中国解剖学会第十四届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会暨第十一届组织学与胚胎学教学与科研技术研讨会论文汇编

2015年7月25日—27日

山东 潍坊

1.萝卜硫素对糖尿病视网膜病变的保护作用及相关机制研究 任翔 刘俊丽 张成鸿 孔力 大连医科大学组织胚胎学教研室大连116044 糖尿病视网膜病变（DR）是一种由高血糖引起氧化应激所致的神经退行性病变。硫氧还蛋白（Trx）通过其二硫化物还原酶与过氧化物还原酶活性，在体内各系统中行使多种氧化还原功能。萝卜硫素（SF）是西兰花等十字花科蔬菜中的提取物，前期研究发现它可通过上调Trx水平对Tubby基因变异小鼠视网膜感光细胞退变起到保护作用。我们在前期研究的基础上，进一步探讨了SF对DR视网膜细胞退行性变性的保护作用及相关作用机制，以期为临床治疗DR提供关键靶点和新的理论依据。研究利用Balb／c小鼠和Neuro 2A细胞分别进行。体内实验分为正常组和高脂高糖饲料＋STZ诱导的2型糖尿病组；体外实验分为正常组和高糖处理组。采用HE染色进行视网膜形态学观察和外核层计数，同时进行视网膜凝集素标记血管形态。流式细胞术进行细胞凋亡检测；Real time PCR和Western blot对相关基因和蛋白表达进行检测。结果表明，糖尿病视网膜病变早期是一种以感光细胞丢失为重要特征的退行性病变，SF可通过上调Trx的表达，抑制其下游ASK1／p38／Txnip凋亡信号通路的激活，从而减少视网膜感光细胞的损伤，延迟DR的发生。

2.萝卜硫素介导Trx上调对2型糖尿病小鼠耳蜗毛细胞的保护作用及相关机制 扶玉珍1刘俊丽1刘渤1孔慧2孔力1大连医科大学：1组织学与胚胎学教研室；2第二附属医院耳鼻喉科 大连116044 长期高血糖所致的氧化应激是糖尿病性耳聋发生发展的关键因素。研究证实萝卜硫素（SF）能上调Tub小鼠耳蜗组织中硫氧还蛋白（Trx）的表达从而延迟耳蜗毛细胞的退行性变。本实验以高脂高糖饲料喂养及1%链脲估菌素（STZ）腹腔注射复制2型糖尿病小鼠模型。通过SF及Trx抑制剂（PX－12）的联合作用，探讨SF对糖尿病小鼠耳蜗毛细胞的保护作用及其机制。首先，将Balb／c小鼠分为正常组（Control）及2型糖尿病（T2DM）组，继之以不同剂量SF（0.5mg／kg，1mg／kg，2mg／kg）及同一剂量的SF不同给药时间（5d，10d，15d）分别处理T2DM组，分析各组小鼠耳蜗毛细胞的缺失与耳蜗组织中Trx表达水平的相关性，以确定SF的最佳用药剂量和最适用药时间。最后用SF和PX－12对Control组和T2DM两组进行平行处理，重新分为对照组、治疗组（SF）、和实验组（SF＋PX－12）。通过琥珀酸脱氢酶（SDH）染色进行耳蜗毛细胞计数及HE染色进行形态学分析；免疫荧光组织化学检测耳蜗组织中Trx及ASK1的表达；实时定量PCR检测耳蜗组织中Trx及Txnip的的基因表达水平；Western blot方法检测Trx、p－Erk、Nrf2、Ask1的蛋白表达水平。结果显示，与正常组比较各T2DM组小鼠耳蜗毛细胞计数显著减少，Trx、p－Erk、Nrf2的蛋白表达水平明显下调；Txnip基因、ASK1蛋白表达水平明显上调。单纯给与SF处理T2DM组与T2DM对照组比较时毛细胞计数显著增加，Trx、p－Erk、Nrf2的蛋白表达水平上调，Txnip基因、ASK1蛋白表达水平下调；而SF＋PX12联合处理组与单纯给与SF的T2DM组比较时，毛细胞计数明显减少，Trx、p－Erk、Nrf2的蛋白表达水平呈下调趋势，Txnip基因表达水平、ASK1蛋白表达水平呈上调趋势。以上结果提示萝卜硫素可通过作用于p－Erk／Nrf2抗氧化信号通路介导糖尿病小鼠耳蜗组织中Trx的表达上调，从而抑制ASK1／p－Jnk／p38MAPK凋亡通路的激活，对高糖引起的耳蜗毛细胞退行性变起保护作用。

3.萝卜硫素对2型糖尿病小鼠肾脏的保护作用及机制 刘俊丽 张恩鹏 孔力 大连医科大学组织学与胚胎学教研室 大连116044 糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常见的微血管并发症，也是引起终末期糖尿病肾病（end stage renal disease，ESRD）的主要原因。糖尿病时的高糖环境会引起体内活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的增加，并通过还原性辅酶Ⅱ等途径引起足细胞凋亡、脱失，进而引起DN的发生和发展。我们前期的研究发现，高糖时血管内皮细胞硫氧还蛋白（Trx）表达下调；糖尿病小鼠视网膜Trx表达呈下调趋势。为探讨DN的发病及保护机制，本实验以高脂高糖饲料和链脲佐菌素（STZ）联合诱导的2型糖尿病小鼠模型（T2DM）为研究对象，通过对DN小鼠肾小球及足细胞的形态学观察和Trx及Nrf2表达的检测，研究萝卜硫素SF对DN的保护作用及机制。将雄性Balb／c小鼠随机分为正常对照组、SF预防组、T2DM组和SF治疗组。石蜡切片HE染色结果表明，T2DM组肾小球增大，足细胞肥大且密度和数量减少；而治疗组肾小球与正常对照组相比，足细胞密度和数量虽有减少，但其大小均匀，在形态上较为相近。实时定量PCR和Western blot检测Trx和Nrf2的mRNA和蛋白表达水平显示，与正常对照组相比，T2DM组肾脏Trx和Nrf2表达呈下调趋势；而SF预防组则相对上调；与T2DM组相比，SF治疗组肾脏Trx和Nrf2表达明显上调，但未达到正常对照组表达水平。综上表明，SF能上调氧化还原系统中Trx表达，进而促进Nrf2的表达，减少ROS的生成，从而延缓或减少肾小球及足细胞的损伤，最终对DN起到保护作用。

4.下调硫氧还蛋白表达对AGEs诱导Neuro2A细胞凋亡的影响及相关机制 任翔 卢鹤媛 刘渤 孔力大连医科大学组织学与胚胎学教研室 大连116044 神经退行性疾病是一类慢性、进行性神经系统疾病。其共同的特征是神经元的退行性变性和凋亡。研究发现在多种神经退行性疾病中均有糖基化终末产物（AGEs）的积累。硫氧还蛋白（Trx）作为一种功能性蛋白不仅能够有效的清除机体内的活性氧族（ROS），还参与细胞的众多生理过程。为探讨Trx对AGEs诱导神经细胞凋亡的影响及相关机制，本实验中采用Trx抑制剂PX12，研究Trx对AGEs诱导Neuro2A细胞凋亡的影响及相关机理。研究中设置AGEs处理组、PX12处理组、PX12预处理AGEs组以及对照组；采用CCK8法检测细胞活性，DNA－Ladder、线粒体膜电位测定、流式细胞术等方法检测细胞凋亡，DCFH－DA法检测ROS活性及分光光度计法检测Caspase3酶活性，Real time－PCR检测硫氧还蛋白相互作用蛋白（Txnip）的表达，Western blot检测凋亡相关信号通路蛋白的表达。检测结果显示，Trx表达受到抑制后，AGEs诱发的Neuro2A细胞凋亡更为明显，ROS活性和Caspase3活性明显上升，Txnip表达亦明显上升，ASK1、p－JNK、PTEN明显升高，而p－AKT表达明显降低。上述结果提示，AGEs能上调Txnip表达、增加ROS及Caspase3活性，诱导Neuro2A细胞凋亡；Trx能有效抑制AGEs诱导Neuro2A细胞发生凋亡；其作用机制与Trx－ASK1－JNK和Trx－PTEN－AKT信号通路相关。

5.干扰Txnip表达对AGEs诱导Neuro2A细胞凋亡的影响及相关机制 邱媛媛任翔马海英孔力 大连医科大学组织学与胚胎学教研室 大连116044 糖基化终末产物（AGEs）在体内的不断积累是导致糖尿病及其并发症的重要因素，AGEs与其受体RAGE参与调节活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，破坏体内氧化还原平衡导致氧化应激（Oxidation Stress，OS），最终导致细胞凋亡。此外，我们的前期研究发现，AGEs诱导Neuro 2A细胞凋亡与AGEs作用下Txnip的过量表达呈正相关。本文选择采用RNA干扰技术设计针对Txnip的干扰序列，构建成sh RNA－Txnip，以研究Txnip对AGEs诱导Neuro2A细胞凋亡的影响及机制研究。结果显示：①构建sh RNA－Txnip质粒抑制Txnip的基因表达效果显著。②经AGEs处理后（AGEs＋），Real timePCR检测Txnip基因的表达与未处理组比较显著增加，p38MAPK抑制剂SB203580处理和转染sh Txnip干扰质粒后均能抑制AGEs所致的Txnip表达水平的上调。③AGEs＋组Trx蛋白表达水平与AGEs组比较蛋白水平表达下调；经SB203580预处理、转染sh Txnip干扰质粒预处理，均可抑制由AGEs所致的Trx的表达水平变化；采用Fluorescent Probe－DHE法检测细胞内活性氧的生成显示，AGEs处理Neuro 2A－LacZ细胞3 h后，胞质内荧光强度明显强于未处理组，而转染scramble、sh Txnip及sh Txnip和AGEs联合处理的实验组细胞内活性氧产生不明显。④流式细胞术检测结果显示，p38抑制剂和转染sh Txnip干扰质粒能保护AGEs所致的细胞凋亡。上述结果表明，Txnip是AGEs诱导细胞凋亡的关键，其机制与抑制ASK1的激活及ROS的产生有关，且受p38MAPK信号通路调节。

6.DIDS抑制氯离子通道ClC－2的表达减缓新生大鼠缺血缺氧性脑白质损伤 赵柏雄1全弘宇1马腾1田衍平2蔡其燕2李红丽2第三军医大学：1学员旅四营；2基础医学部组织学与胚胎学教研室和发育生物学教研室 重庆400038 缺血缺氧可引起新生儿脑白质病变（WMLs），常导致儿童脑瘫及认知障碍。已有的研究提示2型氯离子通道（ClC2）的异常表达参与炎症与细胞凋亡的发生，然而氯离子通道是否参与新生大鼠WMLs的发生，目前文献报道尚少。本研究选择新生4－5日龄SD大鼠，建立慢性脑缺血缺氧模型，在伤后不同时间给予Cl－通道阻断剂DIDS处理。结果显示，新生大鼠脑缺血缺氧损伤后白质中ClC－2 m RNA和蛋白表达均较正常组显著增高，且伴白质组织中活性氧浓度显著升高；iNOS、TNF－αmRNA的表达也大幅度增加。胼胝体等白质区髓鞘染色较正常明显浅淡；促凋亡蛋白Caspase－3与NG2阳性双标细胞数目比例则明显增多。在损伤早期应用DIDS后，观察到上述损伤均得到有效缓解。本研究证实新生大鼠脑缺血缺氧损伤后白质区Cl－通道表达升高且与氧化应激、炎症反应呈正相关，可导致由脑白质中Caspase－3介导的细胞凋亡增多和髓鞘发育受阻。伤后早期应用DIDS阻断Cl－通道开放后可明显降低Caspase－3介导的凋亡发生程度，提示早期使用DIDS可部分保护缺血缺氧损伤后的少突胶质细胞。

7.Omega－3多不饱和脂肪酸对新生大鼠缺血缺氧性脑瘫的治疗作用 慈维昊 魏寰宇 王朔 季皓 汪云李成仁 第三军医大学基础部组织胚胎学教研室 重庆400038 脑瘫是新生儿尤其是早产儿最常见最严重的并发症之一，缺血缺氧（HI）是主要原因，而脑白质是主要损伤部位，其中的晚期少突胶质细胞前体（OPCs）是主要受损靶细胞。脑黄金DHA的主要成分（ω－3多不饱和脂肪酸）对胎儿及婴儿的大脑特别脑白质的生长发育极为重要。但ω－3对HI所致脑白质损伤是否具有防治作用目前还不清楚。离体实验中，培养 OPCs，制作缺糖缺氧（OGD）模型，设对照组和ω－3组，应用LDH、CCK－8、Tunel染色、免疫荧光、Western blot和q－PCR等方法检测细胞受损以及分化情况。结果显示，与对照组相比，ω－3组细胞受损明显减轻，活性增高，凋亡细胞数目减少，而PDGFR－α、A2B5、NG2、CNPase、PLP和 MBP等少突胶质细胞相关蛋白和mRNA的表达明显增加。在体实验中，制备新生大鼠HI模型，设对照组和ω－3组，不同时相点取材，采用快蓝、Fluomeylin染色、Tunel染色、免疫荧光、Western blot和q－PCR检测脑白质受损情况，结果显示，与对照组相比，ω－3组的胼胝体区域髓鞘受损情况明显减轻，细胞凋亡数目减少，PDGFR－α、A2B5、NG2、CNPase、PLP和MBP等少突胶质细胞相关蛋白和m RNA的表达升高。动物成年后，应用旷场实验和水迷宫检测模型鼠成年后的运动能力和学习记忆能力，结果显示，与对照组相比，ω－3组动物的运动能力和学习记忆能力明显升高。本实验表明，ω－3可作为治疗新生鼠脑HI后白质损伤的药物，从而为新生儿脑瘫的防治提供新的方法和措施（本研究受重庆市自然科学基金cstc2013jcyj A10130资助）。

8.PIN1与突变亨廷顿蛋白毒性片段之间相互作用位点的分析 梁璇 彭挺 李和 华中科技大学同济医学院组织学与胚胎学教研室 武汉430030 亨廷顿病（Huntington＇s disease，HD）是一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病，由编码亨廷顿蛋白的IT15基因突变所致。IT15第一外显子中CAG重复数目异常增多，编码产生拥有超长多聚谷氨酰胺片段的突变亨廷顿蛋白。突变亨廷顿蛋白会激活多种蛋白水解酶，这些蛋白水解酶将突变亨廷顿蛋白切割成不同长度的N末端片段，称为突变亨廷顿蛋白毒性片段。这些毒性片段会在神经元内错误折叠并致密聚集，产生细胞毒性。我们的前期研究发现，肽基脯氨酰顺／反异构酶PIN1能与突变亨廷顿蛋白毒性片段相互作用，抑制其错误折叠并促进其降解，进而抑制其细胞毒性，然而二者间的具体结合位点和结合机制仍不明确。为了寻找PIN1与突变亨廷顿蛋白毒性片段之间的相互作用位点以及关键性氨基酸，我们分别构建了PIN1、突变亨廷顿蛋白毒性片段不同结构区域的缺失突变体和点突变体，利用免疫共沉淀以及荧光共定位分析的方法对二者之间的相互作用位点进行了分析，明确了PIN1与突变亨廷顿蛋白毒性片段之间的相互作用位点、关键性氨基酸，以及可能存在的分子作用机制，将为深入了解突变亨廷顿蛋白异常聚集和HD的发病机制提供了新的实验证据。

9.高血糖对阿尔茨海默病转基因小鼠脑内老年斑沉积AGEs／RAGE／NF－κB信号通路的影响 王旭辽宁中医药大学组胚教研室 沈阳110847 本研究采用APP／PS1转基因小鼠腹腔内注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），诱导产生糖尿病合并阿尔茨海默病（Alzheimer＇s disease，AD）的转基因小鼠动物模型；应用便携式血糖测定仪监测小鼠血糖的变化；Morris水迷宫检测AD小鼠的行为学变化；ELISA法对AD小鼠脑内AGEs含量进行定量分析；免疫组织化学技术检测AD小鼠脑组织老年斑的分布、小鼠脑内AGEs和NF－κB的表达；Western blot技术检测AD小鼠脑内AGEs、RAGE和NF－κB、BACE1蛋白的表达。研究结果显示，STZ诱导的高血糖使APP／PS1转基因小鼠血糖升高、学习记忆能力和空间探索能力均显著降低、脑内老年斑块增多、脑内AGEs含量增多、脑组织RAGE和NF－κB蛋白的表达增强，同时STZ诱导的高血糖使APP／PS1转基因小鼠脑内BACE1蛋白表达增强。结果表明，STZ诱导的高血糖可通过AGEs／RAGE信号转导通路使NF－κB蛋白活性增高，导致BACE1表达增强，从而加剧APP／PS1转基因小鼠脑内APP向Aβ生成途径代谢增加，致使脑内Aβ过度沉积、老年斑形成及认知功能损伤，揭示了高血糖可通过AGEs／RAGE／NF－κB信号转导通路加剧AD转基因小鼠脑内老年斑沉积的分子生物学机制。本项目为揭示糖尿病加剧AD病理生理进程的分子机制以及为AD提供切实的预防和治疗措施奠定充分的实验基础。

10.姜黄素对阿尔茨海默病神经元保护作用的实验研究 于嵩 辽宁中医药大学组胚教研室 沈阳110847 本研究旨在探讨姜黄素对阿尔茨海默病小鼠神经元的保护作用及其机制，从而进一步将姜黄素应用于神经退行性疾病治疗的中提供可靠的实验依据。采用C57BL／6小鼠和双转染人APP695swe基因和人早老素1（presenilin，PS－1）突变基因的AD模型小鼠 （APP／PS1小鼠）为研究对象，分别给予口服姜黄素处理；采用PCR技术对APP／PS1转基因小鼠进行鉴定，应用Morris水迷宫及跳台实验检测AD小鼠的记忆、学习能力变化及空间探索能力变化；免疫组织化学技术、Western blot技术检测姜黄素对APP／PS1转基因小鼠大脑神经元的保护作用。研究结果表明，AD双转基因小鼠与野生型小鼠相比记忆、学习能力和空间探索能力明显降低，具有时间相关性；6月龄小鼠大脑皮质和海马内开始出现老年斑块，随着年龄老年斑块数量持续增加；半定量检测p－Tau蛋白含量明显增多。而姜黄素喂养组小鼠的记忆、学习能力和空间探索能力明显改善，但是没有达到野生型小鼠水平；姜黄素喂养组小鼠大脑皮质和海马内老年斑块数量明显少于同月龄AD组小鼠；同时姜黄素喂养组小鼠脑内p－Tau蛋白含量也明显少于AD组小鼠。结果提示，姜黄素口服给药可以提高APP／PS1双转基因小鼠的记忆能力、学习能力和空间探索能力，减少AD小鼠脑内老年斑的形成，同时也降低小鼠脑内p－Tau蛋白的含量。因此，姜黄素可能通过抑制老年斑的形成和Tau蛋白的磷酸化对AD小鼠脑内神经元起保护作用。

