环介导等温扩增法直接检测阳性血培养瓶中大肠埃希菌

任春阳，田 杰

(沈阳市第四人民医院检验科，辽宁沈阳 110031)

环介导等温扩增法直接检测阳性血培养瓶中大肠埃希菌

任春阳，田 杰

(沈阳市第四人民医院检验科，辽宁沈阳 110031)

目的 应用环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种快速敏感的直接检测阳性血培养瓶中大肠埃希菌的方法。方法根据美国国立卫生研究院基因序列数据库(GenBank)上大肠埃希菌的lacZ(登录号：M74750)基因序列，设计4条特异引物(2条内引物、2条外引物)，对lacZ基因进行扩增，对扩增反应进行优化。分别验证该方法的特异性及敏感性，并与传统培养法进行比较。结果在300份阳性血培养瓶中，采用LAMP法检测到68株大肠埃希菌，所设计引物对大肠埃希菌扩增的特异性及敏感性均较好，与传统培养法比较，灵敏度和特异性均达100%，但传统培养法的检出时间为3 d，而LAMP法的检出时间只需1 h。结论LAMP检测大肠埃希菌是快速、低成本、特异性强、灵敏度高的方法，适合临床开展。

环介导等温技术；检测；大肠埃希菌

大肠埃希菌是临床常见的重要致病菌，在引起败血症的病原菌中居首位[1]，目前，大肠埃希菌的检测仍以传统的培养方法(如分离培养、生化鉴定等)为主，但传统的培养方法操作繁琐，费时费力，不能快速为临床提供可靠的结果。PCR 方法检测大肠埃希菌具有特异性强、灵敏度高等特点，但检测成本较高，需要专门规划设计的实验室以及昂贵的仪器。2000年日本学者Notomi等[2]发明了环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，现在应用非常广泛，包括病原微生物检测[3-4]、寄生虫检测[5]、植物病检测[6-7]、动物胚胎的性别鉴定[8]及植物种类鉴定[9]等领域。本研究直接从阳性血培养瓶中提取细菌DNA，使用LAMP扩增大肠埃希菌的lacZ基因，判断是否为大肠埃希菌感染，可在1 h内完成，缩短最终鉴定时间，以为临床治疗赢得时间。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源 收集2012 年1月至2013年4 月沈阳市第四人民医院300份阳性血培养瓶，均为非重复株。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC 27853、 大肠埃希菌 ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 29213，购自卫生部临床检验中心。

1.1.2仪器与试剂 VIT EK 2 全自动微生物分析仪及其配套试剂为法国生物梅里埃公司产品，BACTEC9050全自动血培养仪由美国BD公司提供，恒温箱为上海医疗器械厂产品，低温高速离心机为贝克曼公司产品，Bst DNA聚合酶(含10×Bst buffer)购自New England Biolabs公司；甜菜碱(betaine)购自Sigma公司；dNTP、MgSO4、DNA 标志物购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.3引物 根据GenBank中大肠埃希菌lacZ基因序列，使用Primer ExplorerV4软件设计一套LAMP引物，F3:5′-CAT GGG GGA TCC CAA GCT-3′，B3:5′-TTG TTA GCA GCC GGA TCA G-3′；BIP:5′-CCT TGC AGC ACA TCC CCC TTT GTT GGG AAG GGC GAT C-3′,FIP:5′-CGA CGT TGT AAA ACG ACG GCC ATA GAG GTA CCG CAT GCG ATA-3′。其中F3与B3为外引物，FIP与BIP为内引物。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，用ddH2O溶解后分装，-20 ℃冰箱保存备用。

1.2方法

1.2.1细菌DNA模板制备 采取盐酸胍-苯甲醇法：(1)从阳性血培养瓶中以无菌方式取100 μL培养物置入1.5 mL的EP管中，加入5 mol盐酸胍缓冲液100 μL，涡旋振荡5 min；(2)依次加入400 μL双蒸水和800 μL苯甲醇，涡旋振荡1 min，在4 ℃下以7 000 r/min离心5 min；(3)取上层水相约0.4 mL到一新EP管，依次加入3 mol/L醋酸钠缓冲液40 μL和异丙醇0.44 mL，在4 ℃下16 000 r/min离心15 min；(4)倒掉上层液体，加入1 mL 70%乙醇洗涤，在4 ℃下16 000 r/min离心10 min，接着倒掉上层的乙醇，待干燥后加入100 μL双蒸水溶解管底的DNA沉淀备用。

1.2.2LAMP检测大肠埃希菌 本试验在先期研究中确定的最佳反应体系如下：Bst DNA聚合酶(8 U)1.00 μL、Bst DNA聚合酶缓冲液(10×)2.50 μL、dNTP(10 mmol/L)1.20 μL、Betaine(5 mol/L)5.00 μL、MgSO4(100 nmol/L)1.50 μL、F3与B3(引物浓度为20 μmol/L)各0.25 μL、BIP与FIP(引物浓度为20 μmol/L)各2.00 μL、DNA模板2.00 μL，H2O 7.30 μL。混匀后，65 ℃等温扩增1 h。

