白塞病患者及正常人外周血免疫细胞群的比较研究

樊 超 陈宏翔

（1深圳市福永人民医院皮肤科，广东518103；2华中科技大学同济医学院附属协和医院皮肤科，武汉430022）

白塞病（Behcet’s disease，BD）又称贝赫切特综合征（Behcet’s syndrome），是一种病因未明的自身免疫性疾病，缺乏特异性的实验室诊断指标和特殊的病理组织学改变，造成临床上对该病诊断困难，部分病例甚至长期误诊。目前，BD的发病机制尚不清楚，但越来越多的研究表明，免疫因素在BD发病中起重要作用。本研究对22例BD患者及正常人外周血免疫细胞群进行了比较研究。

材料和方法

1.研究对象

2011年3月至2011年12月期间我院皮肤科门诊BD患者22例（12例女性，10例男性），所有BD患者均符合日本白塞病研究委员会1987年修订的诊断标准［1］。BD稳定期（stable BD，SBD）患者8例，为前22例患者中经治愈并已停药3个月的病例。正常人（normal control，N）22例，均来自年龄和性别匹配的健康体检者。

采集BD患者外周血标本时，有14例未接受任何治疗，4例仅接受中成药复方丹参针剂注射，还有4例接受复方丹参针剂注射和秋水仙碱治疗。8例接受治疗的患者在标本采集之前24小时均未进行任何治疗。

2.实验材料

2.1 仪器

FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences，San Diego，CA）；CO2细胞培养箱（购自美国Forma公司）；离心机（购自美国Sigma公司）。

2.2 试剂

抗人 CD4－FITC抗体 （eBioscience，Cat.NO.11－0048），抗人 CD8－PE（eBioscience，Cat.NO.12－0087）；抗人 CD28－APC抗体 （eBioscience，Cat.NO.17－0289）。

3.方法

3.1 红细胞裂解液

NH4CL 4.16 g，KHCO30.5 g，EDTA.2Na 0.02 g，溶于100 ml水中，调p H至7.2，补充水至500 ml，4℃贮存，使用时需恢复至室温。3.2流式细胞术（flowcytometry，FCM）检测细胞表面分子

以无菌方式采集BD患者（n＝22）及正常人（n＝22）外周血5 m1，经肝素抗凝。37℃保存，立即送检。ICOS及其他免疫分子在外周血T细胞亚群上的表达水平采用FACSCalibur流式细胞仪进行分析。首先，取100μl全血与适当体积的相应抗体及同型对照抗体在室温避光孵育30 min，加入2 ml流式细胞仪专用红细胞裂解液室温避光孵育10 min，加入5 ml PBS以1000 r／min离心10 min，弃上清，同法洗涤3次后，立即进行三色流式细胞术检测与分析。

4.统计学处理

结果以（Mean±SED）表示。外周血T细胞亚群及其CD28共表达水平在BD活动期患者及正常健康对照组之间的比较采用非参数Kruskal－Wallis U rank sum test进行分析。所有统计学处理均采用SPSS 10.0统计软件进行分析。

结 果

BD患者及正常人外周血免疫细胞群的比较：为研究BD患者体内细胞免疫水平，我们首先采用流式细胞术检测了活动期BD患者外周血免疫细胞群的比例变化，结果发现：患者体内CD4＋T细胞比例与正常人相比并无明显变化，而CD8＋T细胞的比例却显著升高（P＜0.05），导致CD4＋／CD8＋的比例明显下降（P＜0.05）。此外，BD患者外周血CD28细胞比例与正常人相比无明显变化（表1）；而SBD与ABD患者之间CD4＋／CD8＋比值无明显变化（见表2）；进一步分析CD4＋和CD8＋T细胞上CD28＋ 的表达水平，发现BD患者CD4＋T细胞及CD8＋T细胞上CD28＋表达水平较正常人明显降低（P＜0.05）（表3）。以上结果支持BD患者体内存在免疫细胞群比例的紊乱，值得进一步研究免疫功能缺陷与疾病的关系。

表1 BD患者与正常人外周血免疫细胞群比例的比较Table 1 Percentages（%）of peripheral blood cell subsets in patients of BD and normal individuals

表2 SBD患者与ABD患者外周血免疫细胞群比例的比较Table 2 Percentages（%）of peripheral blood cell subsets in patients of SBD and ABD individuals

表3 BD患者及正常人外周血CD4＋T细胞及CD8＋T细胞表面CD28的阳性表达率Table 3 Percentages of CD28 on peripheral blood CD4 and CD8 T cells in patients of BD and normal individuals