11.Tau蛋白入核及抗凋亡机制的研究 吕玲 卢佳静 张瑜 沈建英 李宏莲 华中科技大学同济医学院组织学与胚胎学教研室 武汉430030 阿尔茨海默症（Alzheimer disease，AD）是一种神经退行性疾病，其病理研究中tau蛋白的作用机制是研究的重点之一。研究证明，tau蛋白过表达可抑制细胞凋亡，发挥保护作用。tau蛋白作为一种微管相关蛋白，主要分布在胞质，胞核内也有存在。目前tau蛋白抗凋亡的作用机制及其入核机制都未明确。本研究在已有基础上对其入核和抗凋亡作用及机制进行探讨。为探讨tau蛋白是否含有疑似入核序列，将表达人类全长tau蛋白的eGFP－C1－tau441质粒一分为二，构建质粒eGFP－C1－tau（1－220）和eGFP－C1－tau（221－441）。将该3种质粒分别转染鼠成神经瘤细胞株（N2a）细胞，48h后终止培养，荧光显微镜观察显示，tau（1－220）在胞浆和胞核内表达均匀，而另外两种质粒主要在胞浆表达，免疫印迹也证实了该结果，由此可见tau（1－220）更易入核。为探讨不同tau序列的过表达对细胞凋亡的影响，对转染eGFP－C1－vector、eGFP－C1－tau441和eGFP－C1－tau（1－220）质粒的细胞用0.5μmol／L广谱凋亡诱导剂staurosporine（STP）凋亡诱导3h后提全蛋白及核蛋白进行免疫印迹，结果表明，与空载组比较，tau441和tau（1－220）组均具有显著的抗凋亡作用，而且凋亡诱导后核蛋白内tau蛋白的含量尤其是tau（1－220）组明显升高。为进一步研究入核的tau441或者tau（1－220）片段与核内 DNA的关系，将转染eGFP－C1－tau441，eGFP－C1－tau（1－220）质粒的细胞在凋亡诱导前3h先加入20μmol／L纺锤菌素（抑制蛋白与DNA小沟结合）培养，进行凋亡诱导（不撤除纺锤菌素）提全蛋白和核蛋白进行免疫印迹，结果表明，转染tau（1－220）加纺锤菌素组与不加组相比，抗凋亡能力降低。同时，核蛋白的免疫印迹也表明，加入纺锤菌素后，核内tau蛋白量显著减少。综上所述，我们推测，tau（1－220）序列可能带有引导tau蛋白入核的关键序列，tau蛋白的抗凋亡作用可能是入核的tau蛋白与DNA小沟结合来维持DNA稳定，发挥细胞保护作用，从而抑制凋亡。

12.MiR－181a及其靶基因caprin－1在ALS转基因鼠脑干中作用的研究 接琳琳 管英俊 陈燕春 周风华 杜红梅 张皓云 刘永新 潍坊医学院组织学与胚胎学教研室 潍坊261053 选取95d、108d和122d野生型鼠和SOD1－G93A突变的肌萎缩侧索硬化（ALS）转基因鼠，应用原位杂交技术分别检测脑干中动眼神经核（3N），红核（RMC），面神经核（7N），舌下神经核（12N）中的 miR－181a的表达变化，应用免疫荧光技术检测miR－181a靶基因caprin－1在脑干各核团的表达变化。选取NSC34细胞系，以共转p EGFP－G93A－SOD1和 RFP－miR－181－silencing对照质粒作为对照组，共转p EGFP－G93A－SOD1和 RFP－miR－181－silencing对照质粒，分别于24h、48h和72h收集细胞，检测caprin－1的表达变化以证实caprin－1是miR－181a的靶基因。原位杂交结果显示，与野生型鼠比较，ALS转基因鼠脑干中miR－181a在95d，108d和122d表达均升高。免疫荧光染色结果显示Caprin－1与神经元共表达，未检测到与小胶质细胞、星形胶质细胞共表达，与野生型鼠比较，脑干中Caprin－1阳性细胞数量在95d、108d和122d均减少。与转染p EGFP－G93A－SOD1和RFP－miR－181－silencing对照质粒组比较，转染 p EGFP－G93A－SOD1和 RFP－miR－181－silencing对照质粒组，在24h、48h和72h caprin－1 m RNA和蛋白表达均增多。结果表明，miR－181a及其靶基因caprin－1在脑干中的异常变化与ALS发病密切相关。

13.成年大鼠胫神经损伤后神经病理性疼痛相关的适应性免疫反应发生位置研究 丁有权 肖霞 齐建国 四川大学华西医学中心组织胚胎学与神经生物学教研室 成都610041 周围神经损伤后外周免疫器官中抗原特异性的适应性免疫应答参与神经病理性疼痛的慢性化，而这种适应性免疫应答发生的具体位置和相关的抗原来源并不清楚。本实验发现，右侧腘窝淋巴结和腹股沟淋巴结联合清扫对成年SD雄性大鼠右侧胫神经永久性横断手术后腓肠神经和隐神经皮肤区域的疼痛的慢性转化没有影响；腹腔淋巴结清扫或者脾脏切除均可显著抑制成年SD雄性大鼠右侧胫神经永久性横断手术后腓肠神经和隐神经皮肤区域的疼痛的慢性转化；腘窝和腹股沟淋巴结引流同侧后肢的所有抗原，腹腔淋巴结引流腰段脊髓的抗原，而脾脏引流进入血液循环的抗原。因此，腰段脊髓的抗原引流至腹腔淋巴结或者进入血液循环引流至脾脏，发生神经病理性疼痛特异性的适应性免疫反应。本实验将为后续研究神经病理性疼痛特异性适应性免疫反应的位置和抗原的性质研究奠定基础，也为靶向性调控外周神经炎症治疗神经病理性疼痛提供理论基础。

14.成年大鼠坐骨神经挤压伤后腓肠神经再支配无毛区皮肤的疼痛行为学分析 任弘毅 丁有权 齐建国 四川大学华西医学中心组织胚胎学与神经生物学教研室 成都610041 目前认为外周神经损伤或者疾病后出现的神经病理性疼痛由轴突永久性离断而不再生的神经元或者由损伤神经元邻近的未损伤神经元所传递，而轴突离断后再生至原皮肤区域的神经元是否传递疼痛，目前仍不清楚。本实验发现，成年SD大鼠右侧坐骨神经坐骨切迹水平挤压伤3周后，大鼠后爪掌面原腓肠神经支配的无毛区皮肤区域出现明显的机械性疼痛异常、机械性疼痛过敏、冷痛异常和热痛过敏。其中明显的机械性疼痛异常和热痛过敏在疼痛测量期间（至术后8周）持续存在，而机械性疼痛过敏和冷痛异常仅持续至术后6周。另外，机械性疼痛过敏和热痛过敏存在雌雄差异，同窝雄性个体的疼痛相比于对应的雌性个体更为明显。大鼠后爪掌面外侧区皮肤免疫荧光显示挤压伤后3周该区域出现明显的神经纤维的再支配。实验结果表明，成年大鼠坐骨神经挤压伤后腓肠神经再支配无毛区皮肤出现了神经病理性疼痛。本实验提示，轴突离断后再生至原皮肤区域的神经元传递疼痛，这将为外周神经损伤后的临床治疗提供除神经再生之外的新靶点。

15.Investigating the effects of IFN－λon the proliferation and differentiation of neural stem cells Zhang Jiaqi，Sun Wanbing，Fu Liping，Qiu Yinghui，Xiao Jihan，Wang Shanshan，Zhou Lin.Department of Histology and Embryology，Tong Ji Medical School，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030 Our previous study showed that Interferon（IFN）－λand its receptor（IFNLR）were expressed in human neural stem cells（NSCs）－derived neurons and the expression level of IFN－λand its receptors were gradually increased with the differentiation of human NT2－N neurons.To better understand the effects of IFN－λon the proliferation and differentiation of the NSCs，we selected mice model which facilitates the NSCs supply.IFN－λand IFNLR mRNA expression was assessed by RT－PCR using the brain tissue of C57B／L neonatal mice.Primary NSCs were isolated from the cerebral cortex of neonatal mice.The NSCs were untreated or treated with IFN－λrespectively for several days 24h after isolation.The growth of neurospheres was observed and the cell counting of neurospheres was performed.During NSCs differentiation，MAP2 was detected by immunofluorescence staining as a specific neuronal marker after different days of IFN－λtreatment or untreatment.The fluorescence intensity was measured by the software provided by the laser scanning confocal microscope.Our results showed that mice cerebrum expressed a small amount of IFN－λand IFNLR m RNA.Compared with control group，the number and size of neurospheres decreased obviously after IFN－λtreatment.On day 6 after proliferation，the number of the NSCs in IFN－λ－treated group decreased apparently compared with the untreated group.On day 7 during the NSCs differentiation，the MAP2 fluorescence intensity in IFN－λ－treated group was higher than that of the untreated group.However，there is no significant difference of MAP2 fluorescence intensity between the treated and untreated groups on other days during differentiation.In conclusion，we demonstrated that IFN－λand IFNLR were expressed in the brain tissue of postnatal mice，and IFN－λinhibited the proliferation of mice NSCs and promoted the NSCs differentiation to the neurons.These preliminary data indicate that IFN－λmay play a role in the neural development，besides of its traditional immune defense.

16.抗炎因子白介素10系统性早期给药缓解成年大鼠胫神经损伤引起的神经病理性疼痛的机制 冯亚平 任弘毅 李轩漾 齐建国 四川大学华西医学中心组织胚胎学与神经生物学教研室 成都610041 脊髓背角浸润的炎症免疫细胞和活化的胶质细胞大量释放促炎性分子，参与周围神经损伤或者疾病引起的慢性神经病理性疼痛的发生和维持。最新的研究表明，抗炎因子白介素10（IL－10）的基因治疗载体鞘内注射可以抑制慢性神经病理性疼痛的发生和维持，然而，鞘内注射基因治疗风险大，经济负担较重。本实验发现，成年SD雄性大鼠右侧胫神经永久性横断手术后立即腹腔注射大鼠来源的重组蛋白IL－10（20μg／kg）可以显著抑制疼痛的急性诱发和慢性转化；腹腔注射IL－10的大鼠手术后5天同侧脊髓背角灰质浅层中小胶质／巨噬细胞的数量，相比于手术后注射同等剂量的PBS的对照组大鼠明显减少；腹腔注射IL－10的大鼠手术后7天同侧脊髓背角灰质浅层中表达抗炎性细胞因子IL－10的CD4＋T细胞的数量明显增加；同时，腹腔注射IL－10的大鼠手术后7天和14天同侧脊髓背角灰质浅层中小胶质／巨噬细胞和星形胶质细胞的数量，相比于对照组大鼠明显减少。以上结果提示早期系统性给予IL－10可能通过抑制脊髓背角炎症免疫反应缓解成年大鼠胫神经损伤引起的神经病理性疼痛，为周围性神经病理性疼痛治疗提供新的方法。

17.钙反应性反式激活因子在神经元分化中的作用及机制研究 王巧真1管英俊1金真真2彭挺2李和1，21潍坊医学院人体解剖学与组织胚胎学系 潍坊261000，2华中科技大学同济医学院组织学与胚胎学教研室 武汉430032 钙反应性反式激活因子（calcium－responsive transactivator，CREST）是一种在神经元内通过募集CBP、p300介导基因转录的蛋白质，与神经系统的发育有关，但与神经元分化的关系不明确。本研究以N2a细胞为模型，观察了分化对CREST表达，不同CREST表达水平对N2a细胞突起生长，分化诱导对N2a细胞CREST m RNA和蛋白表达，不同CREST表达水平对细胞成熟神经元标志物、神经元树突标志物以及神经元轴突标志物、细胞周期相关蛋白、分化相关蛋白mRNA和蛋白表达水平或活性水平及细胞增殖活力和细胞周期等的影响。结果显示：①无血清诱导分化情况下，CREST在mRNA水平和蛋白水平的表达增加。②过表达CREST促进N2a细胞的突起生长，而沉默CREST可明显抑制无血清诱导的N2a细胞的突起生长。③过表达CREST促进N2a细胞成熟神经元标志物、树突标志物和轴突标志物在mRNA水平和蛋白水平的表达，而在无血清诱导分化条件下，沉默CREST明显抑制N2a细胞相应标志物在m RNA水平和蛋白水平的表达。④过表达CREST可导致N2a细胞周期阻滞，抑制N2a细胞的增殖，下调周期蛋白D1、周期蛋白E1和周期蛋白A1水平，降低视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，Rb）磷酸化水平，促进p21的mRNA表达；过表达CREST上调N2a细胞的p53水平，提高其乙酰化水平但不改变其m RNA水平。以上结果表明，CREST可能通过募集组蛋白乙酰化酶CBP、p300，促进p53的乙酰化从而稳定N2a细胞内p53和促进p53的活性，上调p21的表达。p21的表达增加通过抑制Rb的磷酸化修饰进而抑制周期蛋白D1、周期蛋白E1和周期蛋白A1的表达，导致N2a细胞周期阻滞而分化。

18.施万细胞通过缝隙连接促进骨髓间充质干细胞向少突前体样细胞分化 马瑗锾1邱学成2张荣宜2曾湘3曾园山21广东医学院 湛江524023，2中山大学中山医学院 广州510080，3美国哈佛大学医学院神经外科系 骨髓间充质干细胞（MSCs）移植治疗脊髓损伤具有很好的临床应用前景。然而，脊髓损伤后会有大量内源性施万细胞（SCs）从脊神经根丝迁入损伤区内。因此，研究迁入的SCs对移植的MSCs的影响，对将来临床上有效地移植MSCs治疗脊髓损伤有重要的指导意义。本实验在大鼠受损伤的脊髓中移植MSCs，两个月后检测到迁入的SCs与移植的MSCs接触的部位存在有缝隙连接蛋白（CX43），有些MSCs分化为少突前体样细胞。我们将这两种细胞进行体外培养，也检测到它们接触的部位有CX43。Western blot显示，SCs在与MSCs接触后其CX43的表达增强。荧光染料Calcein AM穿越实验显示，共培养2天后染料从SCs传递给MSCs。采用免疫荧光和组织化学染色技术检测到，与单纯MSCs组和SCs间接接触共培养的MSCs组比较，SCs直接接触共培养的MSCs组的少突前体样细胞数量增高；采用缝隙连接阻滞剂生胃酮阻断缝隙连接后，少突前体样细胞数量则下降。实验结果提示，SCs与MSCs直接接触能够形成缝隙连接，这些缝隙连接具有传递小分子物质的功能，CX43蛋白可能参与它们之间缝隙连接的形成。直接与SCs接触的MSCs向少突前体样细胞分化能力的增强，可能与这两种细胞之间形成的缝隙连接有关。因此，在应用MSCs移植治疗脊髓损伤时，要考虑到这种可能的修复机制。

19.Pin1抑制剂对小鼠植入前胚体外发育及2－细胞胚内干细胞因子表达的影响 连秀丽 宋婵婵 贺琳程霄翔 陈俊明 杜娟 刘玥 王世鄂 福建医科大学基础医学院人体解剖学与组织胚胎学系 福州350108 本研究旨在观察Pin1在小鼠植入前胚中的定位分布及其抑制剂Juglone对小鼠植入前胚体外发育及2－细胞胚内干细胞因子表达的影响，为进一步阐明Pin1在植入前胚中的作用机制提供理论依据。本实验利用免疫荧光法检测小鼠不同发育阶段植入前胚中Pin1的定位分布，发现各发育阶段植入前胚中都存在Pin1的表达，细胞胞质和胞核内均有分布，且核内荧光着色明显比胞质强。其次，进行小鼠1－细胞胚体外培养，以培养液KSOM为对照组，以培养液中添加有不同浓度的Juglone为实验组，记录并比较各组发育至2－细胞胚、4－细胞胚及囊胚阶段的数目和比率。结果显示，Juglone对小鼠植入前胚体外发育的影响具有浓度依赖性，5μmol／L、10μmol／L、25μmol／L的Juglone实验组4－细胞胚和囊胚发育率分别为90.35%、5.83%、1.74%和24.56%、0.00%、0.00%，明显低于KSOM对照组（98.51%和97.01%）。但2－细胞胚发育率无差别。同时，运用Real－time PCR技术检测2－细胞胚内干细胞因子Sox2、Oct4、c－Myc和Klf4 mRNA的表达水平发现，Juglone（25μmol／L）可使Sox2 m RNA表达水平明显降低，Klf4、c－Myc和Oct4 m RNA表达量略有降低。根据上述实验结果可知，小鼠1－细胞胚之后，Pin1主要定位在细胞核内，提示其可能参与细胞转录活动。且Pin1抑制剂Juglone能使2－细胞胚至4－细胞胚过渡率和干细胞因子Sox2 m RNA表达水平明显降低，说明Pin1在小鼠植入前胚体外发育早期阶段具有重要作用，可能参与调控合子基因组激活。

