稳定性碳、氮、氢同位素在牦牛产地区分中的应用

（青海省高原放牧家畜营养与生态国家重点实验室培育基地，青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室，青海高原牦牛研究中心，青海大学畜牧兽医科学院，青海 西宁 81001 6）

稳定性碳、氮、氢同位素在牦牛产地区分中的应用

项 洋，郝力壮，牛建章，张晓卫，柴沙驼*

（青海省高原放牧家畜营养与生态国家重点实验室培育基地，青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室，青海高原牦牛研究中心，青海大学畜牧兽医科学院，青海 西宁 81001 6）

为确定稳定性同位素对牦 牛肉溯源的可行性。利用同位素质谱仪测定来自青海省河南县、大通县，四川省红原县、九龙县的牦牛肉样品中粗脂肪的碳同位素及脱脂牦牛肉中的碳、氮、氢同位素。通过比较分析不同地域来源牦牛肉中稳定性碳、氮、氢同位素的组成特征。结果表明，各地区牦牛肉不同组织中的稳定性碳、氮、氢同位素存在显著差异（P＜0.05）或极显著差异（P＜0.01），脱脂牦牛肉中的稳定性碳同位素判别效果好于粗脂肪中稳定性碳同位素判别效果，同位素指标组合判别效果好于单一同位素指标的判别效果，稳定性氮、氢同位素指标组合分析是牦牛肉产地溯源的有效指标，准确率可达到85%。利用稳定性碳、氮、氢同位素指标与多元统计分析方法相结合可以对不同地域来源的牦牛肉进行有效的区分。

牦牛肉；溯源；稳定性同位素；δ13C；δ15N；δ2H

牦牛是生活在海拔3 000 m以上高寒地区的特有家畜品种，牦牛肉不仅具有高蛋白、低脂肪，富含矿物元素[1]，且是公认的无污染绿色食品[2]。随着人们生活水平的提高，绿色有机的特色食品日益受到消费者关注和喜爱。近年来，由于畜禽源性恶性事件不断发生，消费者对动物源性食品安全有了越来越多的担忧和关心。因此为了保护牦牛这一特色畜产品，同时方便畜产品质量安全与监管，亟待解决产地溯源的技术问题，为牦牛肉优质优价提供技术支持。

目前，稳定性同位素溯源技术是判别动物源性食品产地的一项很有效的分析手段。孙淑敏[3]研究发现不同地域羊组织中的δ13C、δ15N值和δ2H值存在显著差异。Camin等[4]通过分析2005年与2006年羔羊肉中的δ13C、δ15N、δ2H和δ34S数据得出，在同一地区，不同年份的羊肉脱脂蛋白中δ13C、δ15N、δ2H和δ34S有显著差异。Bahar等[5]共分析了爱尔兰242 头牛，研究发现一年中δ13C、δ15N没有明显的变化，而δ34S表现出复杂的季节性变化。马冬红等[6]研究发现各地的罗非鱼腹肉中的δ2H值可做为有效的溯源指标。王慧文等[7]研究发现肉鸡的饲料与产地与鸡肉中δ13C值和δ2H值有关。此外，一些同位素分析方法已经得到官方分析化学家协会及欧洲标准化委员会的认可[8]。

尽管使用稳定性同位素对畜产品[9-13]及乳产品[14-16]溯源已有研究，但不同地域来源牦牛肉中同位素的差异性及同位素是否可作为溯源指标尚未被研究证实。因此，本研究通过对牦牛肉主产区的4 个不同来源的牦牛肉样品进行稳定性同位素分析，探讨各地区间的稳定性同位素的差异，为稳定性同位素溯源技术的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

分别从青海省大通县、河南县、四川省红原县、九龙县4 个地点各随机采集10 头牦牛肉背最长肌（10～14 肋骨间）样品500 g，放入自封袋在-20 ℃冰箱中冷冻保存。

石油醚（60～90 ℃沸程） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ALPHA 1-2LD PLUS型真空冷冻干燥机 德国Christ公司；QM-3SP2型行星式球磨仪 南京大学仪器厂；2050 Soxtec型自动索氏提取仪 丹麦Foss公司；vario PYRO cube元素分析仪 德国Elementar公司；100稳定同位素质谱仪 英国Isoprime公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

