反相高效液相色谱法测定根皮苷平衡溶解度与油水分配系数*

戚志华，郭淑云，唐秀玲，李晓晔，王庆伟

(1.第四军医大学唐都医院药剂科，西安 710038；2.第四军医大学药学院药物化学教研室，西安 710032)

·药物制剂与药品质量控制·

反相高效液相色谱法测定根皮苷平衡溶解度与油水分配系数*

戚志华1，郭淑云1，唐秀玲1，李晓晔2，王庆伟1

(1.第四军医大学唐都医院药剂科，西安 710038；2.第四军医大学药学院药物化学教研室，西安 710032)

目的 建立根皮苷的含量检测方法，测定其在不同溶剂中的平衡溶解度及在正辛醇-水缓冲体系中的油水分配系数。方法 采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定根皮苷在水和不同溶剂中的平衡溶解度；色谱条件为：Inertsil ODS-3柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，乙腈-0.05%磷酸(30：70)为流动相，流速1.0 mL·min-1，检测波长284 nm。采用摇瓶法测定油水分配系数。结果 25 ℃时根皮苷在水中的平衡溶解度为2.07 mg·mL-1，在甲醇中的溶解性较好，为838.63 mg·mL-1。在0.054 9～1.098 μg浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y=2 152.9X+7.26(r=0.999 9)；根皮苷在醇中的溶解度较高。结论 根皮苷的RP-HPLC含量测定方法专属性强、灵敏度高，该方法可用于根皮苷溶解度的测定。根皮苷在石油醚中几乎不溶，在水中的溶解度较低，在甲醇中的溶解度较高；根皮苷的表观分配系数在酸性环境中变化不大，在碱性条件下随pH值增加明显下降。

根皮苷；平衡溶解度；表观油水分配系数

根皮苷(phloridzin，化学式：C21H24O10)是根皮素(phloretin)的2’-β”-D-葡萄糖苷，属于植物黄酮类中的二氢查尔酮苷，主要存在于苹果属多种植物中，在根、茎、叶及果实中均有分布。与其他黄酮类相比，二氢查尔酮苷在自然界很少存在，被称为少数黄酮类[1]。根皮苷具有多种生物学活性，如降血糖、平衡雌激素、保护心脏及抗氧化等。并且具有低毒的特点，这使其在医学、化妆品、食品、植物组织培养等领域得到广泛应用[2-4]。由于根皮苷具有治疗糖尿病的作用，欧美国家已用其生产药品；而我国有关根皮苷的研究不多[5]。笔者在本实验中测定根皮苷在不同溶剂中的平衡溶解度，以及在正辛醇-水缓冲体系中的表观油水分配系数，对其溶解性和渗透性进行初步考察，以期为根皮苷的体内吸收代谢及其他相关药学研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 安捷伦1200型液相色谱仪，1200紫外检测器；电子分析天平(BP211D型，德国Sartorius 公司，感量：0.01/0.1 mg)；恒温水浴振荡器(SHZ-B型，上海跃进医疗器械厂)；离心机(TGL-16C型，上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试药 根皮苷对照品[第四军医大学药学院药物化学教研室制备，制备色谱柱YMC-Park R&D ODS-A-column(20 mm×250 mm,5 μm,YMC Co,Ltd.Japan)，经红外、质谱鉴定，高效液相色谱法测得含量为99.3%，批号：20120626，样品存放于阴凉干燥处]。乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20110712，分析纯，含量≥99.5%)，无水甲醇(成都市科龙化工试剂厂，批号：2013101501，分析纯，含量≥99.5%)，无水乙醇(安徽安特食品股份有限公司，批号：1311073601，分析纯，含量≥99.5%)，石油醚(天津市富宇精细化工有限公司，批号：20121226，分析纯，含量≥99.5%)，乙醚(天津市天力化学试剂有限公司，批号：20130510，分析纯，含量≥99.5%)，正辛醇(天津市恒兴化工试剂制造有限公司，批号：20101109，分析纯，含量≥99.5%)，正丁醇(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20130621，分析纯，含量≥99.5%)，三氯甲烷(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20121014，分析纯，含量≥99.5%)，乙酸乙酯(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20130110，分析纯，含量≥99.5%)，丙二醇(天津市天力化学试剂有限公司，批号：20100502，分析纯，含量≥99.0%)，丙酮(天津市化学试剂六厂，批号：20090312，分析纯，含量≥99.7%)，纯化水(美国Millipore纯水系统)。

2 方法与结果

2.1 根皮苷对照品溶液的制备 取根皮苷对照品5.49 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加甲醇充分溶解并定容。摇匀后精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容，即得浓度为54.9 μg·mL-1根皮苷对照品溶液。