20.紧密连接蛋白claudin－7在发生发育小鼠肾泌尿小管表达的时空性研究 丛敬 顾玲 张婕 田莹莹翟效月 中国医科大学组织学与胚胎学教研室沈阳110122 紧密连接是相邻上皮细胞侧面细胞膜接触区特化形成的细胞连接，其在细胞旁路中形成屏障，决定并维持细胞的极性，参与信号传导，调节细胞生长、增殖、凋亡等活动。Claudins是蛋白亚型最多的一种紧密连接蛋白，且大多表达在特定的肾泌尿小管节段，claudin－7是这个家族的成员。本实验拟通过对claudin－7表达的时空性研究，探索其对肾泌尿小管上皮细胞紧密连接进而极性形成及完善的意义。采集胎龄16天和18天胎鼠肾脏，以及生后7天仔鼠和28天及40天成鼠肾脏，制备成连续石蜡切片，选取若干张进行免疫组织化学染色，亮视野显微镜下观察肾泌尿小管Claudin－7的表达，并通过连续切片的显微图像进行特异小管表达的定位。结果显示，claudin－7的阳性表达呈线样；在发育早期的肾单位，claudin－7表达在输尿管芽上皮细胞的侧面，芽干较芽泡表达更强；随着肾脏的发育，claudin－7表达在连接小管和集合管上皮细胞的侧面或基底面，尤其是在闰细胞的基底和基侧面；在远端小管，claudin－7微弱表达在发育早期上皮细胞的侧面，伴随着细胞成熟分化逐渐减少，成熟小鼠肾脏远曲小管和远直小管不表达；在致密斑处，claudin－7始终表达在基底面，表达强度与小管成熟度一致。综上所述，claudin－7早期表达在输尿管芽和远端小管细胞，而后出现在集合管和连接小管细胞。此现象提示Claudin7与集合管系上皮细胞之间的紧密连接形成及细胞的极化有关。

21.小鼠孤雄胚胎干细胞向心肌分化的研究 李彤梁宵孙瑞珍单智焱雷蕾 哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室哈尔滨150081 为探讨小鼠孤雄胚胎干细胞（Androgenetic Embryonic Stem Cells，AgESCs）向心肌分化的能力及对心梗模型小鼠的治疗效果，我们建立小鼠AgES细胞系并对其进行体外自发分化，观察其向心肌分化的效率与受精的胚胎干细胞（f ES）是否有差异及采用Real－time PCR手段检测各阶段心脏发生标记物的表达情况；此外，将AgES细胞及其预分化产物分别进行心梗模型小鼠体内细胞移植，通过生存率统计及超声心动图的监测来观察对心梗模型小鼠的治疗效果。我们观察到小鼠Ag ES与f ES在体外自发分化时均可以成功分化为跳动的拟胚体（Beating EBs），分化的效率无明显差异。在体外分化过程中，心脏发生各阶段标记物如Brachyury T、Tbx5、ANP等均在相应阶段表达上升，且分别于分化的D6、D9、D15时AgES组的相对表达量明显高于f ES组；Ag ES细胞及其预分化产物均可以减缓心梗模型小鼠的死亡，且在一定时间段内可以缓解心梗小鼠射血分数（EF）及左心室短轴缩短率（FS）的下降甚至使之回升，于D28其心功指标显高于f ES注射组。故我们得出结论小鼠AgES细胞在体外可以成功分化为心肌细胞但心肌分化效率与f ES无明显差异；AgES来源的细胞对心梗模型小鼠有一定的治疗效果且相较于f ES来源的细胞治疗效果更好。

22.胚胎生殖细胞抽提物对iPS细胞诱导效率及表观遗传记忆的影响 胡静 赵巧湜 单智焱 雷蕾 哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室 哈尔滨150081 为研究小鼠胚胎生殖细胞（Embryonic germ cells，EGCs）抽提物诱导的体细胞重编程及对诱导性多功能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）诱导效率及表观遗传记忆的影响，我们建立了12.5dpc原始生殖细胞 （primordial germ cells，PGCs）来源的EGCs，并以小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）为对照，应用qPCR检测EGCs中与发育相关的11个父源与母源印记基因的表达情况。制作EGCs抽提物，联合四因子病毒诱导MEF细胞，对重编程细胞进行建系，甲基化DNA免疫共沉淀测序检测建系细胞的印记基因及基因组甲基化的情况。结果显示，EGCs克隆有高水平碱性磷酸酶活性，表达小鼠ESCs多能性标记物OCT4及细胞表面标记SSEA－1；核型为正常的40条染色体，体内可分化出3个胚层来源的组织；EGCs的印记基因表达量显著高于ESCs。MEF细胞经EGCs抽提物孵育后细胞增殖能力旺盛，增殖活力明显增加；在细胞培养的第五天观察到类似mES的克隆样集落生长，碱性磷酸酶检测显示阳性、免疫荧光染色显示多潜能标记Oct4阳性，但是在克隆出现后的培养中，克隆不再进行生长。qPRC检测到EGCs抽提物孵育后细胞多潜能基因Oct4、Nanog、Sox2基因的表达出现先升高再降低的呈抛物线状的趋势；印记基因H19、Igf2、Snrpn、Igf2r的表达与对照组MEF比较明显增加；EGCs抽提物联合四因子病毒诱导MEF细胞，所获iPS的细胞增殖明显比单纯iPS组活跃，其印记基因的表达明显高于单纯iPS组；EGCs抽提物的孵育能够提高iPS诱导效率的5～7倍；通过MeDIP－seq测序和单纯iPSs组相比，联合iPS组全基因组DNA呈低甲基化状态，GO分析显示甲基化异常改变明显的基因类型包括免疫系统类、细胞周期类和细胞凋亡类等。因此我们认为EGCs抽提物可以使体细胞发生部分重编程，诱发多潜能基因的表达和印记基因的擦除。EGCs抽提物可以促进四因子诱导的iPS效率，并改变iPS的印记状态。

23.人诱导性多潜能干细胞系的建立 师迎旭 杜华 内蒙古医科大学附属医院检验科 呼和浩特010050 人胚胎干细胞（h ESCs）是研究正常人类发育的首选细胞，但因为伦理问题利用hESCs进行研究具有极大的局限性。诱导性多潜能干细胞（inducedpluripotent stem cells，iPSCs）的出现是干细胞生物学领域中的一个重要里程碑。2006年日本科学家Shinya Yamanaka第一次利用病毒载体将4个转录因子（Oct4，Sox2，Klf4和c－Myc）转导整合入分化的体细胞的染色体中，诱使处于终末分化阶段的体细胞经重编程后转变为类似胚胎干细胞的一种细胞类型－－iPSCs。iPSCs这一特点，与肿瘤细胞的发生过程极其相似，因此通过研究iPSCs，可以为肿瘤基础研究和临床诊断与治疗提供一种新的解决途径。使用iPSCs作为研究的初始细胞为研究人类遗传性疾病、肿瘤的发生发展以及评估基因突变对于发育的影响提供了一个有效的研究平台。利用携带4种基因的反转录病毒感染HS27细胞20d后，可以观察到有人胚胎干细胞样克隆出现，选取AP（＋）且具有典型的人胚胎干细胞克隆形态的克隆进行后续培养，并对其从克隆形态、生长特性、多潜能标志基因表达和畸胎瘤形成及分化等方面进行鉴定。实验结果显示，HS27细胞来源的iPSCs能够在体外长期传代培养。AP染色可观察到未分化的人胚胎干细胞变红或紫色，分化的细胞为无色。进一步通过免疫细胞化学法检测分析构建的人iPSCs中人胚胎干细胞标志性基因（如 Oct4、SSAE－4、TRA－1－60、TRA－1－81）表达情况。利用悬滴法研究iPSCs分化为拟胚体的能力。最后，将iPSCs注射到裸鼠皮下，1个月左右可见SCID小鼠皮下形成畸胎瘤。剥离小鼠肿瘤组织，石蜡包埋，然后进行苏木精－伊红染色，研究iPSCs向三胚层分化的能力。结果表明，诱导后的iPSCs可维持人胚胎干细胞的生物学特性。人iPSCs的成功建立为下一步构建人肿瘤细胞重编程的技术平台奠定了扎实的实验基础，为肿瘤病患个体化诊治提供了实验模型。

24.JAM－A基因干扰促进表皮干细胞增殖 仵敏娟 周童 刘厚奇 第二军医大学组织学与胚胎学教研室 上海200433 JAM－A属于免疫球蛋白超家族，跨膜分布，同源二聚化后可与细胞内的PDZ（PSD－95／Discs－large／ZO－1）结构域结合，和胞内外信号传递、细胞迁移、细胞增殖等关系密切。为了探讨JAM－A基因对人表皮干细胞分化与增殖的影响，将JAM－A基因和JAM－A干扰基因用重组慢病毒病毒基因导入技术导入人表皮干细胞内，在证实目的基因在人表皮干细胞中导人成功后，检测人表皮干细胞的增殖能力、标记性分子、增殖相关抗原及细胞安全性等指标的变化。分离获取的人表皮干细胞在接种后第7天进入快速生长期，第10天时到达平台期；JAM－A基因及JAM－A干扰基因导入人表皮干细胞后，可观察到绿色荧光蛋白的表达，Western blot检测到JAM－A蛋白表达水平的变化，倒置显微镜下拍照检测发现各组人表皮干细胞直径无明显变化，而JAM－A干扰基因导入组细胞增殖则明显加快，作为短暂扩增细胞的标志K14表达变为阳性，作为干细胞和腺上皮细胞共同标记的KI9的阳性明显减弱，β－integrin表达也下调，终末分化标志K10表达为阴性，增殖指标Ki67在JAM－A干扰基因导入组呈显著阳性。JAM－A基因导入组细胞增殖减缓，核质比增大，体积变小，仍高表达表皮干细胞特异性抗原。各组细胞在畸胎瘤实验中均为阴性。

25.人肝癌细胞在猪肝中嵌合状况的研究 周晓囡 吴嫣爽 王嘉悦 李君 杜潇 雷蕾 哈尔滨医科大学组织与胚胎学教研室哈尔滨150081 将人类的肝癌细胞注射入适龄猪的肝脏中，探索人类细胞是否能在猪的肝脏中存活，建立人猪嵌合的肝癌的模型，为临床药物试验和其它细胞在猪肝脏中的移植奠定基础。本实验将人类的HeG2－Puro－GFP细胞通过腹腔镜手术操作注射入肝脏部分切除的巴马小型猪的肝实质中。实验共分为4组：G0组为对照组，实行肝部分切除术后注射生理盐水；G1组未实施肝部分切除术，直接注射HeG2－Puro－GFP细胞；G2组肝部分切除术后注射 HeG2－Puro－GFP细胞；G3组肝部分切除术后注射HeG2－Puro－GFP细胞，术后12h饲喂免疫抑制剂。细胞移植后定期采集外周血，检测肝功的变化，及血清中人类甲胎蛋白的表达水平。巴马小型猪处死后，对其肝脏进行取材，观察肝组织病理性变化特征。结果发现，各组肝功的各项指标在术后2W左右基本已恢复到术前水平；在猪肝脏中可以检测到HeG2－Puro－GFP细胞的嵌合，均能检测到GFP阳性细胞，在移植天数相同的情况下使用免疫抑制剂的细胞嵌合率高于其它各组；Elisa检测结果显示，在实验组的外周血中可以检测到人AFP的表达；HE结果显示肝组织有炎细胞的浸润、肝细胞坏死和肝细胞肿胀等病理特征。以上结果表明，人的HeG2－Puro－GFP细胞可以在猪肝中嵌合，并能分泌人的甲胎蛋白，免疫抑制剂的使用能延长细胞的存活时间和存活效率。

26.Smad7通过影响Wnt通路促进结肠肿瘤发生 黄河 中南大学湘雅医学院组织学与胚胎学系 长沙410013 Wnt／β－Catenin通路的突变被认为是肠癌发生的起始步骤。剔除APC肿瘤抑制因子会引起β－Catenin降解从而导致肠息肉的发生，后者进一步在其他因素影响下导致肠癌。Smad7是TGF－beta和BMP信号通路的抑制因子，最近研究表明Smad7与结肠癌有关联。我们制作了在肠道上皮敲入Smad7的VillinCre；RSmad7条件性基因敲入（CKI）小鼠，该小鼠3月龄时已明显观测到肠道息肉的形成，6月龄时观测到腺瘤形成，12月龄时已经恶化为结直肠癌。免疫组织化学染色显示，在正常小鼠β－catenin在肠上皮细胞膜表达，仅在肠隐窝基部干细胞观测到核阳性；而在CKI小鼠自发形成的癌组织，观测到β－catenin高度核阳性，且Wnt信号通路的靶分子CD44、Sox9等也同时被激活。进一步制作VillinCre；RSmad7；APCC／＋小鼠。Kaplan－Meier生存曲线显示，每组7只小鼠中，VillinCre；RSmad7；APCC／＋不到3个月全部死亡，VillinCre；APCC／＋小鼠有2只死亡，野生型小鼠APCC／＋无一死亡。对小鼠样本进行解剖，癌组织恶性程度增高，免疫组织化学显示Wnt／β－catenin通路被激活。结果提示，Smad7的上调能加速肿瘤形成从而导致小鼠结直肠癌死亡率上升。

27.c－kit信号在结直肠黏液性腺癌发生发展中的作用与机制 沈萍 谭俊 杨姝 孙海梅 肖杰 王亚希 吴波 季凤清 周德山 首都医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系 北京100069 结直肠黏液性腺癌（colorectal mucinous adenocarcinoma，CRMAC）约占结直肠腺癌的20%，其肿瘤组织内含有大量的细胞外黏液，肿瘤恶性程度高，侵袭及转移能力强，患者预后较差，但有关CRMAC的发病机制仍未明了。有研究提示c－kit信号可能在CRMAC发生发展过程中起一定作用。本研究利用野生型C57BL小鼠和c－kit功能缺失突变小鼠（Wads－／－），通过腹腔注射AOM及喂食DSS的方法成功建立CRMAC动物模型，同时利用人结直肠癌细胞系HCT－116，探讨c－kit信号在CRMAC发生发展过程中的可能调控机制。AOM＋DSS诱导37周后，HE染色、Alcian blue染色和MUC2免疫荧光染色证实所有野生型（15只）和 Wads－／－（5只）小鼠均发生结直肠腺癌，其中约50%的野生型小鼠为CRMAC，而Wads－／－小鼠无一例为CRMAC。CRMAC肿瘤细胞恶性程度较高、穿透基膜浸润至黏膜下层，c－kit活性及其下游的促黏液分泌因子Math1的表达均较非CRMAC和正常小鼠黏膜上皮显著增高，提示c－kit可能通过上调Math1的表达促进CRMAC的发生。在体、离体实验均表明，过表达c－kit还可抑制p53的表达，同时增加cyclin D1的表达，进而促进CRMAC细胞的增殖，并且可通过上调ETV4的表达增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力；运用Imatinib抑制c－kit活性后，肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力均受到明显的抑制。本研究初步证明c－kit可以促进CRMAC的发生、增殖和侵袭，为该疾病的临床诊疗提供了新的理论依据和治疗靶点。

28.抑癌基因Keap1抑制非小细胞肺癌侵袭转移的机制研究 许丽娥 吴波 杨姝 孙海梅 季凤清 周德山 首都医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系北京100069 高侵袭和易转移的肿瘤生物学特征是肺癌死亡率居高不下的主要原因，尤其在非小细胞肺癌（NSCLC）最为常见。已知肿瘤细胞运动需细胞骨架解聚与重组、细胞极性形成、细胞前端伸出伪足、形成新的黏着斑及细胞尾部收缩等过程。可见肿瘤细胞侵袭、转移与细胞骨架解聚、重组过程密切相关。而小G蛋白Rho A是调节细胞骨架解聚与重组的关键分子。Keap1（Kelch－like ECH－associated protein 1）是近年备受关注的抑癌基因，在多种肿瘤组织中表达降低。我们前期研究发现Keap1在非小细胞肺癌中呈低表达状态，但是有关Keap1在非小细胞肺癌侵袭转移中的作用机制尚不清楚。本研究通过构建Keap1过表达慢病毒载体，转染非小细胞肺癌细胞A549、H460及H1299，建立Keap1过表达非小细胞肺癌细胞模型。通过细胞多功能分析仪（RTCA）检测发现，过表达Keap1可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移与侵袭，免疫荧光发现过表达Keap1的肿瘤细胞内F－actin富集并形成束状应力纤维，细胞质中黏着斑变大、数量增多，Keap1过表达组Rho A活性明显升高。通过Western blot检测发现Keap1过表达细胞中负性调节Rho A活性的Myo9b蛋白表达降低，经过蛋白酶体抑制剂MG132处理后Myo9b蛋白表达上调。荷瘤鼠动物模型过表达组与对照比相比，肿瘤体积小并且肿瘤同侧腋窝淋巴结转移肿瘤细胞少。结果表明，抑癌基因Keap1通过蛋白酶体途径使Myo9b表达降低，促使Rho A活性升高进而稳固细胞骨架、调节黏着斑循环，抑制非小细胞肺癌的侵袭与转移。

29.缺氧微环境下H3K4me3修饰促进肝癌HOXB9表达的表观遗传学机制研究 洪金金 娜荷芽 苗方笑李善花 厦门大学医学院组织学与胚胎学教研室厦门361102 肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌最主要的类型，具有生长快、侵袭力强、易转移及预后差等特点。缺氧作为快速生长肿瘤的一种常见现象，与肿瘤的发生、生长、代谢、浸润及转移都有着密不可分的关系。已证实，组蛋白甲基化修饰作为重要的基因转录调控形式，在肝癌发生发展过程中具有重要的生物学功能。我们通过基因组染色质免疫共沉淀（ChIP－on－ChIP）技术探讨缺氧条件下肝癌细胞H3K4me3正性组蛋白甲基化的修饰规律，发现2500多个靶基因启动子区域的H3K4me3修饰水平发生变化，其中包括HOXB9、BGLAP及ADAMTS4等基因。HOXB9在肺癌、乳腺癌及肝癌的发生及发展中具有促进作用。本研究从已获得的染色质组蛋白甲基化等组学数据的整合分析入手，利用ChIP等关键技术深入筛选和鉴定肝癌中受H3K4me3调控的靶基因网络，明确缺氧调控HOXB9等关键靶基因转录的优势组蛋白甲基化修饰规律，鉴定了MLL等组蛋白甲基转移酶复合物组成，探讨以H3K4me3调控的正性组蛋白甲基化修饰为靶点的小分子化合物在肝癌治疗中的潜在应用前景。本研究将有助于揭示缺氧诱导的正性组蛋白甲基化异常修饰促进肝癌发生的表观遗传学机制，扩展对H3K4me3调控的HOXB9等靶基因网络等领域的认识，为肝癌防治提供崭新的靶点。