冷冻干燥：将样品切成1 cm3小丁，平铺在托盘中冷冻干燥48 h取出后放入干燥器中保存。其中，真空冷冻干燥机冷限温度不大于-62 ℃，真空度不大于10 Pa，相对湿度不大于70%。

粉碎：将冻干后的样品放入行星式球磨机中进行粉碎，约1 h。其中，行星式球磨机公转频率44 Hz，转速290 r/min，自转转速580 r/min。

脱脂：称取2～3 g粉碎好的牦牛肉样品，放在全自动索氏提取仪中，加入70 mL石油醚（沸程60～90 ℃）。在165 ℃条件下，浸泡30 min，淋洗1 h，溶剂回收10 min，完成以上3 步后将样品取出，此时为脱脂牛肉样品及粗脂肪样品，备用[17]。

1.3.2 稳定性碳、氮同位素比率检测

称取2～4 mg样品放入锡箔杯中，通过自动进样器进入元素分析仪，在其内燃烧并还原转化为纯净的CO2和N2，CO2再经过稀释器稀释，最后进入稳定同位素质谱仪进行检测。

元素分析仪条件：燃烧炉温度1 020 ℃；还原炉温度600 ℃；载气（He）流速230 mL/min。

稀释仪条件：He稀释压力4 bar；CO2参考气压力4 bar；N2参考气压力4 bar。

质谱仪条件：用USGS24（δ13CPDB=-16‰）标定钢瓶CO2参考气，采用两点校正，用USGS24和IAEA600（δ13CPDB=-27.5‰）对测定结果进行校正；用IAEA N1（δ15Nair=0.4‰）标定钢瓶N2参考气，用IAEA N1和USGS43（δ14Nair=8.44‰）对测定结果进行校正。

稳定性碳、氮同位素比率分别以δ13C、δ15N表示，其中，稳定性碳同位素相对标准为V-PDB，稳定性氮同位素相对标准为空气（air）。

1.3.3 稳定性氢同位素比率检测

称取0.3 mg样品装入银杯（6 mm×4 mm），平衡72 h，并按顺序放入120 位自动进样器中，利用自动进样器将样品送入元素分析仪，高温裂解生成CO和H2，最后进入稳定同位素质谱仪进行检测。工作参数：样品裂解温度1 450 ℃；He载气流速120 mL/min；H2参考气压力为4 bar；稳定性氢同位素比率以δ2H表示，其中，稳定性氢同位素相对标准为V-Smow。

稳定性碳、氮、氢同位素测定结果按下式计算：

式中：R为标准物质和样品中轻重同位素与轻同位素的丰度比，即分别为13C/12C、15N/14N、2H/1H。

1.4 数据分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行Duncan’s多重比较、判别分析、主成分分析、聚类分析。

判别分析采用逐步判别分析，先验概率选择“根据组样品数计算”；聚类分析采用系统聚类，其中聚类距离为欧式距离，聚类方法采用离平方和法。

2 结果与分析

2.1 不同地域间牦牛肉中稳定性同位素组成差异分析

通过使用同位素质谱仪测得河南县、大通县、红原县及九龙县4 个县的牦牛肉中δ13C、δ15N值和δ2H值，结果如表1所示。4 个地域间牦牛肉粗脂肪中δ13C平均值由大到小依次为：九龙县＞河南县＞大通县＞红原县。同时经Duncan’s法多重比较发现，4 个地区牦牛肉粗脂肪中的δ13C差异均不显著（P＞0.01），而在P=0.05水平进行差异分析，结果发现红原县和九龙县牦牛肉粗脂肪中的δ13C差异显著（P＜0.05），河南县与大通县的差异则未达到显著水平。可以通过变异系数看出，4 个地区中四川红原县变异系数较大，样品分布不是很均匀。

4 个地域间脱脂牦牛肉中δ13C的平均值由大到小依次为：河南县＞红原县＞九龙县＞大通县，与牦牛肉粗脂肪中的δ13C变化趋势不一致。通过Duncan’s法多重比较发现红原县与其他3 个县差异显著（P＜0.05），但九龙县与青海省两县无显著差异。红原县与河南县及九龙县差异极显著（P＜0.01）。四川两县样品的变异系数均大于青海两县，说明青海的数据分布较四川两县均匀。