2 结 果

2.2LAMP特异性分析 在300份阳性血培养瓶中，采用传统方法检出大肠埃希菌68株，LAMP法产物电泳均有特征性条带出现，非大肠埃希菌为阴性结果，见图1。

M：标志物；1：大肠埃希菌ATCC 25922；2～6：临床分离株；7：阴性对照；8：肺炎克雷伯菌；9：铜绿假单胞菌；10：鲍曼不动杆菌；11：金黄色葡萄球菌；12：表皮葡萄球菌；13：变形菌属；14：肺炎链球菌。

图1 特异性试验结果

2.2LAMP灵敏度分析 将过夜培养的大肠埃希菌ATCC 25922制备成0.50麦氏浊度(相当于1.50×108CFU)，进行10倍倍比稀释，然后提取不同浓度的大肠埃希菌基因组DNA为模板，进行LAMP反应，加入SYBR Green I后，观察结果，随后进行电泳，结果呈绿色的反应产物电泳时均出现特异性的阶梯状条带，出现 LAMP扩增反应，其颜色变化情况与电泳结果一致，可以判定本方法的检测极限约1.50×10 CFU/mL。与传统培养法比较，灵敏度和特异性均达100%，但是传统培养法的检出时间为3 d，而LAMP法的检出时间只需1 h。

3 讨 论

大肠埃希菌是人体肠道中的正常寄生菌，但也是临床各部位感染的重要致病菌，在引起血流感染的病原菌中占首位[10]。传统上，对大肠埃希菌的诊断主要依靠平板培养分离鉴定法，但该方法检测周期长达3 d，费时、费力，不利于临床的快速诊断，所以寻找更快速、更简易、更准确的检测方法是临床工作的发展方向。目前应用最多的是 PCR 及其衍生出的 real-time PCR、巢式 PCR、RT-PCR 等方法[11]。这些方法的优点是操作简单，灵敏性高，可在短时间内得到实验结果。但是这些方法在检测过程中，对精密仪器设备的要求极高且要掌握准确繁琐的实验程序步骤，对实验室平台及操作人员均有很高的要求。

LAMP是一种在等温条件下快速，特异性、灵敏度高的扩增靶序列DNA技术，无需昂贵的仪器设备，可1 h内即可完成全部反应，使对大肠埃希菌的快速诊断成为可能。本研究采用盐酸胍-苯甲醇法直接从阳性血培养瓶中提取细菌DNA，使用LAMP法检测大肠埃希菌的lacZ基因，结果显示大肠埃希菌呈阳性反应，其他对照菌呈阴性反应，可见LAMP 法具有良好的灵敏度和特异性，如果以传统培养法为“金标准”，其灵敏度和特异性均达到100%。而且该方法具有观察结果方便、无需特殊仪器等优点，适合各级医院开展，尤其是一些中小型医疗机构。

对于结果的观察，可以采用肉眼观察反应体系中是否形成白色沉淀来定性判断LAMP反应[12]，但该方法的灵敏度较在反应体系中加入荧光染料要低[13]。目前通常添加荧光染料如EB、SYBR Green I[14]、EvaGreen[15]等进行结果判断。但也存在一定的缺陷，SYBR Green I和EvaGreen对LAMP反应有抑制作用，而且需在反应结束后添加，由于LAMP灵敏度高，较剧烈地摇动反应管或开盖都可形成气溶胶而导致污染，引起假阳性结果的出现。所以寻找一种能在反应前加入且不影响反应的指示剂，避免开盖操作是亟待解决的问题。

综上所述，LAMP法检测阳性血培养瓶中大肠埃希菌的方法简便快速，灵敏度和特异度非常高，检测时间为1 h左右，较传统方法明显缩短，为患者的治疗赢得了时间。但本方法的试验未能检测耐药基因，这将需要进一步的研究。

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Direct detection of Escherichia coli in positive blood culture bottles by loop-mediated isothermal amplification method

RenChunyang,TianJie

(DepartmentofClinicalLaboratory,ShenyangMunicipalFourthPeople′sHospital,Shenyang,Liaoning110031,China)

Objective To establish a rapid,sensitive direct method for detecting Escherichia coli(E.coli) in the positive blood culture bottles by using the loop-mediated isothermal amplification(LAMP).Methods Based on the lacZ (accession number:M74750) gene sequence of E.coli in the gene sequence GenBank by the National Institutes of Health(NIH),4 specific primers (2 inner primers and outer primers) were designed,the lacZ gene was amplified and the amplification reaction was optimized.The sensitivity and specificity of this method were verified and its comparison with the traditional culture method was conducted.Results Sixty-eight strains of E.coli were detected in 300 positive blood culture bottles by adopting the LAMP method.The designed primers had good sensitivity and good specificity for the amplification of E.coli.The sensitivity and specificity of LAMP all reached 100% compared with the traditional method,but the traditional method needed 3 d to get the results,while LAMP only needed 1 h.Conclusion LAMP is extremely rapid for detecting E.coli with low cost,strong specificity and high sensitivity and is suitable for clinical application.

loop-mediated isothermal amplification;testing;Escherichia coli

任春阳(1977-)，副主任检验师，硕士研究生，主要从事微生物及耐药性方面的研究。

术与方法·

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.11.025

R33

A

1671-8348(2015)11-1514-02

2014-11-01

2015-01-16)