30.整合素－β1、PKC与胶质瘤细胞骨架结构改变及侵袭性的关系 杜华 钟延丰 师迎旭 内蒙古医科大学病理学教研室 呼和浩特010050 侵袭性是肿瘤细胞最重要的生物学特性之一，胶质瘤是中枢神经系统最常见的一类肿瘤，主要生物学特性表现为浸润性生长、广泛的局部侵袭而罕见颅外转移。胶质瘤的侵袭性生长涉及到细胞信号传导、细胞黏附、细胞迁移等多个环节。整合素（integrin）β1是整合素分子家族中重要的β亚单位，能与不同的α亚单位结合，构成ECM的绝大多数受体，是细胞与细胞间，尤其是细胞与ECM间不可缺少的粘附因子。蛋白激酶C（PKC）是一族结构相近、Ca2＋和磷脂依赖、甘油二酯（DAG）活化的同工酶，是细胞活化包括肿瘤细胞转化的重要信号分子，对正常细胞的生长和转化调节均起重要作用，也是介导肿瘤细胞粘附、运动、侵袭及转移的关键因素。本研究通过黏附实验、迁移实验和体外侵袭实验来检测整合素β1和PKC对人脑胶质母细胞瘤细胞株（U251MG）的细胞生物学行为的影响，并通过免疫荧光染色激光共聚焦显微镜和扫描电镜观察细胞骨架和细胞表面伪足的改变。实验结果显示，应用抗整合素β1抗体阻断肿瘤细胞自泌性整合素β1的功能，可以改变肿瘤细胞内微丝的排列极向，胞膜下可见平行排列的微丝束，粗壮而密集，沿细胞极性平行排列或纵横交错成网状贯穿整个细胞和细胞突起，细胞表面伪足减少，细胞运动迁移及体外侵袭能力明显减弱。应用PKC激活剂PMA，细胞内微丝缩短，排列紊乱和荧光信号弥散，并可见絮团状小体－F－actin小体的出现；F－actin小体的出现及其数量与肿瘤的恶性程度和转移潜能具有一定的正相关性，此时细胞表面伪足数量明显增多、密集而粗壮，U251MG肿瘤细胞黏附、运动迁移及体外侵袭能力增强。应用PKC抑制剂Calphostin C，肿瘤细胞微丝围绕胞膜下成簇状排列，细胞伪足基本消失，使细胞运动迁移及体外侵袭能力降低。抗整合素β1抗体与PKC激活剂或抑制剂联合应用，分别增强上述作用。研究结果表明，整合素可能通过激活PKC而影响细胞骨架蛋白从而增强肿瘤细胞的运动侵袭能力；抑制PKC活性或阻断细胞表面整合素－β1能有效抑制胶质瘤细胞的侵袭和恶性进展。

31.MAGE－D4在大肠癌中的表达及其临床意义 张庆梅 罗彬 陈芳 农蔚霞 石蕾 彭亚 谢小薰 广西医科大学组织学与胚胎学教研室 南宁530021 黑色素瘤相关抗原（Melanoma－associated antigen，MAGE）是一类被视为肿瘤免疫治疗理想靶点的肿瘤特异性抗原。MAGE－D4是MAGE家族的一个新成员，不／低表达于多种正常组织，但高表达于胶质瘤、肺癌、肝癌、食道癌和乳腺癌等多种肿瘤组织，且与肝癌、食道癌和乳腺癌的预后相关。然而迄今为止，MAGE－D4在大肠癌中的表达情况尚不清楚，故本研究旨在检测大肠癌中MAGE－D4的表达，探讨其作为大肠癌预后诊断和免疫治疗靶抗原的可能性。应用RT－PCR和免疫组织化学法在m RNA和蛋白水平检测MAGE－D4在正常大肠组织、大肠腺瘤、结肠癌及其匹配的癌旁组织中的表达，然后对MAGE－D4与大肠癌患者临床病理指标以及生存期的相关性进行进一步统计分析。结果显示，MAGE－D4 m RNA在大肠癌中的表达率 （76.7%，46／60）明显高于癌旁组织 （15.0%，9／60）；MAGED4蛋白在所有大肠癌组织中均表达，其中70.0%（21／30）呈现高表达，而在癌旁组织中均未检测到MAGED4蛋白；大肠腺瘤和正常大肠组织中均未检测到MAGE－D4 mRNA和蛋白。此外，MAGE－D4 mRNA和蛋白表达与大肠癌患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、CEA含量、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、肿瘤分化程度及组织学类型等临床病理指标均无关，但MAGE－D4蛋白表达与患者生存期相关，即高表达患者的生存期明显短于低表达患者的生存期，且其具有作为大肠癌独立预后因子的趋势。以上这些结果表明MAGE－D4在大肠癌组织中特异性高表达，有望成为大肠癌预后评估和免疫治疗的理想靶抗原。

32.PDIA6对Wnt信号通路的影响及其机制 高会君 邵淑娟 胡 军 迟鑫明 张丽媛 大连医科大学组织胚胎学教研室 大连116044 蛋白二硫键异构酶家族A成员6（PDIA6）是本实验室通过质谱高通量实验筛选并经组织芯片验证的肺鳞癌相关蛋白，其在肺鳞癌组织中表达增高。我们在Hela细胞中利用双荧光素酶报告基因检测，发现PDIA6可能激活Wnt信号通路。本研究通过将外源性PDIA6基因转染到人Hela细胞中，进一步探究PDIA6对Wnt信号通路的影响及作用机制，从而了解PDIA6在肿瘤发生发展过程的功能和作用机制，探讨其作为肿瘤治疗靶点的可能性。将pCMV－sport6－PDIA6质粒和空载体pCMV－sport6瞬时转染Hela细胞，Western blot法检测PDIA6高表达后对Wnt信号通路中关键蛋白β－catenin及其重要靶蛋白cyclinDl、c－myc表达的影响，以验证PDIA6对 Wnt通路的激活作用；利用免疫荧光观察PDIA6高表达后β－catenin在细胞中的定位；Western blot法检测PDIA6高表达后β－catenin Ser45磷酸化状态；放线菌酮处理细胞，Western blot法检测PDIA6高表达后β－catenin稳定性的变化；MG－132处理细胞，Western blot法检测PDIA6高表达后对β－catenin泛素降解过程的影响。与空载体pCMV－sport6对照组相比较，PDIA6高表达后β－catenin、cyclinDl及c－myc均表达上调且细胞核中β－catenin表达上调；免疫荧光结果显示PDIA6高表达后β－catenin定位于细胞核；放线菌酮处理细胞PDIA6高表达后β－catenin蛋白表达速度降低较慢；PDIA6高表达后β－cateninSer45磷酸化水平降低；MG－132处理细胞PDIA6高表达后βcatenin蛋白水平并无改变，但影响了β－catenin的泛素－蛋白酶体降解过程。结果提示，在Hela细胞中PDIA6可能通过抑制β－catenin氨基端Ser45的磷酸化，进而抑制β－catenin泛素－蛋白酶体降解，使得βcatenin累积入核激活Wnt信号通路，促进β－catenin核移位，激活下游靶基因cyclin Dl、c－myc转录，进而促进肿瘤细胞存活。

33.磷酸化蛋白质组策略研究MCM2磷酸化在肿瘤转移中的作用 李会敏 邵淑娟 胡军 张丽媛 迟鑫明 孙兵 大连医科大学组织学与胚胎学教研室 大连116044 基于对磷酸化肽具有高选择性的纳米材料结合二甲基化同位素标记技术，本研究建立了蛋白组学鉴定平台，并由此鉴定出与肿瘤转移相关的磷酸化蛋白MCM2及其磷酸化位点S27、S139。MCM2是一种重要的DNA复制启动调节因子，存在许多磷酸化位点，功能失调会导致染色体缺陷，促进肿瘤发生。本课题探究MCM2磷酸化在肿瘤转移中的功能及其作用机制，期望为肿瘤转移预警和干预提供治疗新靶点。利用Tissue array检测出MCM2磷酸化与卵巢癌转移相关；Western blot验证了低表达MCM2磷酸化蛋白的卵巢癌细胞系HO8910；转染MCM2磷酸化质粒的细胞可高表达MCM2（S27），MCM2（S139）磷酸化蛋白，转染磷酸化位点突变体质粒的细胞不能高表达相应的MCM2磷酸化蛋白；结晶紫染色观察细胞形态发现，与转染S27A、S139A突变体质粒的细胞相比，转染MCM2磷酸化质粒的细胞细长有突起；Western blot和Real－time PCR检测结果显示，与转染S27A、S139A突变体质粒的细胞相比，转染 MCM2磷酸化质粒的细胞中，Snail，Vimentin，β－catenin蛋白表达水平均上调，Vimentin和Snail RNA表达水平均上调，β－catenin RNA表达水平无明显变化，E－cadherin在蛋白和RNA表达水平均下调；CCK－8结果显示，S27、S139磷酸化位点突变后，细胞增殖不受影响；划痕实验、Transwell基底膜迁移和侵袭实验检测发现，MCM2磷酸化能促进细胞的转移和侵袭。上述结果表明，MCM2磷酸化与上皮间质转化的发生相关，可能通过激活Wnt／β－catenin信号通路，促进细胞的侵袭和转移。

34.趋化因子受体CCR7促进大肠癌上皮间质转化及西妥昔单抗耐药的机制研究 高玲玲 马慧颖 许平平 韦烨 梁春敏 许剑民 复旦大学上海医学院人体解剖与组织胚胎系 上海200030 恶性肿瘤的转移以及治疗过程中耐药性的产生，是影响肿瘤患者疗效与预后的重要因素，也是肿瘤治疗过程中所面临的最大的挑战。我们以前的研究表明，趋化因子CCR7（Chemokine receptor 7）高表达于肝癌与胃癌组织且与肿瘤的淋巴结转移密切相关。本研究首先应用生物信息学的分析软件EGAN（Exploratory Gene Association Networks）与KEGG（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes）对CCR7下游与肿瘤相关的蛋白进行生物信息学的分析，结果显示CCR7下游蛋白与肿瘤的耐药性以及上皮间质转化（Epithelial－Mesenchymal transition，EMT）密切相关。接下来我们应用190例配对的大肠癌的组织芯片，通过免疫组织化学检测其CCR7的表达，结果显示，大肠癌组织的CCR7的表达明显的高于正常组织；同时与临床病理资料的相关性分析显示，CCR7的表达与肿瘤的浸润深度以及淋巴结转移相关；生存分析的结果显示，CCR7阴性组病人的总体生存率明显优于CCR7阳性组，5年总体生存率分别为58%与40%。最后，应用大肠癌细胞系HCT116与Caco－2进行体外机制的验证，结果显示，体外用CCR7的特异性配体SLC刺激大肠癌细胞可以激活CCR7下游PI3K／AKT信号通路且可以旁路激活EGFR信号通路，从而促进肿瘤细胞发生EMT（细胞的间质性标志物β－catenin和Twist明显上调，同时伴随细胞迁移能力的改变），同时细胞对大肠癌靶向药物西妥昔单抗的药物反应性明显的降低；CCR7的中和抗体Nue－CCR7可以有效中和CCR7受体从而阻止SLC引起的上述一系列的改变。以上结果表明，CCR7下游的信号通路与大肠癌的侵袭、转移以及靶向治疗过程中的耐药性密切相关，从而提示CCR7可能成为大肠癌诊疗过程中的又一重要的分子标志物与分子治疗靶点。

35.人核仁定位蛋白12的核仁定位序列分析及细胞学功能研究 杜佩瑶 彭挺 李和 华中科技大学同济医学院组织学与胚胎学教研室 武汉430030 核仁是核糖体RNA（r RNA）基因存储、r RNA合成、加工以及核糖体大小亚单位的装配场所，并参与细胞增殖调控、肿瘤发生、应激、凋亡、核内蛋白降解等多种重要的生理过程。核仁定位蛋白12（Nucleolar Location Protein 12，NOL12）是一种新发现的核仁定位蛋白，能够与r RNA结合参与r RNA的转录和加工。已有的研究发现果蝇的NOL12同源体Viriato直接参与了果蝇眼睛的生长和分化，并且在果蝇胚胎发育中作为果蝇癌基因Myc的下游蛋白对细胞的生长、分化和存活起促进作用；对大鼠NOL12的核仁定位机制研究发现，大鼠NOL12的核仁定位序列可能位于其蛋白的C末端。目前关于人类NOL12蛋白的核仁定位序列、定位机制，以及其在细胞中所发挥的作用还未见报道。本研究通过生物信息学分析对人NOL12可能存在的核仁定位序列进行了预测，根据预测结果将人全长NOL12分解为多个片段，分别构建了与GFP重组的融合蛋白。通过观察GFP在亚细胞水平的荧光定位发现：人NOL12存在着3段相对独立的核仁定位信号序列，分别位于其N端的1－10、C端166－184和C端185－213号位氨基酸残基，而其他区域的重组蛋白未见明显核仁定位。在人宫颈癌细胞株Hela细胞中，过表达NOL12使Hela细胞的增殖能力、集落生成率及处于S期的细胞比例均显著增加，干扰NOL12使Hela细胞的增值能力显著抑制，表明NOL12确实参与调控肿瘤细胞的增殖和生长。对多个临床宫颈癌样本的病理组织切片进行免疫组织化学检测及在增殖刺激条件下对Hela细胞中NOL12表达变化检测显示，相对于癌旁组织，宫颈癌巢中的NOL12免疫反应性显著增高；在用含高浓度血清（30%）或含有表皮生长因子（EGF）的培养基进行增殖刺激情况下，Hela细胞中的NOL12蛋白水平的显著增加。因此，人NOL12的蛋白水平与宫颈癌的发生和发展明显相关。

36.Wnt10b基因失活对肝癌细胞增殖及分化的影响 孙莉吴国慧范晓丽 桂林医学院组织胚胎学教研室桂林541000 本研究应用RNA干扰技术沉默人肝癌细胞内Wnt10b蛋白表达，探讨Wnt10b蛋白对人肝癌HepG2细胞增殖、周期、凋亡、迁移及侵袭的作用。根据Wnt10b m RNA编码序列设计RNA干扰靶点并构建特异性小发夹RNA（p LVTHM，p LV－sh Wnt10b1和p LV－sh Wnt10b2），经慢病毒载体稳定转染入HepG2细胞，Western blot检测Wnt10b蛋白表达，CCK－8增殖实验、平板克隆形成实验、流式细胞术、Hoechst 33342荧光染色、划痕愈合实验和Transwell小室观察细胞增殖、周期、凋亡、迁移及侵袭变化情况。与对照组相比，sh Wnt10b1和sh Wnt10b2的Wnt10b蛋白表达均呈现下调，其中sh Wnt10b2下调更明显；两组细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力均受抑制，细胞凋亡率增加，处于G0－G1期和S期的细胞数量增加，其中sh Wnt10b2细胞活性受抑制更明显。下调Wnt10b蛋白表达可显著抑制Hep G2细胞增殖、克隆形成和迁移侵袭能力，阻滞细胞周期，诱导凋亡。以上结果提示，Wnt10b在人肝癌细胞恶性增殖、凋亡和迁移侵袭等过程中扮演癌基因角色，其可望作为一个潜在的基因治疗靶点，为肝癌临床防治提供新思路。

37.MTA1沉默对胃癌细胞增殖和运动的影响 原甜甜1衣艳梅2李济伟1林斌斌1杨晓1吴民华2广东医学院：1第一临床医学院；2组织学与胚胎学教研室 湛江524000 虽然胃癌的发病率在近年来有下降的趋势，但其仍然是我国及全世界发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一。早期胃癌的预后较好，而进展期胃癌，特别是伴有淋巴结或血道转移者预后较差，其5年生存率小于50%。因此，探索胃癌发生发展和转移的相关因素，对胃癌的预后判断及治疗方案的选择具有重要意义。本研究观察了转移相关基因1（MTA1）基因沉默对人胃癌细胞SGC7901增殖和迁移侵袭能力的影响，探讨MTA1基因在胃癌发生发展中的作用。利用脂质体法将靶向MTA1的小分子干扰RNA（siRNA）转染到胃癌细胞株SGC7901中，运用 实时定量PCR和Western blot技术检测SGC7901细胞内MTA1的m RNA和蛋白表达水平，CCK－8法检测细胞增殖能力，Transwell小室实验观察细胞迁移和侵袭能力。结果显示，MTA1 siRNA可有效抑制SGC7901细胞MTA1基因在mRNA和蛋白水平上的表达。CCK－8实验表明MTA1 siRNA转染后细胞增殖不受影响；Transwell小室实验表明细胞迁移和侵袭能力明显下降。结果表明，沉默MTA1表达可抑制胃癌细胞株SGC7901迁移和侵袭，而不影响细胞增殖。由此提示，MTA1在胃癌侵袭转移过程中可能发挥重要作用。

38.EGF／EGFR介导的ALC1／CHD1L表达对肝癌细胞增殖的影响 李杨 冯丽 白银山 马宁芳 广州医科大学基础学院组织胚胎学教研室 广州511436 Chromodomain Helicase／Adenosine Triphosphatase DNA BindingProtein 1－Like（ALC1／Chd1l）为1q21区的致癌基因，是肝癌细胞恶性增殖、间质－上皮转化、浸润转移及恶性转化的一个关键因素，在多种实体肿瘤中存在高水平表达，其表达调控是控制肝癌细胞恶性增殖的关键。表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）及其受体（EGFR）与胚肝发育和肿瘤发生有关，EGF／EGFR信号通路和ALC1／Chd1l之间的调控关系目前不清楚。本研究通过ALC1／Chd1l sh RNA干扰、RT－PCR、MTT实验、免疫组织化学等方法探讨了EGF／EGFR信号通路与ALC1／Chd1l基因在肝癌细胞中表达的关系。实验选用人肝癌Hep G2和7402细胞，统计分析所选hEGF最佳适宜浓度和作用时间，确定表皮生长因子h EGF的有效浓度为100ng／μl，连续刺激24h后，采用RT－PCR技术检测ALC1／CHD1L基因m RNA的表达量；细胞免疫荧光显示7402和Hep G2细胞中有ALC1／Chd1l与EGFR的共表达；7402细胞ALC1／Chd1lmRNA的基础表达水平低于Hep G2细胞，MTT实验结果显示，EGF作用12h后Hep G2和7402细胞ALC1／Chd1lmRNA的表达开始增加，24h达峰值，细胞的增殖随之增加，以7402细胞的效果更为显著；sh RNA干扰实验结果显示敲减Hep G2细胞ALC1／Chd1l后，再次加入h EGF因子，可引起ALC1／Chd1l表达再次升高。本实验结果提示EGF／EGFR信号通路介导了ALC1／CHD1L基因的表达，从而影响肝癌细胞的增殖，对于EGF／EGFR信号通路调控ALC1／Chd1l的机制有待进一步证实。

