UNC5C基因启动子的甲基化状况与大肠癌UNC5C的相关性分析

孙冬生，高春艳，王志刚，刘 宁，贾凤洁

(1.河北省唐山市开滦总医院肿瘤科，河北唐山 063000；2.内蒙古大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010021)

UNC5C基因启动子的甲基化状况与大肠癌UNC5C的相关性分析

孙冬生1，高春艳1，王志刚2，刘 宁1，贾凤洁1

(1.河北省唐山市开滦总医院肿瘤科，河北唐山 063000；2.内蒙古大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010021)

目的 探讨UNC5C基因启动子的甲基化状况与大肠癌UNC5C的相关性。方法选择河北省唐山市开滦总医院肿瘤科2010年2月至2013年3月共54例散发性大肠癌及相关正常黏膜组织，以及6个大肠癌细胞株和纤维细胞株(FCL)作为研究对象。对研究对象实施基因mRNA和甲基化分析。结果UNC5A和UNC5B的mRNA，在所检测的大肠癌细胞株中均有表达。而UNC5C除FCL外，所有的癌细胞株中均无mRNA表达。在大肠癌组织中UNC5C的甲基化明显高于正常黏膜，差异有统计学意义(P<0.05)。UNC5C基因在Ⅰ～Ⅱ期，以及Ⅲ～Ⅳ期的甲基化水平均显著高于未甲基化水平，均差异有统计学意义(P<0.05)。依照Spearman法进行相关性分析，UNC5C缺陷与大肠癌疾病呈正相关(r=0.856，P<0.05)。结论Netrin-1受体UNC5C缺陷与大肠癌具有一定相关性。

Netrin-1受体；UNC5C缺陷；结直肠肿瘤；相关性

UNC5同源蛋白(uncoordinated-5 homologue，UNC5H)是Netrin-1的一种依赖型受体，在缺少Netrin-1配体时，可诱导有关细胞凋亡，在与配体结合后通常可抑制凋亡。而UNC5C作为UNC5H家族的一员，主要位于人类染色体4q21-q23。有研究报道，其广泛表达于正常细胞中，但在大肠癌和其他肿瘤组织内表达下降，表明UNC5C可发挥肿瘤抑制基因效果[1]。本文旨在研究UNC5C缺陷与大肠癌的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择河北省唐山市开滦总医院肿瘤科54份散发性大肠癌及相关正常黏膜组织(石蜡标本)，以及6个大肠癌细胞株(SW48、HCT116、DLD1、WiDr、LS174T、HT29)和纤维细胞株(fibroblast cell line，FCL)作研究对象。54份标本均于该院从2012年2月到2013年3月行大肠癌手术的患者中部分切除所得。其中男34例，女20例；年龄32～83岁，平均(59.5±2.2)岁。结肠癌29例，直肠癌25例。54份标本均由病理学证实。患者在手术前无放、化疗及其他生物治疗史。

1.2方法

1.2.1标本采集 全部标本均源于患者大肠癌组织(避免在肿瘤中心处的坏死区采集)及手术的切缘组织(取自标本的近切端相应切缘处)。标本在离体之后快速置于-196 ℃的液氮内冷冻，之后置于-85 ℃的冰箱内保存备用。另取部分组织放置在10%中性甲醛液内固定并以石蜡包埋。

1.2.2主要仪器及试剂 仪器：德国 Analytik Jena AG公司的flexcycler PCR仪；美国Bio-Rad公司 PowerPacTM Basic Power Supply型电泳仪；美国Bio-Rad公司Sub-Cell GT 电泳槽；加拿大Carestream公司的Gel Logic 212 PRO型凝胶成像的分析系统；美国Thermo公司Ultro freeze 3410超低温冰箱；中国宁波永新光学股份有限公司NIB-100型显微镜等。试剂：PCR扩增引物中各序列均由上海英骏生物技术有限公司设计合成；琼脂糖产于美国的Promega公司；宝生物NucleoSpin®RNA 试剂盒；宝生物TEXPAT试剂盒；PBS液0.1 mol，pH为7.2～7.4；SP9000试剂盒；DAB显色试剂盒等。

1.2.3检测方法 对研究对象实施基因mRNA和甲基化分析，其中RNA提取使用宝生物NucleoSpin®RNA 试剂盒，石蜡标本DNA提取使用宝生物TEXPAT试剂盒，严格按照试剂盒的说明书进行仔细操作。根据RT-PCR实验步骤对两者行电泳分析，其中甲基化引物使用COBRA法并结合重亚硫酸盐限制性内切酶法。

