人体不同解剖部位表皮基底层中CD34蛋白表达及意义

胡明华 袁宪宇 吴长初 朱 喜

（1长沙医学院人体解剖学和组织胚胎学教研室，长沙410219；2中南大学湘雅三医院健康管理科，长沙410013）

CD34是人体内一种常见的高糖基化分子，其分子表面存在许多糖修饰表位，根据糖修饰表位的不同［1］，CD34被分成I型、Ⅱ型、Ⅲ型。CD34在临床上已经被证实为造血干细胞的特异性标志物，同时，CD34还在许多成体干细胞中表达。CD34可参与细胞与细胞、细胞与基质之间的粘连，具有不同的生物学功能及生物学结构活性，可广泛分布在大多数白细胞、红细胞、成纤维细胞、上皮细胞、角质细胞、神经胶质细胞中。表皮组织具有强大的修复能力，主要是由于表皮干细胞的作用，但由于表皮干细胞缺乏特异性的CD分子标志物［2］，因此，寻找一种与表皮干细胞密切相关的标志物则十分重要。本研究采用组织学观察法、双免疫标记法、流式细胞术检测人包皮、头皮和躯干皮肤来源的组织标本中CD34蛋白表达，探讨CD34蛋白作为表皮干细胞的标志物的可行性。

材料和方法

1.材料

分别选取2013年1月至2014年1月在我院泌尿外科进行包皮环切术患者包皮组织标本60份，其中20份供者年龄＜20岁，20份供者年龄20－40岁，20份供者年龄40岁以上。选取同时期健康者头皮和躯干皮肤来源的组织标本各60份，头皮组织和躯干皮肤均来源于自愿者，均签署知情同意书。

2.方法

2.1 CD34免疫组织化学

组织标本均制成1 cm×0.5 cm的皮片，在4%多聚甲醛中进行固定，过夜后对组织进行梯度脱水，再用石蜡包埋，切片，厚度为5μm。首先将石蜡切片浸于一抗（CD34∶1∶50）中孵育，4℃过夜，使用PBS进行漂洗，室温平衡20 min，加入酶标抗兔／鼠聚合物孵育，室温30 min，DAB显色，苏木素进行复染，乙醇进行梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在普通光学显微镜进行观察。采用SP法测定组织细胞中CD34，兔抗人CD33单克隆抗体有北京金桥生物公司提供。空白对照：使用PBS代替一抗作阴性对照，结果提示阴性；使用己知阳性切片作阳性对照，结果提示阳性，其他步骤与实验标本相同。结果观察：CD34组织着色棕色为阳性。

2.2 免疫双标记

体外分离培养包皮基底层细胞，分别在原代，3代，6代时，进行免疫荧光双标记染色检测。细胞经PBS漂洗，将培养基成分充分去除，加入4%中性多聚甲醛固定20 min；PBS充分漂洗，10%正常山羊血清进行封闭，后加入一抗（CD34各表位BI.3C5，QBend，581，B，整合素，p63），4℃孵育过夜，PBS漂洗，加入anti.Mouse IgG／Dy Light488（1：200），anti.Rabbit IgG／Dy Light594，室温下孵育2 d；PBS漂洗，荧光显微镜下观察各蛋白的表达情况。

2.3 流式细胞术

皮肤组织修整为l cm×0.5 cm大小的皮片。并按照上述分离富集表皮基底层细胞的方法获取表皮基底层细胞。获得细胞分别与CD34的三种表型p63或者β1整合素进行孵育，含BSA的PBS漂洗后，加入FITC.conjugated goat anti.mouseIgG（BD Pharmingen）作为二抗。用PBS溶液代替一抗，其他步骤相同作为空白对照。经流氏检测，记录各表位的阳性率。

3.统计学方法

所有数据均用SPSS19.0软件处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，计数资料用率表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.CD34蛋白的表达

CD34蛋白在人包皮和头皮的表皮基底层细胞中有表达，而在人躯干皮肤的表皮中无表达。并且，在同一组织内，不同表位的CD34蛋白的表达也不均衡。Ⅰ型表位CD34蛋白的分布比Ⅱ、Ⅲ型表位CD34蛋白更加广泛（图1）。A1提示CD34主要表达在头皮及包皮的表皮基底层细胞，A2提示在躯干皮表皮中未发现CD34各表位的表达。细胞的子细胞CD34阳性的细胞在表皮中的分布与表皮干细胞的分布基本相同，均主要在表皮突的底部。

图1 CD34各表位在头皮、包皮、躯干皮的分布情况。标尺＝50μmFig.1 CD34 epitope distribution in each scalp，foreskin，the skin of the trunk.Bar＝50μm

2.CD34阳性细胞与ESCs特征性标记表达情况

利用β1整合素或是p63对分离的基底层细胞进行分选能够获得ESCs，CD34阳性细胞同时表达p63或者β1整合素，并且CD34三种表位在体外培养的细胞中的表达随着细胞传代而减少。CD34阳性细胞、p63、β1整合素在原代及3代细胞中均存在表达，且与传代阳性数目呈负相关性。