39.核转录因子SP1与肿瘤的关系 何倩丽1林冬静2吉林医药学院：1临床医学2010级；2组织学与胚胎学教研室 吉林132013 特异性蛋白（specificity protein，Sp）是一类广泛存在的锌指蛋白超家族成员，通过同源序列C端3个串联的Cys2His2型锌指结构域识别富含GC／GT盒启动子区，并以不同亲和力与之结合，调节基因转录过程，参与机体生理、病理过程的调控。在Sp家族9个成员（Sp1～Sp9）中，Sp1蛋白被认为是该家族中功能最强的转录激活因子，与REST、AP2、CPBP等形成转录复合物，对富含GC盒启动子区具有很强的亲和力。总结近年来研究发现，SP1在人类许多肿瘤中高表达或异常活化，这可能与肿瘤原癌基因、抑癌基因及细胞周期调控分子、凋亡抑制蛋白等相关基因的调控有关，探讨其对肿瘤发生、发展的影响作用及机制，主要通过 TGF－β、PI3K／Akt、ERK1／2、Wnt／β－catenin、Notch信号转导通路，参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移及血管生成。因此，SP1可能作为多种恶性肿瘤治疗及其预后的潜在指标。

40.ω－3多不饱和脂肪酸对结肠癌细胞的作用及机制研究 章坤 胡志梅 时哲敏 齐海霞 常亚楠 韩亚伟韩晓辉郑丽娜洪伟 天津医科大学组织学与胚胎学系天津300070 结肠癌的发病率及死亡率在恶性肿瘤中位居前列，全球以每年超过百万新增病例的速度递增，我国结肠癌的发病率近年来也迅速升高。已有报道表明，ω－3多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFAs）对多种肿瘤有抑制作用。本研究探讨ω－3 PUFAs对结肠癌发生发展的作用及其机制。结果显示，ω－3 PUFAs抑制结肠癌细胞的增殖并诱导结肠癌细胞的凋亡，且ω－3 PUFAs的作用具有浓度和时间依赖性；对ω－3 PUFAs作用机理的探究发现，ω－3 PUFAs通过促进癌蛋白YAP1的磷酸化，引起YAP1从细胞核向细胞浆转移。ω－3 PUFAs不仅引起YAP1的磷酸化水平升高，同时降低总YAP1／TAZ的蛋白水平。通过引起癌蛋白YAP1的去激活，ω－3 PUFAs抑制YAP1介导的促增殖和抑凋亡靶基因的表达，从而抑制结肠癌的发生发展。通过RNA干扰技术，我们进一步发现ω－3 PUFAs促进YAP1的磷酸化是通过经典Hippo通路的关键分子MST和LATS，而且观察到ω－3 PUFAs同样能够促进LATS的磷酸化。通过在人的结肠癌标本和结肠癌小鼠模型中的进一步的研究表明ω－3 PUFAs通过与特定的受体结合激活Hippo信号通路促进YAP1的磷酸化，进而抑制结肠癌的发生发展。

41.核受体介导褪黑素抑制胃癌血管生成 王日雄 宋军罗建华张慧马赛君刘卉 周瑞祥 福建医科大学福州350108 肿瘤的生长、转移和预后均与血管生成相关。本研究旨在探讨乏氧条件下，运用CCK－8、ELISA、real time RT－PCR、ICC、WB、siRNA沉默核受体RZR／RORγ等方法研究褪黑素（MLT）抑制胃癌血管生成作用及其与褪黑素核受体的关系。首先观察了MLT体外抗人胃癌细胞增殖及其对MLT核受体的影响：建立不同浓度不同时间点MLT对人胃癌细胞株干预模型，结果显示，MLT抑制人胃癌细胞MGC－803、SGC－7901、AGS增殖，呈时间剂量依赖性，100μmol／L氯化钴模拟的化学性低氧可促进人胃癌细胞SGC－7901增殖；MLT下调人胃癌细胞VEGF mRNA与蛋白表达，同时下调核受体RZR／RORγ表达。然后检测了MLT体外抗人胃癌细胞SGC－7901血管生成机制及MLT核受体RZR／RORγ的作用研究：建立乏氧条件下3 mmol／L浓度MLT干预24h对人胃癌细胞SGC－7901影响的体外模型，结果发现，应用siRNA技术沉默ROR／RZRγ能明显拮抗MLT对胃癌细胞增殖的抑制作用；乏氧条件下，3 mmol／L MLT干预24h后明显下调胃癌细胞RZR／RORγ表达，并下调SENP1、HIF－1α、VEGF mRNA及蛋白表达；沉默核受体则逆转该效果。最后分析了MLT体内抗荷胃癌祼鼠血管生成及其核受体机制：应用人胃癌细胞SGC－7901建立荷胃癌祼鼠模型，以不同浓度MLT干预，结果发现MLT能缩小荷胃癌祼鼠的肿瘤体积，减轻肿瘤重量，达到抗肿瘤作用；MLT能下调肿瘤组织核受体RZR／RORγ表达并下调SENP1、HIF－1α、VEGF、MVD表达，抑制肿瘤血管生成；MLT下调肿瘤组织核受体RZR／RORγ表达。本研究证实褪黑素能够抑制人胃癌细胞SGC－7901血管生成，其机制包括通过下调核受体RZR／RORγ表达，进而抑制SENP1、HIF－1α、VEGF表达，最终抑制肿瘤血管生成，抑制肿瘤细胞生长。

42.Influence of estrogen receptorαphosphorylation at serine 309 on male reproductive functionin of mice Wei Jinhua，Ma Binfang，Cheng Pang，Zhao Jie，Zhang Yuanqiang，Li Zhen.Department of Histology and Embryology，The Fourth Military MedicalUniversity，Xi＇an 710032 Recent studies in estrogen receptorα（ERα）knockout mice have demonstrated that the testicle development is abnormal，and that sperm recovered from cauda epididymis exhibit reduced motilities and fail to fertilize eggs in vitro.Phosphorylation at serine 305（S305）site of ERαis sufficient to recruit coactivator SRC1，and to induce ERαactivity in a ligand－independent manner.The ERαS309 site in mice is homologous with ERαS305 in human.This study was to investigate the influence of estrogen receptorαphosphorylation at S309 on male reproductive function of mice.ERαS309A mutant mice were produced by mutating serine into alanine and the fertility of male mice was observed by mating studies.Epididymal sperm motility was detected by com－puter－assisted sperm analyzer and the expression of epididymal micro－environmentrelated genes in efferent ducts were examined by Real－Time PCR and Western blotting.The results showed that adult ERαS309A male mice were subfertility，and that sperm numbers were normal whereas spermmotilities were lower than those in wild type mice.The expression levels of aquaporin 9（AQP9）and carbonic anhydrase 12（CA12），both containing estrogen response element，were reduced in the efferent ducts of ERαS 309A mice.These results indicate that phosphorylation at S305 site might play an important role in the process of ERα－mediated transcription to maintain a stable fluid／ion transportation in epididymal lumen where sperm aquires their motility.This study provides a basis for future research of the effect of S305 phosphorylation in ERαregulation of male reproductive function.

43.TGF－β1对成年大鼠睾丸间质细胞分泌雌激素的调节作用及机制研究 杨倩倩刘镘利 乔慧莲 马静 李臻第四军医大学组织学与胚胎学教研室 西安710032 正常水平的雌激素在男性生殖系统中同样发挥着重要的作用，雌激素在睾丸局部主要由间质细胞（Leydig cells，LCs）合成，但其分泌的具体调控机制并不完全清楚。转化生长因子－β1（Transforming growth factor－β1，TGF－β1）在睾丸的不同发育阶段均有表达，通过自分泌或旁分泌的方式调节睾丸发育和精子发生。我们采用Percoll连续密度梯度离心法提取、纯化并原代培养成年大鼠睾丸LCs，放免分析不同剂量TGF－β1对Leydig细胞性激素合成的影响；采用氚水释放实验检测雌激素合成的限速酶芳香化酶活性；并通过Western blot和Real－time PCR方法检测芳香化酶编码基因CYP19，及CYP19上PII启动子的转录因子SF－1、CREB的表达情况能否添加R2C细胞中的实验；利用间接免疫荧光技术检测TGF－β1作用后，缝隙连接蛋白43（connexin43，Cx43）在Leydig细胞中的分布情况；采用 Western blot对Cx43蛋白磷酸化亚型含量进行检测；采用荧光漂白后恢复实验对Cx43介导的GJIC进行检测。实验结果表明，原代培养的Leydig细胞经不同剂量TGF－β1处理后，细胞上清中E2和T含量皆低于正常对照组，并呈剂量依赖趋势。TGF－β1作用后，芳香化酶的活性降低，其编码基因CYP19及其转录因子SF－1、CREB在翻译和转录水平上的表达均受到不同程度的抑制。且经TGF－β1处理后，Cx43表达则主要定位于胞浆中，随着其剂量增大及时间延长，磷酸化Cx43蛋白定量明显增多。TGF－β1可显著下调Leydig细胞间的GJIC。以上结果提示，TGF－β1信号通路对CYP19的转录调控是影响LCs中雌激素分泌的重要机制，并且TGF－β1影响LCs间的缝隙链接通讯功能。

44.TET家族在小鼠精原干细胞的表达分析 白银山刘珊珊董文伟冯丽李杨马宁芳 广州医科大学组织胚胎学教研室广州511436 小鼠精原干细胞（mouse spermatogonial stem cells，mSSCs）具有自我更新、分化和去分化的生物学特征，成为干细胞调控、精子发生和体细胞重编程相关机制研究的重要材料，然而关于mSSCs表观调控机制还并不清楚。TET（ten－eleven translocation，TET）家族（包括TET1、TET2和TET3）可以催化5－甲基胞嘧啶（5－methylcytosine，5－mC）生成5－羟甲基胞嘧啶（5－hydroxymethylcytosine，5－hmC），促进基因组DNA的去甲基化，这个表观调控过程涉及干细胞的自我更新、分化、去分化和癌化等众多方面。然而TET家族介导的甲基化调控在mSSCs中的作用也未明确。本文通过RT－PCR、QPCR和免疫组织化学等方法初步分析了TET家族在mSSCs表达情况。RT－PCR检测结果显示TET1／2／3在mSSCs中均存在表达；QPCR结果显示mSSCs中TET3表达水平高，TET1／2表达水平较低；免疫组织化学染色结果显示新生小鼠睾丸组织内TET3较高水平表达在新生小鼠生殖母细胞（gonocytes）和随后出现的mSSCs中；成年小鼠睾丸组织中，TET3表达在各类生精细胞中，但处于基底膜处的细胞表达水平较高，随着向精子分化，表达依次降低。与多能的小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，mESCs）对比，TET1／2在mSSCs中表达水平很低，而TET3高水平表达。这些结果暗示了TET家族在mSSCs自我更新、向精子分化和体外去分化过程中存在着潜在的表观调控作用，更深入的研究有待进一步证实。

45.染色体重塑基因CHD1L对新生小鼠精原干细胞增殖的影响 刘珊珊 冯丽 董文伟 白银山 马宁芳广州医科大学组织胚胎学教研室广州511436 小鼠精原干细胞的自我更新与分化过程受到多个基因的调控，本文旨在探讨染色体重塑基因CHD1L（chromodomain helicase／ATPase DNA binding protein 1－like）在睾丸组织的表达及对维持新生小鼠精原干细胞自我更新的机制。取不同发育阶段雄性C57小鼠睾丸组织制作石蜡切片；二步法消化免疫磁珠分离新生5－7d雄性C57小鼠精原干细胞铺片进行细胞免疫荧光及后续分子实验。采取qRT－PCR、Western Blot、免疫荧光等实验方法检测CHD1L在新生小鼠睾丸中的表达；通过CHD1L－sh RNA慢病毒干扰技术研究CHD1L对相关干性分子表达的调控作用。qRT－PCR结果显示，CHD1L mRNA在睾丸组织中有高表达，并伴随年龄的增长呈现递增的趋势，而CHD1L蛋白表达则出现相反的趋势；免疫组织化学染色结果显示，CHD1L阳性细胞位于曲细精管基底膜内侧，并与MVH（生殖细胞特异性标记）、干性相关基因OCT4、PLZF、GFRa1（精原干细胞特异性标记）共表达；细胞实验结果显示，干扰CHD1L表达后明显下调OCT4，PLZF，GFRa1的表达；干扰组精原干细胞克隆数及Brdu阳性细胞比率明显低于对照组；以上实验结果提示，CHD1L表达于新生小鼠睾丸未分化精原细胞内，与精原干细胞的增殖密切相关。

46.小鼠精子成熟过程唾液酸分子的表达变化 马雪倩1马芳1，21四川大学华西基础医学与法医学院 成都610041，2四川大学华西第二医院 成都610000 唾液酸是蛋白质合成后糖基化修饰的一种常见形式，普遍存在于多种蛋白肽链上，调节蛋白质的性质及影响其功能。最新研究表明，哺乳动物成熟精子表面存在着丰富的唾液酸分子，其类型的不同及含量的变化在精子成熟过程中起着重要作用。本实验目的是为了明确小鼠精子在附睾不同区域成熟过程中，其表面唾液酸含量与类型的变化，初步探索唾液酸对精子存活的保护作用及机制。实验采用C57BL／6性成熟的雄性小鼠15只，体重30g（8－10w）。分别取附睾不同部位（头部、体部、尾部）的附睾液，采用HPLC检测精子表面唾液酸分子的含量以及类型，Western blot检测精子表面唾液酸蛋白的类型，利用荧光染色测定不同部位的精子活力。HPLC检测发现，小鼠附睾中精子表面存在N－乙酰神经氨酸和羟－乙酰神经氨酸两种唾液酸形式，其含量从附睾头部至尾部显著增加；Western Blot检测发现α2－3，α2－6连接的唾液酸表达从附睾头部至尾部显著增加；随着唾液酸及其连接表达的增加，精子的活力也增加。由此可见，小鼠精子表面有非常丰富的糖分子，其末端的唾液酸分子尤其丰富，所携带的负电荷与精子的运动能力有关。从头部至尾部精子的唾液酸逐渐增加，活力上升，推测精子表面的唾液酸化在附睾中呈动态变化，可能对精子受孕能力的储备有一定的作用，即精子在附睾中从形态到功能逐渐成熟。

47.MAPK磷酸酶－1调节睾丸闭锁蛋白occludin功能的机制研究 潘艺青 徐晨 上海交通大学医学院人体解剖与组织胚胎学系 上海市生殖医学重点实验室 上海200025 睾丸的免疫调控系统是一个多因素构成的复杂网络体系，内在因素相互影响、相互作用共同维持睾丸的免疫自稳，为精子生成提供特定的微环境。在炎症及感染等病理状态下，免疫系统不仅能积极动员对抗外来入侵，还可能打破内在平衡而发生自身免疫反应，严重则导致免疫性不育。故此生殖免疫调控机制越来越受到关注，阻止自身免疫不良结局也成为亟待解决的问题。MAPK磷酸酶－1（MKP－1）属于双特异性磷酸酶家族，可选择性使MAPK信号通路分子中磷酸丝／酪氨酸残基去磷酸化，下调炎症反应，在免疫调控中发挥非常重要的负调节功能。然而MKP－1分子在生殖系统中的功能研究甚少，MKP－1在睾丸Sertoli细胞中的功能迄今未见报道。本研究首先观察MKP－1分子在小鼠睾丸组织的时空表达规律，发现出生后小鼠睾丸组织即表达MKP－1分子，其主要定位于生精小管Sertoli细胞，精子细胞弱表达。通过以MKP－1基因敲除（KO）小鼠作为研究对象，观察MKP－1 KO小鼠生殖系统表型，发现MKP－1 KO小鼠精子活动率和前向运动力降低、精子畸形率明显增加；血－睾屏障结构改变、通透性增加。为进一步研究睾丸组织中MKP－1作用靶分子，观察KO小鼠睾丸组织紧密连接蛋白（如闭锁蛋白occludin）表达改变及相关MAPK信号分子的作用规律，发现MKP－1可通过MAPK信号分子调节闭锁蛋白occludin的功能，参与调节Sertoli细胞紧密连接动力学改变。上述结果为睾丸生殖免疫调控机制的研究提供新的线索和实验依据。

