然动物和人存在很大差异，动物模型的证候诊断较难进行，然而经过大量的研究，动物模型证候表征的评价方法逐渐成熟。研究观察到大鼠/小鼠大量的症状和体征变化，包括毛发光泽、蜷缩、扎堆、胃寒喜暖、活动减少、行动呆滞、弓背、发抖、精神萎靡、消瘦、倦怠、欲睡、食欲不振、眼中无神、唇周发黑、便溏、肛门红肿充血、体温变化、心率变化、舌色变化、爪色变化、分泌物变化等。这些外在表征，在一定程度上反映了动物当时的证候类型。因此，这些外在表征也成为了证候模型评价的重要指标群［5-8］。

既往对于实验动物阴虚证候的诊断，主要从以下几方面进行判断:体重(相当于形体消瘦);温度(相当于身热);饮水(相当于口干);汗出(相当于盗汗);食物;爪、尾红色程度(相当于五心烦热);大便;小便;毛发干枯;烦躁易怒;皮毛光泽度;行动迟缓;反应迟钝等［9-13］。根据临床阴虚证患者的症状表现，本研究选择体重(相当于形体消瘦)、舌面温度(相当于身热)、舌面干湿度(相当于口干)、舌血流速度(相当于脉数)、饮水情况、大便(反映津液损伤情况)、小便(反映津液损伤情况)7项指标作为判断阴虚证大鼠的表征。研究结果提示，肝纤维化大鼠体重减轻，舌面变干，舌血流速度增高，大便干，小便黄，饮水减少，但食物没有明显变化。提示CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型中医证候更类似于阴虚证，而不是脾虚证。

本研究制备肝纤维化大鼠模型，采用滋补肝肾中药对其进行干预，研究结果提示，滋补肝肾中药一贯煎不仅能改善该模型大鼠的肝功能，减轻肝组织的炎症程度和纤维化程度，对于阴虚证相关的表征也有一定的改善作用，一贯煎组大鼠在体重(消瘦)、舌面干湿度(口干)、舌面温度(身热)、舌血流速度(脉数)、大小便(津液损伤)、饮水(津液损伤)等方面较模型组差异均有统计学意义(P＜0.05)，提示一贯煎具有改善肝纤维化大鼠阴虚证表征的作用。

综上所述，本研究结果提示，肝纤维化大鼠具有阴虚证的特点，滋补肝肾中药一贯煎不仅能改善肝组织的病理，还能改善阴虚证的症状。该研究为肝纤维化大鼠阴虚证的诊断和药理机制的研究提供了新的思路。

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Features of hepatic fibrosis in rats with Yin deficiency syndrome and the intervention effects of Yiguanjian

LIU Wenlan YOU Hongjie ZHAO Qingzhou OUYANG Luodan GAO Bian＇e ZHANG Xin CHE Niancong
College of Traditional Chinese Medicine,Capital Medical University,Beijing 100069,China