图1 正常人及BD患者外周血CD4及CD8T细胞上CD28表达水平的代表图Fig.1 The expression level of CD28 with CD4T cells and CD8T cells in The normal persons and Behect＇s disease

讨 论

BD是一种累及皮肤粘膜、眼、滑膜、血管、肠道、肺和神经系统等多系统的血管炎性疾患。目前BD的发病机制尚不清楚，但是越来越多的研究显示，免疫因素在疾病发病中起重要作用。尽管在白塞病外周血中细胞活动是增加的，但有报道在儿童中的新生儿白塞病病例其受累妇女也提示体液因素的作用。不同的细胞因子和淋巴细胞的总数增高促使Th1型和Th2型淋巴细胞免疫应答失调，在我们以往的实验中得到证实［2］。正如T淋巴细胞对滤过性毒菌或细菌性病原体对抗原的特殊应答，由于其向感染区域浸润而倾向Th1型淋巴细胞应答。

最近发现T淋巴细胞亚型的畸变可激活CD8、CD29、CD56和CD69标记的高表达。在白塞病患者中CD8＋CD16＋和CD8＋CD56＋的T淋巴细胞亚类虽处于正常水平，但CD4＋CD16＋、CD4＋CD56＋、CD8＋αβ＋和CD8＋CD11b＋却显著增高，提示白塞病的T淋巴细胞激活与其它类型的炎症紊乱相类似。而且T淋巴细胞浸润到眼前房则进一步说明T细胞在眼白塞病的发病机制中起主要作用。而且最近的临床试验表明用人化的抗CD52单克隆抗体、CAMPATH－1 H（一种抗肿瘤药），采用淋巴细胞减少型疗法，再次表明T淋巴细胞的自体反应在白塞病发病过程中的重要作用。

一些研究显示CD8＋T淋巴细胞总数在血清中的浓度（外周血液中）都是上升的［3－6］，循环 CD4＋／CD8＋的比率下降。本实验研究发现BD患者CD4＋／CD8＋的比率与正常人相比明显下降，证实了上述观点。随着对BD研究的深入和检测方法的改进，人们发现BD的免疫紊乱与疾病的临床表现、严重程度以及检测所用的方法密切相关。本实验对有关BD的免疫学方面研究进行初步探讨。在实验中我们通过流式细胞术检测了BD患者外周血T细胞亚群，包括CD4＋和CD8＋T细胞及CD28＋细胞，我们的实验结果表明，BD患者体内存在较严重的免疫功能紊乱，主要表现在CD8＋T细胞比例上调导致CD4＋／CD8＋比值相对于正常人显著降低（表1），而SBD与 ABD患者之间CD4＋／CD8＋比值无明显变化（见表2）。说明BD患者体内T细胞处于过度活化状态，且免疫效应细胞的比例也大大增加，打破了体内疫平衡状态 。结果支持BD患者体内存在免疫细胞群比例的紊乱，值得进一步研究免疫功能缺陷与疾病的关系。

进一步分析CD4＋和CD8＋T细胞上CD28的表达水平，发现BD患者CD4＋T细胞及CD8＋T细胞上CD28表达水平较正常人明显降低（P＜0.05）（表3）。本实验结果显示BD患者体内存在免疫细胞群的紊乱，为临床诊断白塞病提供了相应的理论依据。

［1］Revised Japanese criteria for Behcet’s disease.Behcet’s Disease reseach committee of Japan 1987 congress news of the 6th SEAPAL congress of rheumatology 1988.

［2］樊超，郑劲锋，陈宏翔.人外周血Th细胞和Tc细胞内IFN－γ及IL－4表达水平与白塞病的关系.中国组织化学与细胞化学杂志，2011，20（1）：23－26

［3］Spalton DJ：Intraocular inflammation.in Spalton DJ，Hitchings RA，Hunter PA（eds）：Atlas of clinical ophthalmology.London，Mosby，1994，pp 1－32

［4］Hamzaoui K，Hamzaoui A，Guemira F，et al：Cytokine profile in Behcet’s disease patients.Relationship with disease activity.Scand J Rheumatol，2002，31：205－210

［5］Houman H，Hamzaoui A，Ben Ghorbal I，et al：Tc1／Tc2 ratio in the inflammatory process in patients with Behcet’s disease.Mediators Inflamm，2004，13：247－253

［6］Raziuddin S，al－Dalaan A，Bahabri S，et al：Divergent cytokine production profile in Behcet’s disease.Altered Th1／Th2 cell cytokine pattern.J Rheumatol，1998，25：329－333