4 个地域间脱脂牦牛肉中的δ15N平均值由大到小依次为大通县＞红原县＞九龙县＞河南县。经Duncan’s法多重比较可看出大通县、红原县无显著差异（P＞0.05），河南县、九龙县无显著性差异（P＞0.05），但大通县、红原县与河南县、九龙县差异显著（P＜0.05），并且大通县与九龙县差异极显著（P＜0.01）。通过变异系数可看出青海省大通县变异系数最小。

4 个地域间脱脂牦牛肉中δ2H的平均值由大到小依次为大通县＞河南县＞红原县＞九龙县。4 个地区间差异显著（P＜0.05），河南县和大通县与红原县和九龙县差异极显著（P＜0.01）。四川省九龙县变异系数较大可能是其中有2 个样品数值与其他样品相差较大而造成。总体而言，4 个县中青海省2 个县变异系数由大到小排序顺序相一致，四川省则有所不同。

表1 不同地域间牦牛肉中稳定性同位素组成差异分析Tabllee 11 δ1133CC,, δ1155N aanndd δ2H values of yak meat samples from different regions

2.2 判别分析

2.2.1 单一同位素指标对牦牛肉产地判别分析

从表2的判别分析结果看出，粗脂肪中稳定性碳同位素判别结果较差，最高的是红原县也只达到50%，而河南县无一判对，整体判别率也只有37.5%，这与粗脂肪中稳定性碳同位素组成差异分析结果相一致。脱脂牦牛肉中稳定性碳同位素判别效果也不是很理想，整体判别也只有42.5%，其中，红原县判别效果较好，判别率为80%。不论是粗脂肪中的碳同位素，还是脱脂牦牛肉中的碳同位素，红原县的判别率相对其他3 县判别率都最高，并且脱脂牦牛肉中稳定性碳同位素整体判别率也好于粗脂肪中稳定性碳同位素判别率。

脱脂牦牛肉中稳定性氮同位素判别效果只有大通县和九龙县判别率为60%，整体判别率仅为37.5%，判别效果不是很理想。脱脂牦牛肉中稳定性氢同位素在3 种同位素中的判别效果最好，判别率最低为70%，最高达到100%，整体判别率高达85%，与脱脂牦牛肉中稳定性氢同位素组成差异分析结果一致。

表2 单一同位素指标对牦牛肉产地的正确判别率Table 2 Total rate of correct classification of individual isotope indexes for yak meat samples%

2.2.2 同位素指标组合对牦牛肉产地判别分析

表3 同位素指标组合对牦牛肉产地的正确判别率Table 3 Total rate of correct classification of isotope index combinations for yak meat samples%

表3判别分析结果表明，同位素指标组合判别效果明显高于单一指标判别效果。河南县及大通县稳定性氮、氢同位素指标组合判别效果最好；红原县则是稳定性氮、氢同位素指标组合判别效果最差；九龙县稳定性碳、氮同位素指标组合判别效果极差，只有10%。红原县和九龙县稳定性碳、氢同位素及稳定性碳、氮、氢同位素判别效果都较好，都为80%。总体而言，稳定性碳、氮同位素指标组合判别效果较差，整体判别率只有42.5%。稳定性氮、氢同位素指标组合判别效果最好，整体高达85%。

2.3 主成分分析

从同位素组成差异分析及判别分析中可看出脱脂牦牛肉中的3 种同位素分析效果较好，因此选取其作主成分分析。从表4可看出，前2 个主成分累计方差贡献率达到86.42%，说明前2 个主成分提供了原始变量足够的信息。第1主成分中主要包含了稳定性氮、氢同位素信息，占方差贡献率的47.78%；第2主成分主要包含了稳定性碳同位素的信息，占方差贡献率的38.65%。

表4 前2 个主成分的累计方差贡献率Table 4 Cumulative variance contribution rates of the first 2 principal components