Objective To detect the Yin deficiency symptoms of hepatic fibrosis in rats,observe the effect of traditional Chinese medicine Yiguanjian on characterization of Yin deficiency syndrome.Methods 48 male Sprague-Dawlay rats were randomly divided into 4 groups:normal group,model group,positive control group,Yiguanjian group,each group had 12 rats.Except the normal group,hepatic fibrosis model induced by CCl4was established.After 3 days when the CCl4injection was stopped,each rat in Yiguanjian group was given Yiguanjian(2 m L/200 g)by intragastric administration,1 time/d.Positive control group was given Colchicine(0.25 mg/kg)by intragastric administration,1 time/d.The normal group and model group were fed with same volume of saline daily.After 4 weeks,serum levels of aspartate aminotransferase(AST)and alanine aminotrans-ferase (ALT)were measured by routine Methods;the HE staining was used to evaluate the semi-quantitative scoring of liver inflammation(G)and liver fibrosis(S);the features of Yin deficiency syndrome like body weight,tongue humidity, temperature of tongue,tongue microcirculation blood flow velocity,drinking,stool and urine were detected.Results①Yiguanjian had good effect in improving liver function,reduce inflammation,anti-liver fibrosis.Compared with the model group［(61.00±0.00)U］,ALT was significantly declined in Yiguanjian group［(41.66±3.72)U］,with statistically significant difference(P＜0.05).Compared with the model group［(218.90±12.56)U］,AST was significantly declined in Yiguanjian group［(146.03±46.41)U］,with statistically significant difference(P＜0.05).Compared with the model group［(3.00±0.00)］,the semi-quantitative scoring of liver inflammation was significantly declined in Yiguanjian group［(1.00± 0.00)］,with statistically significant difference(P＜0.05).Compared with the model group［(2.00±0.00)］,the semi-quantitative scoring of fibrosis was significantly declined in Yiguanjian group［(1.00±0.00)］,with statistically significant difference(P＜0.05).②The rat of hepatic fibrosis had symptoms of Yin deficiency syndrome,Yiguanjian could improve the symptoms of Yin deficiency syndrome.Bodyweight:compared with the normal group［(507.00±17.69)g］,the body weight was significantly declined in model group［(380.66±37.29)g,P＜0.05］.Compared with the model group,the body weight significantly increased in Yiguanjian group［(473.66±13.86)g,P＜0.05］.Tongue humidity:compared with the normal group［(0.007 32±0.001 26)g］,the tongue humidity was significantly declined in model group［(0.000 36±0.000 28)g, P＜0.05］.Compared with the model group,the tongue humidity significantly increased in Yiguanjian group［(0.012 83± 0.005 85)g］,(P＜0.05).Temperature of tongue:compared with the normal group［(30.63±0.80)℃］,the temperature of tongue significantly increased in model group［(34.48±1.24)℃,P＜0.05］.Compared with the model group,the temperature of tongue significantly declined in Yiguanjian group［(31.40±2.10)℃,P＜0.05］.Tongue microcirculation blood flow velocity:compared with the normal group［(31.43±1.58)AU］,the blood flow velocity significantly increased in model group［(69.78±21.44)AU,P＜0.05］.Compared with the model group,the blood flow velocity significantly declined in Yiguanjian group［(40.50±3.89)AU,P＜0.05］.Drinking:compared with the normal group［(59.65±6.05)mL］,the drinking significantly declined in model group［(37.52±10.46)mL,P＜0.05］.Compared with the model group,the drinking significantly increased in Yiguanjian group［(53.69±8.74)m L,P＜0.05］.Stool compared with the normal group［(2.00± 0.00)］,the semi-quantitative scoring of stool significantly declined in model group［(1.00±0.00),P＜0.05］.Compared with the model group,the semi-quantitative scoring of stool significantly increased in Yiguanjian group［(2.00±0.00),P＜0.05］.Urine:compared with the normal group［(1.00±0.00)］,the semi-quantitative scoring of urine significantly increased in model group［(2.00±0.00),P＜0.05］.Compared with the model group,the semi-quantitative scoring of urine significantly declined in Yiguanjian group［(1.33±0.57),P＜0.05］.ConclusionThe rat of hepatic fibrosis has the characteristics of Yin deficiency syndrome,Yiguanjian can not only improve the liver injury in rat,but also can improve the symptoms of Yin deficiency syndrome.This study provides a new idea to study the diagnosis and research of pharmacological mechanism of Yin deficiency syndrome in rats with liver fibrosis.

Hepatic fibrosis;Yin deficiency syndrome;Yiguanjian

R285.5

A

1673-7210(2015)03(a)-0007-05

2014-10-27本文编辑:程铭)

国家自然科学基金资助项目(编号81273668)。

刘文兰，博士，副教授，硕士生导师;研究方向:慢性肝炎中医证候病理基础。