1.2.4mRNA引物 UNC5A：上游引物为5′-TGA CCA CGG CCA ACT ACA CCT-3′，下游引物为5′-CCA GTG GGT GCA GTC CAG-3′，退火温度55 ℃，扩增长度为142 bp，45个循环。UNC5B：上游引物为5′-CTG TCG GAC ACT GCC AAC TA-3′，下游引物为5′-CTG TCG GAC ACT GCC AAC TA-3′，退火温度55 ℃，扩增长度为132 bp，45个循环。UNC5C：上游引物为5′-TGC AAA TGC TCG TGC TAC CT-3′，下游引物为5′-TGT GGT CCT TCT GAT GAA CCC-3′，退火温度 55℃，扩增长度为258 bp，45个循环。Beta-actin：上游引物为5′-TCA CCA TGG ATG ATG ATA TCG CC-3′，下游引物为5，-CCA CAC GCA GCT CAT TGT AGA AGG-3′，退火温度 55℃，扩增长度为294 bp，45个循环。

1.2.5甲基化引物 UNC5C：上游引物为5′-TTT AGT GGG GTT TTT AGT TGT TTG-3′，下游引物为5′-TAT CCC AAT CCC AAT CCR CAA C-3′，退火温度(循环次数)为56 ℃(5)，54 ℃(10)，52 ℃(30)，每次循环时间均为30 s；产物长度(酶)：125 bp(Hhal)酶37℃，12 h。

1.2.6测定标准 严格按照SP9000、DAB显色试剂盒说明书进行操作，PBS振洗、DAB显色后观察统计。于高倍镜下对每一切片挑选10个代表视野，并对每个视野中100个癌细胞进行计数，共计1 000个细胞。阳性染色信号主要定位于细胞质中，呈现为黄色颗粒，且界限清楚，并无明显的背景着色。阳性计分标准：(1)根据染色强度判定，0分为无色；1分为淡黄色；2分为棕黄色；3分为黄褐色。(2)根据阳性染色的细胞百分率判定，≤10%为0分；>10%～50%为1分；>50%～75%为2分；>75%为3分。此两项得分所乘结果大于3分为阳性病例(记为+)，≤3分为阴性病例(记为-)，最后通过两位资深病理医务人员以双盲法判定，所得一致意见即为最终结果。

1.3统计学处理 采用SPSS13.0统计软件分析，数据比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1细胞株mRNA电泳及甲基化电泳结果 细胞株(SW48，HCT116，DLD1，WiDr，LS174T，HT29，FCL)mRNA电泳结果显示，其中UNC5A除FCL外，其他指标均有表达；UNC5B及Beta-actin各项指标均有表达，但UNC5C除FCL有表达外，其他各项指标均无表达(图1)。细胞株UNC5C甲基化，大肠癌及正常组织的甲基化结果，见图2、3。

2.2UNC5A、UNC5B及UNC5C在大肠癌细胞株及FCL中的表达比较 UNC5A和UNC5B的mRNA，在所检测的大肠癌细胞株中均有表达。而UNC5C除FCL外，所有的癌细胞株中均无mRNA表达，见表1。

A：UNC5A；B：UNC5B；C：UNC5C；D：Beta-actin；1：SW48；2：HCT116；3：DLD1；4：WiDr；5：LS174T；6：HT29；7：FCL。

图1 细胞株mRNA电泳结果

1：SW48；2：HCT116；3：DLD1；4：WiDr；5：LS174T；6：HT29。

图2 细胞株UNC5C的甲基化结果

T：大肠癌；N：正常组织；M：标记物。

图3 大肠癌及正常组织的甲基化结果

表1 UNC5A、B、C的mRNA在两种细胞株中的表达比较

2.3UNC5C在大肠癌组织及正常黏膜的甲基化情况比较 在大肠癌组织中UNC5C的甲基化明显高于正常黏膜，差异有统计学意义(χ2=52.90，P<0.05)。提示UNC5C mRNA表达的缺失可能和基因启动子的甲基化有关，见表2。