48.肥胖对雄性小鼠生育的影响及其机制研究 凡永1刘悦1薛珂1顾国宝 樊卫民2徐雅丽1，3丁之德11上海交通大学医学院解剖学与组织胚胎学系 上海市生殖医学重点实验室，2闸北区中心医院，3瑞金医院生殖中心 上海200025肥胖是一种可严重损害青少年和成人健康的综合代谢性疾病，可诱发包括心血管疾病、2型糖尿病、高血压和癌症在内的多种疾病。尽管肥胖对女性生殖或者卵细胞发育的不良影响已成共识，但其对男性生育力的危害还尚未定论。本研究旨在于探索高脂饮食诱导的肥胖是否会损伤雄性生育力，并从动物模型上进一步揭示其作用机制。高脂喂养雄性C57BL／6小鼠10周建立起肥胖模型。与正常饲料喂养的雄鼠相比，肥胖雄鼠的精子活动力以及前向活动力显著下降，其精子畸形率明显上升，精子的顶体反应发生率下降；同时，肥胖雄鼠雄激素水平下降，雌激素水平上升。由此可见，精子功能参数的改变有力地证明了肥胖雄鼠的生育力受到损伤，此结论也被与肥胖雄鼠合笼配对的实验后雌鼠其受孕率下降所证实。睾丸形态学的超微结构分析显示，肥胖鼠睾丸生精上皮严重空泡化，生精细胞间以及生精细胞与支持细胞间的细胞连接松散。进一步的Western blot分析表明，肥胖鼠睾丸中构成血睾屏障的相关蛋白occludin、ZO－1及androgen receptor显著降低，而囊泡运输相关蛋白clathrin显著升高，血睾屏障的完整性明显受损。综上，肥胖可致雄性小鼠精液中精子功能参数和性激素水平显著下降，其结果可导致小鼠生育力受损，而血睾屏障的破坏可能是肥胖影响雄性生育力机制中的一个重要环节。

49.Bmp4／smad信号通路对小鼠卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响 丁祥云1郝晶21山东医学高等专科学校组织学与胚胎学教研室 临沂276000，2山东大学组织学与胚胎学教研室 济南250012 骨形态蛋白4（Bone morphology protein 4，Bmp4）是调控卵泡发育的一种关键基因，但其对颗粒细胞的调控作用尚不清楚。因此，我们探讨了Bmp4／smad信号通路对小鼠颗粒细胞增殖与凋亡的影响及其可能的作用机制。首先采用免疫组织化学方法，检测到生后各周小鼠卵巢中均表达Bmp4及p－Smad1／5／8，尤其新生至3w小鼠卵巢中各基因表达较多，随后表达逐渐减弱。然后，通过卵泡穿刺法获取小鼠颗粒细胞体外培养，分对照组、Bmp4组（添加重组Bmp4）和添加Bmp4抑制剂组。各组分别于培养24h、48h后，Brdu及Mtt结果显示Bmp4抑制剂组颗粒细胞增殖与存活率均高于对照组和Bmp4组；TUNEL染色检测凋亡的颗粒细胞占细胞总数的比率，Bmp4组明显高于对照组和Bmp4抑制剂组；免疫荧光及 Western blotting结果显示，加入Bmp4可明显促进细胞内p－Smad1／5／8入核。以上研究结果表明，Bmp4可促进小鼠颗粒细胞凋亡、抑制其增殖与存活，并可能通过激活Bmp4／smad信号通路而发挥作用。

50.双酚A影响胚泡植入的作用机制研究 潘晓燕 李质馨 王喜艳 窦肇华 吉林医药学院组织学与胚胎学教研室 吉林132013 双酚A（Bisphenol A，BPA）是世界上使用最广泛的工业化合物之一，从矿泉水瓶、医疗器械、食品包装的内里、罐头内包装、婴儿用瓶、牙科填充剂以及其他数百种日用品中都含有BPA。BPA结构类似于雌二醇和己烯雌酚，具有弱的雌激素活性，其在机体中发挥作用的方式与雌激素相似，主要是通过与靶细胞上的雌激素受体结合而干扰机体正常的生殖功能。为阐明BPA对胚泡植入的影响及其作用机制，本研究将昆明孕鼠从D0.5到D4.5分别灌服200，400，和600 mg／kg／d的BPA，统计胚泡的着床点数，检测孕鼠体内的雌激素水平、子宫内膜上雌激素受体和粘附分子的表达以及囊胚上粘附分子的表达。结果发现400 mg／kg／d BPA能明显降低孕鼠着床点数，600 mg／kg／d BPA抑制胚泡着床，没有观察到着床点；D5孕鼠血清中的雌激素水平没有显著差异，BPA没有影响卵巢对雌激素的合成和分泌；但在400和600 mg／kg／d BPA处理组，子宫内膜基质细胞中的雌激素受体α表达较对照组显著减少，影响雌激素对子宫内膜发育的调控作用。此外，200 mg／kg／d BPA处理组子宫内膜和囊胚中粘附分子integrinβ3和trophinin的表达与对照组没有显著差异，而400 mg／kg／d和600 mg／kg／d BPA处理组孕鼠子宫内膜和囊胚中integrinβ3和trophinin的表达显著降低。由此可见，高浓度BPA显著降低子宫内膜中雌激素受体的表达，影响雌激素对植入期子宫内膜发育的调控作用，使子宫内膜和囊胚细胞中粘附分子integrinβ3和trophinin的表达显著降低，从而影响了胚泡与子宫内膜之间的粘附，造成着床点数量显著降低。

51.DMBG对PCOS大鼠卵巢中Akt／HIF－1α通路的影响 王凡 陈佳洁 张正红 王昭凯 王正朝 福建师范大学生命科学学院 福建省发育与神经生物学重点实验室福州350007 为了阐明DMBG对PCOS大鼠卵巢中Akt／HIF－1α通路的影响，本实验通过免疫组织化学与蛋白印迹方法对来曲唑诱导的PCOS大鼠卵巢中AKT／HIF－1α信号通路的表达情况进行分析，并通过DMBG药物干预对该信号通路在PCOS发生及其治疗中的作用进行研究。首先，18只6周龄有规律4天动情周期的清洁级SD大鼠随机分为空白对照组、溶剂对照组和PCOS模型组，每组6只，重复两次，通过阴道涂片与卵巢组织学对PCOS大鼠模型的建立进行确认。然后，再利用上述PCOS建模方法进行DMBG药物干预实验，18只6周龄有规律4天动情周期的清洁级SD大鼠随机分为治疗对照组、PCOS模型组和DMBG干预组，每组6只，重复两次。实验动物的卵巢一侧固定，用于HE染色及免疫组织化学染色；另一侧冷冻，用于功能蛋白的表达检测。结果发现，PCOS模型组大鼠均处于动情周期间期，表明没有排卵；卵巢组织学结果发现对照组大鼠卵巢除了含有卵泡外还含有许多黄体，PCOS模型组大鼠卵巢含有大量的排卵前卵泡，而DMBG干预组大鼠卵巢中还有少量的黄体；免疫组织化学结果表明HIF－1α、ET－2，Akt及两个不同位点磷酸化的Akt蛋白主要在卵泡颗粒细胞中表达，且PCOS大鼠卵巢中具有不同程度的降低。蛋白印迹结果进一步表明Akt／HIF－1α通路蛋白在PCOS大鼠卵巢中均有不同程度的降低，DMBG可以拯救这些蛋白的表达，从而缓解PCOS的症状。综上所述，在PCOS发生过程中大鼠卵巢颗粒细胞中Akt／HIF－1α通路在不同程度上被抑制或损坏了，DMBG药物干预可以在一定程度上逆转该现象，缓解PCOS症状（本研究受教育部新世纪优秀人才支持计划NCET－120614资助）。

52.非标记蛋白组学揭示能量代谢和局部粘附调节子宫内膜的容受性 陈骞 徐晨 上海交通大学医学院解剖学与组织胚胎学系 上海市生殖医学重点实验室 上海200025 女性子宫内膜根据月经周期激素水平的周期变化也呈现周期性变化，这种周期性变化对子宫内膜容受态的建立和胚胎的顺利着床是至关重要的。然而，目前对子宫内膜容受态建立的分子机制仍然知之甚少。本研究中，我们采用液相色谱质谱联用（LC－MS）为基础的非标记定量（label－free quantitative）蛋白组学分析的方法，对正常育龄期妇女的增生期和分泌中期（种植窗期）子宫内膜进行了比较分析（每组6例）。结果共检测到2138个蛋白，其中317个蛋白在增生期和种植窗期之间有显著统计学差异。显著差异蛋白的相互作用网络分析显示脑型肌酸激酶（CKB）在种植窗期的上调可能与子宫内膜的容受性相关，而细胞间黏附相关蛋白则整体下调。KEGG信号通路分析的结果与蛋白间相互作用的网络分析结果一致。包括α－actinin（ACTN），细胞外基质蛋白，整合素αV等蛋白在种植窗期均表达下调，这种细胞间局部粘附水平的下降可能有助于胚胎的着床。Western blot分析和免疫组织化学进一步验证CKB蛋白在种植窗期上调和ACTN在种植窗期下调。本研究结果展示了子宫内膜从增生期到分泌期蛋白水平的显著变化，这一结果有助于揭示人类子宫内膜容受态建立的关键生物机制（如能量代谢和局部粘附）。

53.血清E2、P及LIF在异位妊娠早期诊断中的作用 晏长荣 异位妊娠是妇科常见急腹症之一。血清β－HCG检测虽是目前早期诊断异位妊娠的重要方法，但在日常工作中有时尚不足以明确、及时地诊断。本文联合检测血清雌二醇（E2）和孕酮（P）及白血病抑制因子（LIF）水平，以探讨E2、P及LIF在异位妊娠早期诊断中的作用。选择湖北医药学院附属十堰市太和医院和十堰市人民医院等妇科就诊的女性，按入选标准将患者分为异位妊娠组（EP组）80例，先兆流产组（TA组）105例，正常宫内早孕组（NIUP组）130例。采用微粒子酶免疫分析技术、酶免疫技术和放射免疫分析分别对血清中E2、P和LIF水平进行检测。结果显示，3组患者血清中E2、P、LIF在NIUP组最高，TA组次之，EP组最低，3组两两比较，差异均有有统计学意义.我们发现血清E2、P、LIF均有助于鉴别正常妊娠与异位妊娠，可作为临床早期诊断异位妊娠的辅助指标。

54.乙醇诱导C2C12细胞中的atrogin－1表达的研究 初海鹰 于丽君 舒画 马海英 周欣 金伟 大连医科大学组织学与胚胎学教研室 大连116044 酒精相关的肌病特点是严重的骨骼肌生物化学和结构变化与肌萎缩。乙醇在机体代谢过程中产生大量的活性氧（ROS）和自由基，引起细胞的氧化应激和脂质过氧化。泛素连接酶是骨骼肌萎缩中的关键酶，目前已将泛素连接酶E3s中的Atrogin－1作为检测肌萎缩发生的早期生物标记物。本实验采用乙醇作用于C2C12成肌细胞建立急性酒精中毒模型，运用活性氧检测和Western blot检测技术，观察乙醇处理C2C12成肌细胞前后ROS、Atrogin－1、P38蛋白的变化，及给予P38通路的抑制剂后Atrogin－1的表达变化，分析乙醇对C2C12成肌细胞的氧化损伤和影响Atrogin－1的表达机制。结果显示乙醇（100 mmol／L）作用于C2C12成肌细胞24小时后，ROS水平升高，与正常组有显著性差异；在乙醇（100 mmol／L）作用于细胞8－24小时中，Atrogin－1蛋白水平与对照组相比，均有显著性差异，且在8小时表达最多；乙醇（100 mmol／L）作用C2C12细胞8小时后，磷酸化蛋白P－38水平明显升高，与对照组有显著性差异；加入P－38通路的特异性抑制剂SB203580后，与乙醇处理组相比，Atrogin－1蛋白水平明显降低。有此提示，乙醇可引起C2C12成肌细胞中活性氧产生的增加，诱发氧化应激反应；ROS可通过MAPK信号通路里的P－38途径引起Atrogin－1蛋白水平升高。本研究为探索骨骼肌萎缩的发生机制提供新的思路。

55.Mir－181a在缺血再灌注诱导的心肌细胞自噬中的作用及机制研究 丁宝龙 隽兆东 管英俊 陈燕春接琳琳周风华 潍坊医学院组织学与胚胎学教研室 潍坊261053 本研究利用原代培养Wistar大鼠乳鼠心肌细胞和H9C2心肌细胞系观察mir－181a在缺血再灌注所诱导的心肌细胞自噬中的作用及其机制。通过缺氧10h复氧2h，体外模拟缺血再灌注损伤，实时定量PCR测定原代心肌细胞和H9C2细胞内mir－181a在缺血再灌注前后的表达变化。将H9C2细胞随机分为4组，分别转染mir－181a up（up组）、mir－181a control up（con up组）、mir－181a down（down组）和 mir－181a control down（con down组）4种质粒，模拟缺血再灌注损伤后，通过倒置荧光显微镜观察转染24h和48h时细胞的转染效率，运用实时定量PCR技术测定各组在转染24h和48h时mir－181a的变化，免疫印迹法测定各组转染24h和48h时的Atg5（Atg5为mir－181a的靶基因）和LC3II的表达变化。实时定量PCR结果显示，在缺血再灌后，原代wistar大鼠心肌细胞与H9C2细胞的mir－181a表达降低，说明mir－181a参与缺血再灌注损伤的调控。细胞转染结果显示24h和48h时各组细胞的转染效率较高、细胞存活率好。实时定量PCR结果显示，转染24h和48h时up组mir－181a的表达均高于con up组，而down组mir－181a的表达均低于con down组。免疫印迹结果显示24h和48h时up组Atg5和LC3II均低于con up组，而down组高于con down组，即上调mir－181a后，Atg5蛋白反而下降，而下调mir－181a后，Atg5蛋白则升高。结果表明，mir－181a参与缺血再灌注损伤的调控，并通过负性调控Atg5的表达来实现对自噬的调节。

56.自噬相关基因Atg7在环境毒素MPTP引起的中脑多巴胺神经元损伤中的作用 牛雪园 温州医科大学组织学与胚胎学教研室 神经科学研究所 温州325035 自噬与帕金森病的发病进程有着一定的关系。本实验采用5月龄自噬相关基因Atg7条件性敲除小鼠TH－cre Atg7 flox／flox小鼠和野生型（wildtype，WT）小鼠，采用随机化原则分为4组进行实验研究：TH－cre Atg7 flox／flox小鼠生理盐水注射组、TH－cre Atg7 flox／flox小鼠MPTP注射组、WT生理盐水注射组和WT MPTP注射组。在连续慢性造模5周后，进行足迹实验、转棒实验、旷场实验等行为学检测，酪氨酸羟化酶（Th）免疫组织化学染色对中脑黑质多巴胺残存神经元计数和纹状体光密度分析，免疫印迹法对帕金森病病理学特征α－突触核蛋白量进行检测。结果显示，条件性敲除Atg7小鼠中脑黑质多巴胺神经元数目下降，说明基本自噬对于多巴胺神经元正常存活起着重要作用；对造模情况进行免疫蛋白印迹分析显示，WT MPTP注射组α－突触核蛋白量与WT生理盐水注射组相比增加显著，说明造模成功。行为学分析显示，与WT MPTP注射组相比，TH－cre Atg7 flox／flox小鼠 MPTP注射组步态不平稳性得到了部分补偿；黑质神经元计数的结果显示，TH－cre Atg7 flox／flox小鼠MPTP注射组残存神经元胞体数高于WT MPTP注射组；纹状体光密度分析结果也同样显示了自噬敲除后光密度得到了部分补偿。以上结果说明抑制自噬可减弱于MPTP的敏感性，表明自噬在MPTP致帕金森病进程中可能对神经元有一定的损伤作用。

57.干预自噬小鼠LSK数字基因组表达谱的变化 林巍巍 陈颖 李奕 谈玲 王晓冬 南通大学医学院组织学与胚胎学教研室南通226001 电离辐射可导致造血系统细胞的DNA损伤，影响基因表达进而导致造血干细胞功能受损。在干预小鼠的自噬水平对辐照后造血系统的保护实验中，我们已经证明自噬对造血系统有一定的保护作用。但是，其机理和可能的调节途径尚不清楚。为了阐明自噬机制在DNA损伤及修复中基因表达和调控的影响，本实验利用华大基因公司数字基因组表达谱（RNA－Seq），分析自噬提高型（RAPA组）、自噬缺失型（Atg7－／－组）和野生型小鼠（Ctrl组）3组造血干细胞（Linege－，Sca－1＋，c－Kit＋，LSK）基因表达的变化并进行生物信息学分析。通过对3组样品的差异表达基因的两两比较，找到77个基因在Atg7－／－组中表达最高，而在RAPA组表达最低；204个基因在Atg7－／－组中表达最低，而在RAPA组表达最高。其差异倍数（log2｜fold＿change｜＞2）和显著水平（q＿value＜0.05）两个水平，挑选出 Atg7－／－组高表达的22个表达差异转录本，GO分析确定这些差异基因行使造血、细胞的死亡、细胞周期对氧压力的防御反应有关的生物学功能。KEGG pathway注释这些差异基因主要参与细胞周期和DNA的复制等一些信号通路。选取与DNA修复、DNA损伤的反应和应对电离辐射反应有关的基因在3个组中的表达进行聚类分析，并运用Real time PCR技术验证其中13个基因的差异表达情况，发现与RNA－Seq测序结果基本一致，其中ATM及其引发下游HR或NHEJ两条修复途径中的Rad51和lig4的基因表达量在RAPA组中表达最高，而在Atg7－／－组表达最低，但p53的表达却是RAPA组增高，Atg7－／－组表达最高。我们推测预激活自噬机制可以提高LSK的损伤应激反应机制和损伤修复机制，也促进p53的表达提高细胞生存率，促进DNA修复。而自噬缺陷的LSK这些参与损伤应激和修复机制的基因表达都相应减少，而ROS水平的增加和p53表达的明显增高可进一步诱导细胞的凋亡。这为今后深入研究自噬对造血系统的辐照保护的分子机制提供了思路。

58.胚胎期小鼠肾组织的形态学研究 顾玲 陈雪 丛敬 张婕 田莹莹 翟效月 中国医科大学组织与胚胎学教研室 沈阳110122 肾脏发生经历前肾、中肾和后肾3个阶段，小鼠后肾结构的发生始于胚胎（E）10.5天。通过观察其后肾胚胎期发育的组织学特征，可揭示早期肾发育中微细结构的形态演变规律。本研究收集E12、E14、E16、E18天胎龄小鼠肾脏，4%多聚甲醛浸泡固定，石蜡包埋并5μm连续切片，病理切片扫描仪获取数字图像，计算机配准，C语言编程，追踪并观察肾微细结构。E12天，小鼠后肾中央由于输尿管芽侵入出现髓质，可见间充质细胞稀疏分布，周围是致密的基质细胞。随着肾发育，从肾被膜下至皮髓交界处的整个皮质区出现了依次分布的生肾区及Ⅰ至Ⅴ期肾单位。输尿管芽分支增多，其芽泡分布于被膜下的生肾区。与之相连接的肾单位数目也随发育而增多。小鼠出生前（E18天），肾髓质仍可见大量梯状排列的间充质及垂直其中的髓襻等结构，其数量远少于成年肾脏髓质中的髓襻。皮髓质中血管网稀疏分布。综上，小鼠后肾中髓质出现早于皮质，而皮质发育快于髓质，出生前髓质发育远没完成，但已有部分成熟结构，提示其髓质尿液浓缩功能的完善在生后完成。