3.不同年龄CD34的表达情况

CD34I型表位阳性表达率均明显高于II型和III型（P＜0.05），不同年龄组的CD34各表位之间比较，阳性率无明显差异（P＞0.05，表1）。

表1 流式细胞术检测不同年龄CD34不同表位的表达（±s）Table 1 FCM different ages different epitopes CD34 expression（±s）

表1 流式细胞术检测不同年龄CD34不同表位的表达（±s）Table 1 FCM different ages different epitopes CD34 expression（±s）

年龄（岁）Age（years）例数Cases CD34表位（CD34 epitope）Ⅰ型（Ⅰtype） Ⅱ型（Ⅱtype） Ⅲ型（Ⅲtype）＜20 20 35.04±2.41 8.92±0.30 20.63±1.12 20－40 20 35.49±2.67 9.27±0.90 20.48±0.81＞40 20 35.39±2.01 9.32±1.24 20.68±1.12

讨 论

ESCs（胚胎干细胞）是皮肤自我修复及自我更新的关键，部分潜在的ESCs标记可分离ESCs与角质细胞。部分研究显示，ESCs重点分布在表皮突的深嵴部，CD34各个表位的阳性细胞同时也分布于表皮突的底部，分布于嵴间的略可见少许散在表达的CD34细胞，因此，在表皮分布区，可见到分布特征类似的ESCs与CD34。选用CD34蛋白作为筛选ESCs的潜在表面标记具有以下几种优点：一是皮肤可以不断的进行自我更新；二是ESCs的数量不会随着年龄的增长而减少；三是ESCs在环境刺激又到下发生转分化的能力不会随着年龄的增长而变弱。

表皮干细胞主要存在于表皮细胞的表皮突底部，在皮肤受到损伤时，能够起到重要的自我修复作用［4］。而在研究中发现［5］，表皮干细胞的表面无特异性的CD分子标志物，传统的研究中，主要使用β1整合素以及p63作为表皮干细胞的分选标记［7］。

实验发现，表皮细胞中的CD34阳性细胞存在于表皮的表皮突底部，与表皮干细胞的分布十分相似。研究发现［8］，CD34阳性细胞同时存在β1整合素和p63的表达，因此，CD34阳性细胞有可能作为表皮干细胞分选的标志物。但CD34阳性细胞仅存在在于头皮和包皮的基底层细胞中，而在躯干皮的基底层细胞中无表达，因此，其仅可能用于分选头皮和包皮的表皮干细胞。实验发现，CD34蛋白在表皮内的含量并不会随着年龄的增长而减少，作为分选表皮干细胞的标志物，CD34蛋白更加稳定。在头皮和包皮的表皮干细胞分选中，CD34蛋白是更加理想的分选标志物。

但在某些实验室进行的CD34检测实验中，检测结果存在严重差异，整合以往的资料，存在此种现象的原因可能分别以下几种：（1）早期的实验只进行单一的Ⅱ型表位检测，因此在同时进行CD34的多种表位，可以更加清晰的表述CD34的表达状态；（2）检测部位的不同可能导致结论不同；（3）不同的实验室可能采取的实验方法存在差异，因此导致实验结果的差异。针对上述情况，试验中我们选取了不同解剖部位的皮肤进行CD34表位的表达情况的研究，可以找出早期实验中存在差异结果的原因。

综上所述，CD34阳性分子与表皮干细胞在头皮和包皮的表皮基底层细胞中有十分相似的分布，可以作为头皮和包皮中表皮干细胞分选的标志物，但其还需要不断深入的研究，同时，ESCs具备多向分化的能力，且其自身多潜能的能力仍然在不断发展，因此，在未来的研究中，ESCs将会更多的应用于临床与动物疾病模型中。

［1］牛云飞，路卫，夏照帆等.表皮干细胞在人体不同部位皮肤的分布差异.第二军医大学学报，2004，25（9）：959－961

［2］Aniket S.Wadajkar；Sonia Santimano；Liping Tang，et al.Magnetic－based multi－layer microparticles for endothelial progenitor cell isolation，enrichment，and detachment.Biomaterials，2014，35（2）：654－663

［3］刘爱军，黄锦桃，李海标.胚胎干细胞源性表皮干细胞对小鼠全层皮肤缺损的修复.解剖学报，2007，38（3）：296－299

［4］Jiang S，Zhao L，Purandare B，et al.Differential expression ofstem cell markers in human fo licular bulge and interfollicular epidermal compartments.Histochem Cell Biol，2010，133（4）：455－465

［5］Kai－Hong J，Jun X，Kai－Meng H，et al.P63 expression pattern during rat epidermis morphogenesis and the role of p63 as a marker for epidermal stem cells.J Cutan Pathol，2007，34（6）：154－159

［6］林吉茂，卿素珠，成醒民等.山羊胚胎皮肤的发育及β1整合素在发育中的表达.中国组织工程研究与临床康复，2007，2（37）：7337－7340

［7］黄培信，刘德伍，王肖蓉等.不同发育阶段人皮肤表皮干细胞增殖分化相关基因的表达特征.中国组织工程研究与临床康复，2009，13（23）：4442－4446