2.2 色谱条件及系统适用性实验 色谱柱：Inertsil ODS-3(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.05%磷酸(30：70)；流速 1 mL·min-1；检测波长为284 nm，柱度为室温。按照以上色谱条件，取根皮苷对照品溶液进样，测得根皮苷峰的保留时间为4.3 min(理论塔板数按根皮苷峰计不低于1×104，对称因子为0.96)，其杂质对主峰测定无干扰。色谱图见图1。

1.根皮苷

2.3 线性关系考察 精密量取根皮苷对照品溶液(54.9 μg·mL-1)1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 μL分别进样，注入液相色谱仪，记录峰面积。以根皮苷对照品进样量(X)为横坐标，峰面积值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。其回归方程为Y=2 152.9X+7.26(r=0.999 9)，可见根皮苷在0.054 9～1.098 μg 范围内线性关系良好。

2.4 精密度实验 精密吸取同一浓度根皮苷对照品溶液测定峰面积，连续进样6次。RSD =0.15%，表明仪器精密度较好。

2.5 重复性实验 精密吸取适量根皮苷对照品溶液，加甲醇稀释成6份同一浓度的对照品溶液，上述色谱条件进样检测并计算峰面积。RSD=0.37%，表明该方法重复性较好。

2.6 稳定性实验 精密吸取同一根皮苷对照品溶液，按上述色谱条件分别在0，1，4，8，12，24 h进样检测。根皮苷峰面积的 RSD =0.35%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

2.7 根皮苷的溶解性实验

2.7.1 根皮苷在不同溶剂中的平衡溶解度 取过量根皮苷对照品，配制以下11种溶剂的根皮苷溶液，溶剂分别为水、无水甲醇、无水乙醇、石油醚、乙醚、丙二醇、正辛醇、正丁醇、乙酸乙酯、三氯甲烷及丙酮，超声至不再溶解，置于25 ℃恒温水浴振荡器中(保持100 r·min-1)振摇24 h，待溶液充分平衡后取出，即得根皮苷饱和溶液。10 000 r·min-1离心10 min，取上清液得供试品溶液，用RP-HPLC法测定根皮苷在以上各溶液中的溶解度[6]。实验平行3 次，结果见表1。

2.7.2 根皮苷在不同pH缓冲溶液中的平衡溶解度 配制磷酸盐缓冲液(pH=6.6)，用氢氧化钠和磷酸调节一系列pH 为2.0，4.4，5.6，6.6，7.4，8.8，10.3和11.2的磷酸盐缓冲液，再分别制备各缓冲液的根皮苷过饱和溶液，经快速混合器中震荡0.5 h，静置0.5 h，重复操作3次后，14 000 r·min-1离心10 min，各吸取上清饱和液，稀释后进样，根皮苷在pH为2.0，4.0，5.6，6.6，7.4，8.8，10.3，11.2溶液中的溶解度分别为2.054，1.208，1.294，1.691，2.771，20.955，24.307，32.077 mg·mL-1(图2)。

表1 不同溶剂中的溶解度(25 ℃)

Tab.1 Solubility in different solvents (25 ℃)

mg·mL-1

图2 根皮苷在25 ℃不同pH值缓冲溶液中的平衡溶解度

Fig.2 Equilibrium solubility of phloridzin in different buffer solution at 25 ℃

2.7.3 根皮苷在正辛醇/水系统中的表观分配系数 取适量根皮苷对照品溶于饱和正辛醇中，使溶液呈饱和状态，静置，3 000 r·min-1离心10 min，精密吸取上清液0.5 mL于10 mL 具塞试管中，分别加入正辛醇饱和的水及“2.7.2”项下一系列不同pH值磷酸盐缓冲液各5 mL。快速混匀震荡0.5 h ，静置0.5 h，重复操作3次，吸取下层水相，14 000 r·min-1离心10 min，适当稀释后测定根皮苷浓度，并按公式Kow=(CoVo-CwVw)/CwVw计算表观油水分配系数(Kow：根皮苷的表观分配系数；Co：根皮苷在正辛醇相中初始浓度；Cw：分配平衡时根皮苷在水相中浓度；Vo：正辛醇相体积；Vw：水相体积)，结果见图3。

3 讨论

对根皮苷进行紫外全波长扫描发现其最大吸收波长有两处，分别为220和284 nm，由于在波长284 nm下基线平稳、仪器噪音响应较小，故选择284 nm为根皮苷的紫外检测波长。实验比较了洗脱系统乙腈-水、甲醇-水[6]，发现在乙腈-水系统中色谱峰峰形、分离度均较好，水相中加入0.05%磷酸后对分离效果及前沿现象有很大改善，得到的色谱峰峰形对称，分离效果最佳，故确定乙腈-0.05磷酸溶液为流动相。