表2 UNC5C在两组组织中的甲基化比较[n(%),n=54]

a:P<0.05，与正常黏膜组比较。

2.4UNC5C甲基化与肿瘤进展关系 UNC5C基因在Ⅰ～Ⅱ期，以及Ⅲ～Ⅳ期的甲基化水平均显著高于未甲基化水平，均差异有统计学意义(P<0.05)。提示UNC5C基因甲基化于肿瘤早期即出现，且与肿瘤的进展程度无关，见表3。

表3 UNC5C甲基化与肿瘤进展关系[n(%)，n=54]

2.5UNC5C缺陷与大肠癌疾病的相关性分析 依照Spearman法进行相关性分析，UNC5C缺陷与大肠癌疾病呈正相关(r=0.856，P<0.05)。提示UNC5C在大肠癌发生、发展中起着关键的调节作用。

3 讨 论

伴随大肠癌疾病发展，患者症状会逐渐显现，主要有腹痛、便血、肠梗阻以及腹部包块等症状，加之肿瘤转移和浸润将导致受累器官发生变化，对患者身体造成严重影响[2-3]。UNC5H在人类群体中，主要即为UNC5A、C，编码产物均为Ⅰ类跨膜蛋白，可由胞外区和跨膜区以及胞内区等功能区构成[4]。

有资料表明，UNC5H在除神经系统之外的其他大部分人体组织中均有表达[5]。虽然国内外对于UNC5H在人体的表达有诸多报道，但关于UNC5C于大肠癌组织内表达的报道则较为少见。本研究结果发现，UNC5A和UNC5B的mRNA，在所检测的大肠癌细胞株中均有表达。而UNC5C除FCL外，所有的癌细胞株中均无mRNA表达。在大肠癌组织中UNC5C的甲基化明显高于正常黏膜，且UNC5C基因在大肠癌的Ⅰ～Ⅱ期，以及Ⅲ～Ⅳ期的甲基化水平均显著高于未甲基化水平。表明UNC5C基因启动子的甲基化状况与UNC5C mRNA水平密切相关。同时，分析UNC5C基因启动子的甲基化状况与UNC5C mRNA水平的相关性发现，UNC5C缺陷与大肠癌疾病呈正相关，与Coissieux等[6]报道一致，这可能是因为UNC5C是一种条件性的抑癌基因，抑制肿瘤作用主要依赖于Netrin-1型配体，而后者常常仅局限在肠隐窝基底部位。Netrin-1存在时，UNC5C与之结合能够阻止细胞产生凋亡，此过程可能有2个步骤：(1)阻断Caspases切割受体胞内区，在UNC5C受体和Netrin-1结合之后，可诱导受体发生二聚化，促使其胞内区(含死亡域)产生结构变化，最终阻断Caspases切割。(2)触发了抗凋亡的信号通路。对于配体缺乏区，UNC5C存在可诱导细胞产生凋亡，并直接促使细胞死亡及肿瘤退化。人类机体即可能利用此类机制对肿瘤浸润及转移产生抑制。但对于大肠癌患者而言，UNC5C基因显著减少或是缺失，细胞凋亡水平下降，但细胞增殖却仍然较强，这就促使肿瘤浸润及转移变成了可能，因此在一定程度上导致了大肠癌疾病的发生和进展。

Hibi等[7]报道表明，人类大肠癌病患UNC5C基因的位点上含抑癌基因位点LOH，加之该基因常常会产生错义突变，因此可能导致UNC5C表达减少。据统计，大于80%的直肠癌及大于49%的结肠癌患者机体中UNC5C的表达明显减少，这无法单纯依靠LOH加以解释，但因Tanikawa等[8]已证实UNC5B基因为p53直接转录的目标，可调节p53所诱导的有关细胞凋亡。而对于UNC5C和p53之间是否亦存在此种联系，还需深入研究，有研究对诸多肿瘤患者研究后发现，p53活性缺失与UNC5C表达缺陷呈正相关，而UNC5C表达缺陷亦与大肠癌疾病本身呈正相关联系[9-14]，与本文研究结果相一致，表明Netrin-1受体UNC5C缺陷与大肠癌具有一定相关性，值得临床重视。

[1]武洁,陈学军,薛占瑞,等.大肠癌组织中unc5c基因启动子甲基化的分析[J].肿瘤防治研究,2010,37(6):683-686.

[2]蔡艳,魏万里.神经突起生长导向因子Netrin-1与肿瘤的关系[J].现代肿瘤医学,2013,21(4):878-880.