用第1、2主成分标准化得分作散点图，可将青海省及四川省的牦牛肉样品完全区分开（图1）。青海省大通县牦牛肉样品第1主成分均为正值；青海省河南县牦牛肉样品无论第1主成分还是第2主成分，既有正值也有负值；红原县牦牛肉样品第2主成分为负值；九龙县牦牛肉样品第1主成分完全为负值。可见，以上提取的2 种主成分可以将不同地区的牦牛肉样品区分开，可以作为有效溯源指标。

图1 脱脂牦牛肉第1主成分和第2主成分标准化得分散点图Fig.1 Score scatter plots of the first two principal components for de-fatted yak muscle samples

2.4 聚类分析

图2 脱脂牦牛肉稳定性碳、氮、氢同位素聚类分析图Fig.2 Dendrogram forδ13C,δ15N andδ2H cluster analysis of de-fatted yak muscle

在聚类分析中选取了脱脂牦牛肉中稳定性碳、氮、氢同位素进行聚类分析（图2）。在距离为5的位置将树切断，可将其分为4 类。第1类全部为九龙县样品，占样品总数量的80%；第2类主要包括大通县样品，占样品总数量的100%，并且其中含有九龙县及河南县样品各1个；第3类样品主要是河南县样品，占样品总数量的90%，其中还包括了红原县和九龙县样品各1个；第4类全部是红原县样品，占样品总数量的90%。从聚类分析中可看出利用脱脂牦牛肉中稳定性碳、氮、氢3 种同位素可将不同地域的牦牛肉样品区基本分开，效果较好。

3 讨论与结论

从不同地域间牦牛肉中稳定性碳、氮、氢同位素组成存在显著和极显著差异。这可能与地理环境有关。青海省河南县平均海拔3 650 m，并且气温日差较大，年平均气温为-1.3～1.6 ℃，年平均降水量为597.3～615.6 mm，属于高原大陆性气候，土壤分布主要有6 种，即高山沙漠土、高山草甸土、黑钙土、山地草甸土、灰褐图、沼泽土[18]。青海省大通种牛场位于达板山南麓，地形较为复杂，海拔3 000～4 000 m左右，年平均气温0.5℃，年平均降水量为548.4 mm，境内土壤主要有高山寒漠土、灰褐土、高山草甸土等[19]。四川省红原县平均海拔3 600 m，四季难以明显划分，日照强，太阳辐射强，降水主要集中在5—10月。四川省九龙县牦牛长期生长在海拔3 600 m以上的地区，当地气候极为恶劣，经常刮大风、降大雪[20]。由于产地气候条件的不同使得牦牛肉中稳定性同位素组成有各自的地域特征，进而为稳定性同位素技术对牦牛肉产地溯源提供了可能。

与此同时，研究发现无论是粗脂肪中的同位素还是脱脂牦牛肉中的同位素都可以看出四川省两县具有显著差异（P＜0.05）或极显著差异（P＜0.01），而河南县和大通县则未达到显著水平。利用第1主成分和第2主成分所做的散点图也可看出四川省两县被明显地区分开；同时，在聚类分析中四川省两县牦牛被聚为2 类，并且毫无交叉。并且钟金城等[21]也得出相同的研究结果，根据微卫星位点的等位基因频率计算了牦牛群体的欧式遗传距离并绘制树系统聚类图，得出九龙县与红原县牦牛的遗传距离最大，并且聚为2 类。并且该研究通过随机扩增多态性和扩增片段长度多态性标记聚类、染色体特征聚类及血液蛋白Tf和Hb位点基因频率的聚类也得出相同的结论。以上方法可将四川省两县的牦牛完全区分开，对于青海省两县却不然。这可能与所食牧草有关，九龙县牦牛随饲草的变化而游牧于高山牧场或谷地半农半牧区之间；麦洼牦牛即分布于红原县的牦牛，草地类型主要以高寒草地为主；青海省河南县及大通县的牦牛可食牧草主要以禾本科草为主[22]。并且，红原县脱脂牦牛肉中稳定性碳同位素与青海省两县有显著差异，但九龙县则与其他两县无差异，说明不同县之间脱脂牦牛肉中稳定性碳同位素组成存在交叉性，这与郭波莉等[23]研究结果一致。4 个地域间脱脂牦牛肉中稳定性氮同位素组成差异可看出，相同省不同县之间差异显著（P＜0.05），这 可能与当地的不同饲喂情况有关，并且还受其他方面因素的影响，如土壤类型、饲喂方式等。Piasentier等[24]指出未施用有机肥的土壤和植物中的δ15N值低于施用有机肥的土壤和植物中的δ15N。刘晓玲[25]也发现动物体内δ15N值差异的显著性可能与所食牧草区域的土壤类型和固氮类植物比例的不同而不同。2 个省脱脂牦牛肉中稳定性氢同位素组成差异极显著（P＜0.01），但相同省不同县之间只是差异显著（P＜0.05），这可能是相近地区有相似的经度、纬度和降雨有关，这与刘晓玲等[26]研究结果一致，研究指出牛组织中的氢同位素与饮水有关，而水中的氢同位素组成与当地环境密不可分。在判别分析中利用稳定性氢同位素判别效果好于其他几种情况，粗脂肪中稳定性碳同位素及脱脂牦牛肉中稳定性氮同位素判别效果较差；稳定性同位素指标组合分析判别效果远好于单一同位素判别效果。