图3 根皮苷在正辛醇/水缓冲液系统中的表观分配系数

Fig.3 Apparent partition coefficients of phloridzin inn-octyl alcohol/water buffer

目前未见测定根皮苷溶解度及油水分配系数的报道，笔者在本实验中采用RP-HPLC法测定根皮苷的平衡溶解度。实验表明，根皮苷几乎不溶于石油醚，极微溶于三氯甲烷和乙醚，微溶于水，在甲醇中的平衡溶解度较高，在pH为11.2时溶解度最大。可见根皮苷为脂难溶化合物。推测是由于根皮苷结构中含有多个酚羟基，根据相似相溶原理，易溶于醇类。

药物需具备适宜的水溶性和脂溶性，以便透过生物膜脂质双分子层被人体吸收。正辛醇-水分配系数和正辛醇-缓冲溶液分配系数在预测药物吸收及定量结构上具有重要意义[7]。本实验测定根皮苷的表观油水分配系数，以期为药物成分构效关系、吸收代谢研究提供参考。

[1] CHRISTIAN G，HEIDI H，KARL S.Phloridzin：biosynthesis，distribution and physiological relevance in plant[J].Phytochemistry，2010，71(8-9)：838-843.

[2] 冯雪娇，曹学丽，李艳，等.根皮苷的应用及分离纯化研究进展[J].北京工商大学学报(自然科学版)，2008，26(4)：13-16.

[3] 张宏岐，汪望植，邹坤，等.湖北海棠提取物的体外抗氧化活性研究[J].食品科技，2008，33(11)：183-184.

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[5] 谢阳，赖维，万苗坚，等.荔枝果皮中的美白剂根皮苷的提取、纯化及鉴定[J].中国美容医学，2008，17(7)：1032-1034.

[6] 李辰，陈卫林，郭玫，等.锁阳中儿茶素、根皮苷的提取及含量测定[J].五邑大学学报(自然科学版)，2011，25(1)：23-28.

[7] 孙进.现代药物制剂技术丛书——口服药物吸收与转运[M].北京：人民卫生出版社，2006：345-346.

Determination the Equilibrium Solubility and Apparent Oil/Water Partition Coefficient of Phloridzin by RP-HPLC

QI Zhihua1, GUO Shuyun1,TANG Xiuling1, LI Xiaoye2, WANG Qingwei1

(1.DepartmentofPharmacy,TangduHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710038,China;2.DepartmentofMedicinalChemistry,SchoolofPharmacy,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032，China)

Objective To establish a reversed-phase high performance liquid chromatograph (RP-HPLC ) method for determination of equilibrium solubility and oil/water partition coeficient of phloridzin in different solvents. Methods A PR-HPLC method was established to detect the concentration of phloridzin in water and different organic solvents.The partition coefficients in then-octanol-water/buffer solution systems of phloridzin were determined by shaking flask method.The Inertsil ODS-3 (4.6 mm×150 mm, 5 μm) column was used and the detection wavelength was 284 nm.The flow rate was 1.0 mL·min-1, and acetonitrile- 0.05% phosphoric acid(30：70)was used as mobile phase. Results The equilibrium solubility of phloridzin was 2.07 mg·mL-1in water and 838.63 mg·mL-1in methanol at 25 ℃.A good linear relationship of phloridzin was obtained within the range of 0.054 9-1.098 μg.The regression equation wasY=2 152.9X+7.26 (r=0.999 9).The solubility values of phloridzin were higher in ethanol and propylene glycol than in other solvents. Conclusion RP-HPLC method is simple, quick and accurate for the determination of phloridzin.Phloridzin was almost insoluble in petroleum ether and poorly soluble in water.The equilibrium solubility is higher in methanol than in other solvents.The apparent distribution coefficient of phloridzin varies significantly with pH under the alkaline conditions but less in the acidic solution.

Phloridzin；Equilibrium solubility ；Apparent oil/water partition coefficient

2014-03-25

2014-05-01

*“重大新药创制”科技重大专项(2011ZX09401-308-23)

戚志华(1980-)，女，陕西宝鸡人，主管药师，硕士，主要从事生药学及新药研发。电话：029-84777648，E-mail：qzhlily@aliyun.com。

王庆伟(1969-)，男，陕西乾县人，副主任药师，博士，主要从事药物代谢动力学研究。电话：029-84777716，E-mail：wqwlxy@163.com。

R286；R927.1

B

1004-0781(2015)10-1329-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.018