[3]杨昀,王勇,杜燕,等.轴突导向因子netrin-1在滋养层细胞侵袭中的作用[J].中华妇产科杂志,2009,44(2):131-134.

[4]武洁,王光川,陈学军.UNC5C蛋白在大肠癌中的表达及其与预后的关系[J].医学与哲学,2012,33(8):46-48.

[5]文灿.神经突起导向因子Netrin-1参与肿瘤发生研究进展[J].局解手术学杂志,2011,20(1):78-80.

[6]Coissieux MM,Tomsic J,Castets M,et al.Variants in the netrin-1 receptor UNC5C prevent apoptosis and increase risk of familial colorectal cancer[J].Gastroenterology,2011,141(6):2039-2046.

[7]Hibi K,Mizukami H,Shirahata A,et al.Aberrant methylation of the netrin-1 receptor genes UNC5C and DCC detected in advanced colorectal cancer[J].World J Surg,2009,33(5):1053-1057.

[8]Tanikawa C,Matsuda K,Fukuda S,et al.p53RDL1 regulates p53-dependent apoptosis[J].Nat Cell Biol,2003,5(3):216-223.

[9]Hibi K,Sakata M,Sakuraba K,et al.Changes in UNC5C gene methylation during human gastric carcinogenesis[J].Anticancer Res,2009,29(11):4397-4399.

[10]David W.Sharp.Personalized therapy arrives for patients with colorectal cancer[J].SCI,2009,319(5322):1918-1920.

[11]Wetzel-Smith MK,Hunkapiller J,Bhangale TR,et al.A rare mutation in UNC5C predisposes to late-onset Alzheimer′s disease and increases neuronal cell death[J].Nat Med,2014,20(12):1452-1457.

[12]Küry S,Garrec C,Airaud F,et al.Evaluation of the colorectal cancer risk conferred by rare UNC5C alleles[J].World J Gastroenterol,2014,20(1):204-213.

[13]Daubaras M,Dal Bo G,Flores C,et al.Target-dependent expression of the netrin-1 receptor,UNC5C,in projection neurons of the ventral tegmental area[J].Neuroscience,2014,28(260):36-46.

[14]Purohit AA,Li W,Qu C,et al.Down syndrome cell adhesion molecule (DSCAM) associates with uncoordinated-5C (UNC5C) in netrin-1-mediated growth cone collapse[J].J Biol Chem,2012,287(32):27126-27138.

Correlation analysis of methylation status of UNC5C gene promoter with colorectal cancer UNC5C*

SunDongsheng1,GaoChunyan1,WangZhigang2,LiuNing1,JiaFengjie1

(1.DepartmentofOncology,KailuanGeneralHospital,Tangshan,Hebei063000,China;2.CollegeofLifeScience,NeimengguUniversity,Huhehaote,Neimenggu010021,China)

Objective To investigate the correlation between methylation status of UNC5C gene promoter with colorectal cancer UNC5C.Methods 54 cases of sporadic colorectal cancer and related normal mucosal tissue,as well as 6 colon cancer cell lines and fiber cell lines(FCL) in the oncology department of the Kailuan General Hospital from February 2010 to March 2013 were selected as the research objects and performed the mRNA and methylation analysis for exploring the correlation between the netrin-1 receptor UNC5C defects with colorectal cancer disease.Results mRNA of UNC5A and UNC5B was expressed in the detected colorectal cancer cell lines.Except FCL for UNC5C,all of the cancer cell lines had no mRNA expression.In colorectal cancer tissue,UNC5C methylation was significantly higher than that in the normal mucosa,the difference was statistically significant (P<0.05).The methylation levels of UNC5C gene in the stage Ⅰ to Ⅱ,and the stage Ⅲ to Ⅳwere significantly higher than non-methylation levels,the differences were statistically significant (P<0.05).The correlation analysis by the Spearman method showed that the UNC5C defects was positively correlated with colorectal cancer disease (r=0.856,P<0.05).Conclusion Netrin-1 receptor UNC5C defect has certain correlation with colorectal cancer disease.

Netrin-1 receptor;UNC5C defects;colorectal neoplasms;relevance

·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.11.015

中国煤炭工业协会2012年度科学技术研究指导性计划项目(MTKJ 2012-420)。

孙冬生(1963-)，副主任医师，博士研究生，主要从事基因甲基化与肿瘤关系研究。

R735.3

A

1671-8348(2015)11-1487-03

2014-07-08

2015-01-10)