59.小鼠肾近端小管与出球微动脉的三维重建 陈雪任昊杨蓓林庚翟效月 中国医科大学基础医学院组胚教研室沈阳110122 为探讨小鼠皮质微循环分布与重吸收功能的关系，本研究三维重建了肾近端小管和出球微动脉的走行，分析其走行特点及毗邻关系。C57／BL／6J小鼠灌流固定后树脂812包埋，垂直肾长轴连续半薄切片，甲苯胺蓝染色，显微镜下获取数字图像，计算机配准，C语言编程，追踪并三维重建近端小管和出球微动脉走行。在皮质迷路中，近端小管起始段在离开肾小球后，先向被膜方向走行约100～1400μm后返折，在各自肾小球周围盘曲并占据相对独立的区域。在髓放线中，近端小管直部的走行有明显的层次：来自皮质浅层肾单位的近端小管直部走行于中央，来自皮质深层肾单位的近端小管直部则依次走行在其外围。所有近端小管都止于肾外髓外带与内带的交界处，并移行为髓袢降支细段。出球微动脉的走行与其肾小球在皮质分布的位置有关。其共同之处是，在形成球后毛细血管网之前都有一支向被膜方向走行一段距离。浅表与中间皮质肾单位的出球微动脉向被膜走行10～260μm。而来自近髓肾单位的出球微动脉向被膜走行120～250μm。但是，中间皮质肾小球的出球微动脉另有一分支出球后短暂走行即形成毛细血管网；而近髓肾小球除上述两支外，另有一支伸入髓质构成直小血管下降支。此外，来自同一肾单位的近端小管与出球微动脉并没有明显的伴行关系。综上，来自肾皮质不同水平的近端小管与出球微动脉的空间走行具有各自的规律与特点。出球微动脉形成的球后毛细血管网依肾小球在皮质中的分布而呈现区域支配：而不依自身肾单位近端小管的走行而分布，提示皮质肾小管重吸收功能的微循环可能是整体而非单一肾单位性的调节。

60.小鼠肾近端小管形态计量学研究 梁非 王慧 顾玲 翟效月 中国医科大学组织学与胚胎学教研室沈阳110122 肾近端小管具有较强的重吸收功能，也是肾缺血、缺氧及高糖应激中易受损伤也易被修复的节段。根据对人、大鼠及兔近端小管形态计量学的研究，按超微结构的不均一性一般将近端小管分为S1、S2和S3三段。S1段起始于肾小球，构成近端小管曲部的约2／3；S2段由剩余的曲部和直部的起始部分构成；剩余的近直小管则为S3段，位于深层皮质和外髓的外带。在功能研究中发现肾近端小管的这种分段是与其功能相对应的。很多小鼠近端小管的研究也直接沿用这种节段性加以分析。但是，这种节段性已被证明有种属差异。我们通过利用计算机辅助的三维重建技术，以C57／BL／6J小鼠肾组织连续切片形成的系列配准的显微图像为基础，运用超微结构体视学的方法，分别对起源于皮质三个水平的肾单位浅表肾单位（4条）、中间肾单位（4条）和近髓肾单位（3条）的近端小管亚细胞结构的包括微绒毛高度、管腔直径和上皮高度，管壁的体积，内吞体包括溶酶体的体密度，线粒体的体密度的节段性进行分析。在这些指标中，我们发现上皮高度、管壁的体积、内吞体包括溶酶体的体密度等指标的曲线有相似的变化趋势，即在曲部的起始阶段保持平直，而在曲部的后部升高，在曲直交界区域保持高位，而后在通过直部起始部位后开始下降。这个趋势与S1、S2和S3的分段相吻合，但这些指标的变化很微小，没有像其他种属的变化显著。而对微绒毛高度、管腔直径线粒体的体密度等指标的研究中我们没有发现具有节段性分布的特点。这项研究为以后小鼠近端小管形态与功能的研究提供了依据。

61.化学性缺氧对肾小球系膜细胞核转录因子Nrf2及其下游抗氧化酶蛋白表达的影响 林庚 杨蓓中国医科大学组织学与胚胎学教研室沈阳110122 探讨化学性低氧模型剂氯化钴（cobalt chloride，CoCl2）对大鼠肾小球系膜细胞核转录因子Nrf2及其下游抗氧化酶硫氧还蛋白（Srx），γ－谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基（Gclc）蛋白表达的影响。采用培养的大鼠肾小球系膜细胞株，500μmol／L CoCl2作用2、6、12、18、24h；利用Western－Blotting检测不同暴露时间点细胞核、细胞浆和细胞总的Nrf2蛋白表达及其抗氧化酶Srx、Gclc的蛋白表达；应用Real－time PCR检测不同时间点抗氧化酶Srx、Gclc m RNA表达；结果显示：大鼠肾小球系膜细胞暴露CoCl22h时，Nrf2蛋白表达增多，6h达到高峰，之后随时间的延长Nrf2蛋白表达逐渐降低。Nrf2核蛋白表达的时间效应性与细胞总的Nrf2表达完全一致。Srx和Gclc表达亦存在时间效应性，即暴露CoCl26h，Srx和GclcmRNA和蛋白表达随时间延长逐渐升高，12h达到高峰。综上表明，大鼠肾小球系膜细胞暴露CoCl2后，能够诱导细胞内Nrf2的蛋白表达，并促进其转位进入细胞核，调节其下游抗氧化酶Srx、Gclc基因转录活性和蛋白表达。

62.喹硫平抑制MAPK和NF－κB通路的激活而抑制RANKL诱导的破骨细胞形成 汪云 王洪凯 李涛肖岚 第三军医大学组织学与胚胎学教研室 重庆400038 骨质流失是许多恶性肿瘤如乳腺癌、前列腺癌主要的并发症之一，了解破骨细胞形成机制对于防治肿瘤骨转移有重要意义。RANKL是NF－κB受体活化剂，是破骨细胞分化中的关键因子，在肿瘤相关的骨吸收中也起重要作用。本实验中我们发现一种抗精神病药——喹硫平能在体外抑制RANKL诱导的破骨细胞的分化。运用RAW264.7细胞及骨髓来源的巨噬细胞（BMMs）经RANKL诱导模型，我们发现非毒性剂量喹硫平能在RAW264.7细胞和BMMs细胞中抑制RANKL介导的破骨细胞分化，并能减少MDA－MB－231细胞导致的溶骨性损伤。进一步分子生物学实验结果显示喹硫平处理细胞后能降低P－P38、MAPK、P－ERK1／2和P－JNK的表达水平。在NF－κB通路中喹硫平能降低P－P65的表达，阻止P65入核及延缓IκBa的降解。提示喹硫平可通过抑制RANKL介导的MAPK和NF－κB通路来抑制破骨细胞的形成，可能成为骨质溶解的新型治疗药物。

63.γ分泌酶在大鼠体内分布与表达研究 杨智英1罗学港2严小新21长沙卫生职业学院药学系 长沙410100，2中南大学湘雅医学院解剖学与神经生物学系 长沙410013 为从不同角度观察γ分泌酶在大鼠脑和外周组织的分布和表达，探讨γ分泌酶的生物学意义，取成年正常SD大鼠脑、眼球、触须垫 （大鼠触须生长区的皮肤）、骨骼肌、心、肝、胰腺、胃、空肠、结肠、睾丸、卵巢、肾、脾等组织制作冰冻切片，与氚标记的γ分泌酶抑制剂L685，458（［3H］－L685，458）共孵育后放射自显影成像；采集图像并经光密度分析，以脑组织顶叶皮层的密度为基准，标准化各部位密度，得到各组织的相对分布密度；将大鼠各组织匀浆与［3H］－L685，458进行结合实验，得到各组织γ分泌酶与［3H］－L685，458结合的最大结合容量（Bmax）和解离常数（Kd）。结果显示，［3H］－L685，458结合位点存在于检测的所有器官／组织中。脑组织顶叶的结合位点均匀分布在皮质各层。与脑组织比较，眼中有中等程度的结合位点，眼球晶状体中的结合位点最少；皮肤中的结合位点比所有被检测组织的都要多，且集中于毛囊附近；骨骼肌中的结合位点普遍较低；心肌组织的结合位点略低于脑组织，主要集中表达在心壁内层；肝脏和消化道管壁都有丰富的结合位点，消化管结合位点密集存在于粘膜层；睾丸和卵巢有较丰富的结合位点，略高于脑组织，其中卵泡的结合位点高于其他部位；肾皮质和髓质结合位点与脑组织密集度基本一致；脾脏中结合位点较少。各组织测定的相对结合密度与放射自显影结果一致。脑、外周组织匀浆与［3H］－L685，458结合实验显示不同组织有着不同的最大结合容量，最大结合容量数值与各组织放射自显影检测的相对结合密度基本一致，而解离常数无显著性差异。γ分泌酶在大鼠体内广泛而不均匀分布，并具有组织选择性；在所检测的组织中，皮肤中γ分泌酶分布的丰度最高，且集中在毛囊附近；γ分泌酶在脑和外周组织中具有重要的生物学功能。

64.tBHQ通过Nrf2途径抑制亚砷酸钠对小鼠胰岛β细胞的毒性损伤 杨蓓 陈雪 中国医科大学组织学与胚胎学教研室 沈阳110122 本研究旨在探讨叔丁基对苯二酚（tert－butylhydroquinone，tBHQ）对亚砷酸钠（sodium arsenite，Na AsO2）致小鼠胰岛β细胞MIN6毒性损伤的拮抗作用及机制。采用小鼠胰岛β细胞MIN 6细胞株培养，Na AsO2暴露或t BHQ预处理12h后再Na AsO2暴露；MTT检测细胞生长活性，Western blot检测细胞内cleaved－caspase－3和Nrf2蛋白的表达，Real－time PCR检测Nrf2及其调控的II相解毒酶NAD（P）H：醌氧化还原酶1（NQO1）和抗氧化酶γ－谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCLC）mRNA表达。结果显示，Na AsO2（4μmol／L）单独作用于 MIN6细胞，与空白对照组相比，细胞活性明显降低，细胞内的cleaved－caspase－3蛋白表达显著升高；tBHQ（50μmol／L）预处理12h能够显著降低NaAsO2对MIN6细胞损伤作用。与NaAsO2单独作用组相比，tBHQ预处理能够显著增加细胞总的及细胞核内的Nrf2蛋白水平，但对Nrf2的m RNA表达没有显著地影响。tBHQ预处理后，NQO1和GCLC的mRNA表达均明显高于相同浓度Na AsO2单独作用组。综上表明，tBHQ能够诱导小鼠胰岛β细胞内Nrf2的蛋白表达，进而上调其下游II相解毒酶NQO1和抗氧化酶GCLC的转录活性，拮抗亚砷酸钠对小鼠胰岛β细胞毒性损伤作用。

65.L－NAT对大鼠肝脏缺血再灌注后急性胰腺损伤的保护作用 赵姗姗 胡梦琪 王淑惠 李杨 赵纳杰于海 于树娜 蒋吉英 潍坊医学院人体解剖学教研室 潍坊261053 为了探讨N－乙酰－L－色氨酸（N－acetyl－L－tryptophan，L－NAT）对肝脏缺血再灌注损伤后引起的胰腺细胞凋亡是否产生保护作用，本研究观察了LNAT对大鼠肝脏缺血再灌注后急性胰腺损伤的影响。选用雄性成年SD大鼠，随机分为假手术组、缺血再灌注损伤（I／R）组和I／R＋L－NAT组；采用夹闭至肝中叶和左叶肝蒂的分支45Min、再灌注6h的方法制作肝缺血再灌注模型。经左心室灌注固定，取胰腺组织，冰冻切片，HE染色检测观察胰腺细胞形态结构的变化；免疫组织化学染色法检测胰腺组织Bax、Bcl－2的表达。结果发现：①对照组胰岛细胞排列整齐，胰腺周围部腺泡结构完整；I／R组胰腺细胞水肿、腺泡间隔明显扩张，炎性细胞浸润；L－NAT干预后胰腺形态变化明显减轻。②免疫组织化学染色结果显示，对照组仅有散在数个Bax、Bcl－2阳性表达；I／R后大鼠胰腺细胞Bax和Bcl－2表达显著增加，Bax／Bcl－2显著升高；与I／R组相比，L－NAT组Bax的表达减少，Bcl－2的表达多，Bax／Bcl－2显著降低。上述结果提示，L－NAT可能通过调节Bcl－2家族蛋白的表达、降低Bax／Bcl－2保护肝缺血再灌注后引起的急性胰腺组织损伤，为肝I／R损伤的防治提供新的靶点（本研究受山东省自然科学基金ZR2014HL020资助）。

66.模拟失重对大鼠下颌下腺Ghrelin－O－乙酰转移酶（GOAT）表达的影响 赵洁 赵赫 张金山 马君贤张岩 第四军医大学组织学与胚胎学教研室 西安710032 航天失重引起体液头向转移进而影响消化系统功能。亦饥饿素（ghrelin）是目前发现的惟一一种生长激素促分泌素受体的内源性配体，能够促进生长激素分泌，同时增强食欲，减少脂肪分解，维持能量正平衡。已知饥饿素表达于大鼠下颌下腺，模拟失重可致大鼠血清和下颌下腺组织中饥饿素水平下降。饥饿素－O－乙酰转移酶（ghrelin－O－acyltransferase，GOAT）是一种能将饥饿素第3位丝氨酸残基辛酰化的膜结合酶，主要表达于胃黏膜和胰腺，GOAT是迄今为止惟一能够乙酰化饥饿素的酶。本研究观察GOAT在大鼠下颌下腺的定位与分布，并检测模拟失重状态下大鼠下颌下腺内GOAT表达的变化，为探讨航天失重环境下消化系统功能紊乱的机制提供实验资料。采用尾悬吊模拟失重模型，20只SD大鼠分为2W悬吊组（n＝10）和正常对照组（n＝10），用免疫组织化学方法观察大鼠下颌下腺组织GOAT的定位与分布；用Western－Bolt法检测动物下颌下腺组织中GOAT表达的变化。结果发现GOAT免疫反应阳性细胞主要分布于下颌下腺导管的颗粒曲管、纹状管、叶间导管和浆液性腺泡细胞的胞膜和胞质，颗粒曲管上皮细胞阳性反应较强。模拟失重组大鼠下颌下腺纹状管和颗粒曲管上皮细胞纹状管GOAT的染色强度低于正常对照组。Western－Bolt蛋白检测结果表明，模拟失重组大鼠下颌下腺组织中GOAT表达水平显著低于正常对照组。本研究结果提示，GOAT可能参与模拟失重环境下消化系统功能紊乱的调节（本研究受自然科学基金项目NSFC81272176资助）。

67.DAD1在小鼠肝脏的表达与意义 金晓航1刘恒超2姚颂宇2冯潇1赵洁1第四军医大学：1人体解剖与组织胚胎学教研室；2口腔医学系 西安710032 DAD1（defender against apoptotic cell death，DAD1）是内质网膜上寡糖基转移酶复合物的一个重要亚基。该基因也被认为是抗细胞凋亡因子，一个在肿瘤细胞中被证实的凋亡抑制基因，因此常被作为凋亡相关标志基因之一。已有文献报道，用 Western blot或Northern blot方法证明该基因在肝脏中表达，但组织学表达方式研究甚少。我们通过免疫组织化学方法对DAD1基因在Balb／c小鼠中的表达做普查时发现，在睾丸、附睾、肺、肾等器官中有明显阳性染色；而在肝脏的免疫组织化学染色中，绝大部分肝细胞不显色，为阴性信号，仅仅在肝脏的最外缘的肝细胞中有黄褐色染色，表现为阳性信号。但是用同样的DAD1抗体以同样的二抗应用Western blot研究Balb／c小鼠肝脏中该基因的表达，则可以得到较强的阳性信号。这样似乎矛盾的结果出现，可能与肝脏的组织学结构有关。肝脏为血液非常丰富的器官，有中央静脉、小叶间血管及发达的血窦，血窦中有大量的血细胞。在肝脏的免疫组织化学研究中，血细胞容易出现黄褐色染色，一般认为是假阳性信号，而因为同样的原因出现的显色信号在Western blot中则很难认为是假阳性。虽然肝细胞是功能多样的细胞，而且DAD1基因表达广泛，但这些结果显示DAD1基因在肝组织中绝大多数肝细胞并不表达。因此，目前我们还不能排除在肝癌细胞中是否有DAD1基因的明确表达，但是这些结果提示我们在用DAD1作为肝细胞凋亡相关标志物时需要特别谨慎。

68.小鼠大脑急性缺氧后上调淋巴管及神经再生相关蛋白的表达促进脑新生血管形成 孟繁伟 张彩霞 杨鹏飞 陈丹丹 肖培伦 山东中医药高等专科学校解剖生理教研室 烟台264199 为了探讨大脑急性缺氧后，脑血管再生的关键分子及机制，本研究用免疫组织化学染色法观察大脑急性缺氧后脑血管再生过程，检测血管内皮生长因子 A（VEGF－A）、VEGF－C、CD34、淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE－1）和神经巢蛋白（nestin）的表达。结果显示，急性脑缺血后，新生血管的数量持续增加；较大血管及新生毛细血管均表达CD34，免疫染色结果显示VEGF－A表达随CD34的增加也明显升高，VEGF－A不但在血管内皮细胞及外周细胞表达，也分布于大量神经元胞体及突起。VEGF－C优势表达于部分神经突起，LYVE－1集中表达于部分神经核团中的胞体及纤维束；急性脑缺血后，新生血管则持续表达LYVE－1，VEGF－C，血管结构清晰，成熟血管则不表达LYVE－1，VEGF－C，Cd34呈阳性表达；急性缺氧后，脑组织中神经元呈nestin阳性表达，且发现新生血管内皮细胞也表达nestin；在急性缺氧后，脑血管重建过程中，VEGF－A，VEGF－C表达增加对损伤的神经元起到保护作用，同时也诱导CD34阳性细胞形成新的毛细血管；CD34阳性新生小血管均表达VEGF－C，LYVE－1，nestin，并形成经典连续性毛细血管；成熟时，则不再表达 VEGF－C，LYVE－1，nestin。由此说明除了VEGF－A，CD34，还有VEGF－C，LYVE－1及nestin均参与脑组织中新生连续性毛细血管的形成。