综上所述，通过以上分析可以看出，使用稳定性同位素指纹分析技术与多元统计分析方法相结合可以对不同地域来源的牦牛肉进行有效的区分，牦牛肉中稳定性碳、氮、氢同位素可作为有效的溯源指标，用于牦牛溯源数据库的建立。

不同地域来源的牦牛肉中的稳定性碳、氮、氢同位素呈显著差异（P＜0.05），且不同省之间脱脂牦牛肉中的稳定性碳、氮、氢同位素呈极显著差异（P＜0.01）。通过判别分析、主成分分析、聚类分析可看出，利用碳、氮、氢3 种同位素指标可以对牦牛肉产地来源进行区分，但单一同位素指标除氢同位素判别率较高以外，其他同位素判别率较低，因此建议在以后的溯源中选取有效指标组合分析来提高判别率。通过与多元统计方法相结合分析可看出利用稳定性同位素对牦牛肉溯源是可行的。

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Stable Isotope Distribution of Carbon, Nitrogen and Hydrogen in Yak Meat from Different Regions

XIANG Yang, HAO Lizhuang, NIU Jianzhang, ZHANG Xiaowei, CHAI Shatuo*

(State Key Laboratory of Cultivating Base of Plateau Grazing Animal Nutrition and Ecology of Qinghai Province, Key Laboratory of Plateau Grazing Animal Nutrition and Feed Science of Qinghai Province, Qinghai Plateau Yak Research Center, Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine, Xining 810016, China)

This study aimed to confi rm the possible traceability of yak meat samples from different regions using stable isotopes. The δ13C, δ15N, and δ2H values of yak meat samples (muscle crude fat and de-fatted muscle) from Henan county and Datong county of Qinghai province, and Hongyuan county and Jiulong county of Sichuan province were tested using isotope ratio mass spectrometry (IRMS). The composition characteristics of δ13C, δ15N, and δ2H of yak meat samples were compared and analyzed. The results demonstrated that the δ13C, δ15N, and δ2H differed signifi cantly among meat samples from different yak tissues (P < 0.05 or P < 0.01). The distinguishing capacity for de-fatted muscle was better than for muscle crude. When the indicators of stable isotope were taken into comprehensive consideration, yak meat samples from different places was better distinguished as compared to the individual indicators, and the combined analysis of stable nitrogen and hydrogen isotopes provided potential indicators for tracing the origin of yak meat samples with an accuracy up to 85%. It is a promising approach to classify yak meat based on δ13C, δ15N and δ2H combined with multivariate statistical methods.

yak; traceability; stable isotope; δ13C; δ15N; δ2H

TS251.5

A

1002-6630（2015）12-0191-05

10.7506/spkx1002-6630-201512035

2014-08-21

国家重点基础研究发展计划（973计划）项目（2012CB722906）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD13B01）；青海省重大科技平台建设项目（2011-Z-Y12A；2012-Z-Y08）

项洋（1988—），女，硕士研究生，研究方向为牦牛肉溯源技术。E-mail：chaorenxy@163.com

*通信作者：柴沙驼（1968—），男，副研究员，本科，研究方向为反刍动物营养与生产。E-mail：chaishatuo@163.com