69.活化型肝星状细胞中miRNA下调gremlin1表达的调控机制研究 曾宪一 王洁 王慧 张艳琼 柳长柏 吴江锋 三峡大学医学院 肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室 宜昌443002 miRNA在控制发育进程、细胞分化、细胞凋亡以及器官发育等扮演着关键性角色，我们的前期研究确认了gremlin1与肝星状细胞（HSC）的活化成正相关，下调grenlin1可能起到抑制HSC活化的作用。本研究主要筛选HSC－T6中下调gremlin1表达的miRNA以及检测其对HSC活化相关基因α－SMA和Col1α1表达的影响。运用生物信息学软件筛选出可能下调gremlin1表达的4种保守miRNA；用荧光素酶报告基因分析法筛选出下调gremlin1表达的miRNA的结合位点；结合生物信息学软件和荧光素酶报告基因分析法双重筛选可能下调gremlin1表达 的 保 守 miRNA 有 miR－23a／b、miR－27a／b、miR－181a／b／c／d 和 miR－182；合 成 筛 选 出 的 miRNAMimic，转染 HSC－T6后确定了 miR－23b－3p、miR－27b和 miR－182能下调 HSC－T6中gremlin1的表达，miR－181b－1－3p能下 调 Collα1 的 表 达。由 此 可 见，gremlin1 通 过 调 节 BMP－7／TGF－β－Smad 信 号 通 路 对HSC－T6细胞起关键作用，抑制gremlin1的表达可抑制 HSC－T6细胞的活化，miR－27b、miR－23b－3p和 miR－182可以抑制Gremlin1和胶原蛋白的表达，进而可能对HSC的活化起着重要作用（本研究受国家自然科学基金资助项目81200307资助）。

70.CRES蛋白抗微生物谱及其机制研究 王莉 胡燕琴 徐晨 上海交通大学医学院解剖学与组织胚胎学系 上海市生殖医学重点实验室 上海200025 胱蛋白酶抑制剂相关的附睾精子发生蛋白（CRES）属于胱蛋白酶抑制剂超家族中Family 2即cyatatins的一个成员。CRES特异表达于雄性生殖系统中，并具有明显的年龄变化规律。在前期研究中，我们发现首先CRES具有抗大肠杆菌（E.coli）和溶脲脲原体（Uu）的功能，提示CRES是雄性生殖道的一个新型抗菌肽，可能具有抗微生物广谱性。首先，我们采用菌落形成单位法（CFU）检测了CRES的抗菌谱。结果显示，与培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、白念珠菌共孵育，CRES蛋白可抑制其生长，且这种效应具有明显的时间－剂量依赖性。500ng／ml的LPS刺激原代培养的附睾上皮细胞24h后，CRES的m RNA水平明显上升。此外，我们通过双向电泳，质谱分析方法发现肽酰－脯氨酰－顺反式异构酶D（Peptidyl－prolyl cis－trans isomerase D，PpiD）可能是CRES作用的关键靶标，CRES通过作用于E.coli的间周质催化蛋白PpiD，使蛋白质折叠过程受阻，不能正确形成，从而引起细菌死亡。本研究对于CRES蛋白的生物学功能有了新的发现，为临床男性生殖道感染诊断和治疗的新靶标筛选提供了实验依据。

71.褪黑素对幽门螺杆菌感染胃疾病的影响及其与CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg细胞的关系 张慧 罗建华 刘卉 宋军 陈义忠 王日雄周瑞祥 福建医科大学福州350108 胃疾病一直是困扰人们的科学难题，研究显示幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是其主要的致病因素。感染Hp可导致胃炎，严重者甚至发展为胃溃疡、胃癌。Hp的根治疗法效果不佳，且其致病机制尚不明确，因而提高机体对Hp感染的免疫效应是目前的研究热点之一。研究证实CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T（Treg）细胞具有免疫无能和免疫抑制两大功能；褪黑素具有抗肿瘤及免疫调节作用。本研究旨在探讨褪黑素对Hp感染胃疾病的影响及其与CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg细胞的关系，为Hp感染胃疾病寻找一条基于神经－内分泌－免疫网络综合治疗模式的新思路。建立Hp感染胃疾病小鼠模型，用不同浓度褪黑素干预，分别于2w、4w和6w取材，运用HE染色检测胃的病理变化；快速尿素酶检测Hp的定值程度和番红染色验证Hp；流式细胞术、Real－time PCR检测胸腺和脾Treg细胞数量和Foxp3 mRNA的表达变化。HE染色显示Hp感染后小鼠胃黏膜层和黏膜下层存在明显的炎症细胞，且呈弥散性分布；胃组织Hp培养显示针尖样菌落，番红染色可见Hp；褪黑素干预后下调胸腺Foxp3 mRNA表达量及CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg细胞数量。结果提示，褪黑素具有增强免疫的作用，并在一定程度上减轻小鼠Hp感染胃疾病的严重程度，其机制可能与下调CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg细胞数量和Foxp3 mRNA表达水平有关。

72.Sp1对不同甲基化状态下的OY－TES－1启动子的调控影响 石蕾 陈芳 张庆梅 罗彬 彭亚 谢小薰广西医科大学组织学与胚胎学教研室 南宁530021 癌－睾丸抗原（cancer－testis antigen，CTA）是一类肿瘤相关性抗原，其特点是能在各种肿瘤组织表达，而在正常组织（除睾丸、卵巢和胎盘外）基本不表达。OYTES－1是CTA家族的一员。我们的前期研究发现，肿瘤细胞OY－TES－1启动子呈高甲基化状态，且生物信息学分析显示OY－TES－1启动子上含多个转录因子Sp1结合位点，推测Sp1可能参与OY－TES－1的转录调控并与其启动子甲基化有关。本研究首先构建出4段OY－TES－1启动子荧光素酶报告载体，通过双荧光素酶活性检测筛选出相对核心启动子区域，然后进行以下实验：①分别转染过表达Sp1的细胞、Sp1表达下调的细胞及光辉霉素处理过的细胞，检测报告基因活性，从而了解外源性和内源性Sp1对OY－TES－1的调控作用；②用免疫共沉淀验证Sp1是否能与OY－TES－1启动子结合；③对OY－TES－1启动子报告基因载体进行甲基化处理，分别转染Sp1过表达细胞及Sp1表达下调的细胞，检测报告基因活性，了解OY－TES－1启动子甲基化是否会影响Sp1对OY－TES－1启动子的调控作用。研究结果发现，启动子序列－213／＋67活性最高，为相对核心启动子区域。将这段序列的报告基因载体与Sp1过表达载体共转，OY－YES－1启动子报告活性明显增强，而与Sp1－iRNA共转后，OY－TES－1启动子报告活性显著下降。为了进一步了解内源性Sp1对OY－TES－1的调控作用，我们在转染OY－TES－1启动子报告载体的细胞中加入光辉霉素，结果发现OYTES－1启动子报告活性下降，且与光辉霉素浓度有相关性。这些实验结果表明，Sp1对OY－TES－1具有调控作用，然而，具体的调控机制尚需免疫共沉淀的实验验证。OY－TES－1启动子的甲基化状态是否会影响Sp1对它的调控作用，有待进一步探究。

73.比较解剖学新视野－基于代谢网络特征的比较解剖学及其应用 彭谨 四川大学华西医学中心组织胚胎学与神经生物学教研室 成都610041 比较解剖学是利用解剖学的方法对研究不同物种之间的异同进行比较的一门古老学科。随着现代系统生物学数据库的积累，越来越多的证据表明，由于遗传物质不同造成的不同物种之间的差异并不仅仅表现在具体的解剖学形态特征上，同时也会表现在抽象的代谢网络特征上。不同物种的代谢网络的拓扑学结构特征同样也是一种可观察并且应用可视化技术进行形态比较的研究对象。利用现有的已公开的KEGG数据库、Matlab计算机语言分析平台、基于JAVA的可视化工具包，本研究对从大肠杆菌、果蝇、斑马鱼、猕猴以及人类的代谢网络特征进行了可视化分析，比较其网络分布度标准。结果表明，随着生物逐渐进化，其代谢网络平均加权度、特征向量中心度、平均聚类系数并无明显变化，但是网络直径和网络节点密度逐渐增加，Pagerank系数变得越来越大。在针对人和猕猴的碳水化合物、氨基酸、脂代谢三大代谢通路比较中发现，即使是亲缘关系较近的两种动物，在重要的代谢通路中也有部分关键代谢通路节点在是否连通方面存在不同。在人和猕猴之间糖代谢的主要区别是猕猴缺乏处理从6－磷酸葡萄糖酸盐转化为5－磷酸核酮糖这一途径。对于脂代谢，多个与长链脂肪酸合成的酶学代谢途径出现中间环节缺失，可能与猕猴对于脂肪的蓄积能力相对较低有关。对氨基酸代谢，两种动物则未见明显差异。本研究提示，利用新的网络分析方法，可以对已有的代谢通路研究进行高层次的整合，这种表现在拓扑几何学上的形态差异同样也可以看做是比较解剖学研究的一部分。

74.通过代谢物指纹图谱和代谢网络分析建立起评估脊髓损伤严重程度的定量研究模型 彭谨 四川大学华西医学中心组织胚胎学与神经生物学教研室成都610041 脊髓损伤是一种严重危害人群健康的疾病，牵涉多个生理过程，正确评估脊髓损伤的严重程度具有重要的临床意义。本研究通过建立基于NMR的创伤代谢指纹图谱的方法对SD大鼠脊髓损伤的严重程度进行分析，并利用O－PLS－DA技术对大鼠脊髓损伤后代谢指纹图谱与损伤时间及损伤的严重程度进行相关分析。本研究发现，大鼠脊髓损伤的不同评价体系（损伤严重程度、损伤时间以及损伤后BBB评分）与NMR代谢指纹图谱均有相关性。17种代谢产物与损伤后时间变化密切相关，20种物质与损伤后伤情的变化密切相关。利用判别分析发现，不同的代谢物组合可以表征不同的损伤严重程度和损伤经过的时间。偏最小二乘法拟合发现，损伤后部分代谢物的变化同大鼠损伤后BBB评分关系密切。利用KEGG数据库分析表明，催化这些代谢物产生的酶类在代谢通路网络上具有特定的聚集特性。与视黄醛代谢、鞘磷脂代谢、乙醇脱氢酶转化通路、酪氨酸代谢以及腐胺－尸胺代谢有关的10个代谢网络有关。本研究提示，利用PLS判别分析和PLS回归可以有效评估大鼠损伤后代谢物表达模式与损伤严重程度、损伤后BBB评分等的关系。

75.荧光蛋白标记技术在蛋白质定位、相互作用以及动态追踪研究中的发展和应用 彭挺 贺军 李和华中科技大学同济医学院人体解剖学系 武汉430030 2008年钱永健等3位科学家因在发现及发展绿色荧光蛋白的研究中所做出的重大贡献，获得了当年的奖诺贝尔化学奖。随着更多新型荧光蛋白的相继发现，以及对现有荧光蛋白的结构改造和修饰，一系列全新的荧光标记方法得以产生。同时随着人们对荧光蛋白发光性质的更多了解，诞生了很多新型实验技术，将微观世界中蛋白质的分布、运动、相互作用、空间构象、代谢、活性等变化现象，在活细胞水平动态地展现在人们眼前。相对于传统的荧光染色和免疫荧光技术，荧光蛋白的标记不需要固定和染色，对细胞毒性小，在活细胞动态追踪过程的应用优势尤为明显。过去我们通常采用酵母双杂交、GST－pull down、免疫共沉淀等相对间接的实验方法研究蛋白质之间的相互作用，而这些方法均不能直观动态地追踪到蛋白质相互作用的发生过程。通过将目的基因与不同颜色荧光蛋白基因的重组而构建的融合蛋白，可以在活细胞水平快速准确地追踪到两个甚至多个蛋白分子的分布变化以及相互位置关系。利用激光共聚焦显微镜对活细胞进行时间序列扫描，以及在Z轴步进扫描后的三维重建，可以很准确地判断出荧光蛋白标记分子之间的真实作用关系和分布状态，克服了由于吸附、重叠等客观因素造成的假阳性结果。在构建荧光蛋白融合分子的基础上，利用荧光漂白恢复（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）技术，可以观察到大颗粒物质在亚细胞水平的运动趋势。在"分割－重组"荧光蛋白分子的基础上而实现的双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）分析技术，不但可以直观地反应蛋白质之间的相互作用，还可以检测到结构域之间的相互作用关系。通过将CFP、YFP与目的结构域实现线性融合，利用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）技术我们可以深入分子内部，量化地检测到结构域之间的结合变化过程，以及该相互作用受到外界可变因素的影响情况。近年来在改变荧光蛋白的发光组合、分子结构和理化性质上科学家们也进行了大量的尝试。2007年美国科学家通过随机改变不同荧光蛋白在神经元中的表达组合而发明的脑虹技术（brainbow technique），让我们可以在微小的空间中区分哪怕是来自相邻两根轴突间的差别。在细胞周期的研究中，过去只能通过流式细胞技术或者对细胞周期蛋白水平的检测来进行评估，2008年日本科学家开发出荧光泛素化细胞周期指示剂（fluorescent ubiquitination－based cell－cycle indicator，FUCCI），通过将 RFP、GFP分别与不同的细胞周期因子融合，利用周期蛋白的代谢降解机制，动态观察细胞的荧光变化进而直观地判断出单个细胞所处的时期，以及细胞群体在周期中所占的比例。利用光激活型绿色荧光蛋白（photoactivatible－GFP，PA－GFP）的发光特点，我们除了可以观察到定量的发光蛋白在空间分布上的变化，还可以根据时间轴上荧光值的变化判断出靶蛋白的代谢趋势。在胞内代谢的研究领域，人们利用RFP、GFP在酸性条件下的稳定性差异，通过与LC3分子的线性融合，直观地检测到了细胞自噬及溶酶体系统的激活过程。利用GFP与蛋白酶体降解信号CL－1的直接融合而构建的GFP－U蛋白，可以直观地展示细胞内蛋白酶体途径的功能状态。在对细胞的囊泡运输及分泌过程的研究中，通过普通荧光蛋白对特异性分泌蛋白的标记，可以追踪到胞内特异性囊泡的定位、分选和运输过程；而通过p H敏感型荧光蛋白突变体的应用，可以让我们动态观察囊泡和靶膜的融合瞬间及释放过程。

76.肿瘤细胞3维培养模型的体外构建及其侵袭与转移特性 张秀珍 刘伟 徐红 侯亮 路英进 李眀赫陈佩佩 郭亚楠 冯迪 王秀丽 大连医科大学组织学与胚胎学教研室 大连116027 肿瘤侵袭与转移是肿瘤的恶性生物学性状之一，也是导致肿瘤患者复发及死亡的主要原因，但其发生、发展的具体机制仍远未被揭示。新近研究表明肿瘤侵袭与转移不仅取决于肿瘤细胞自身的生物学特性有关，而且还与肿瘤所处的微环境密切相关。由此，建立可体外模拟肿瘤微环境的3维肿瘤培养模型将可能成为研究并揭示肿瘤侵袭与转移机制的重要手段。本实验采用组织工程技术手段，以胶原蛋白为支架材料体外尝试构建人卵巢癌细胞3维培养模型，并分别采用CCK8检测、活性染色、HE染色以及整封染色等方法对所构建模型进行形态学评价；同时分别通过划痕实验、Transwell实验、明胶酶谱实验、实时定量PCR以及Western blot方法对所构建的模型进行基于基因、蛋白以及细胞水平的功能活性评价。结果表明，卵巢癌细胞在3D胶原支架中具有良好的增殖活性，且多以细胞团形态散在均匀分布；HE染色显示其细胞彼此聚集成团，无中心坏死发生。对比平面培养体系，卵巢癌细胞在3D培养体系内的增殖曲线以及生长形态均差异显著。明胶酶谱法检测结果显示，对比平面培养体系，3D培养体系内卵巢癌细胞的MMP－2，MMP－9活性显著增强。此外，3D培养条件下肿瘤细胞穿过Transwell小室的数目显著增加；基因蛋白水平检测与肿瘤侵袭与转移的相关标记物基因（MMPs家族，VEGF、Vimentin、E－cadherin、β－cadherin、Intergin等）发现，3维培养可显著提高卵巢癌细胞内上述基因的转录表达水平。综上，我们已成功构建基于3维培养体系的卵巢癌细胞侵袭与转移的体外研究模型，为深入阐明肿瘤微环境与侵袭转移之间的作用及具体机制研究提供有效的研究工具（本研究受国家自然科学基金面上项目31470952资助）。

77.三维肿瘤微环境的体外构建与肿瘤组织工程 徐红 刘伟 张秀珍 陈佩佩 冯迪 郭亚楠 王秀丽 大连医科大学组织胚胎学教研室 大连116044 组织微环境是调控细胞命运的关键因素。应用再生医学技术体外构建可模拟体内微环境的3维细胞培养模型可为发育生物学、病理学以及药理学提供有力的研究工具。我们在前期工作中主要围绕3D微环境和组织化模型的建立、应用及机制探索，应用3维共培养技术成功构建其形态、功能及药理活性均与在体乳腺组织高度相似的人乳腺3维组织化模型，为探讨微环境相互作用及其与乳腺发育与病理转化的关系，并应用于乳腺肿瘤的发生、转移、药物乳腺毒性及药效筛选和评价提供了理想的研究体系。在此基础上，我们进一步通过肿瘤细胞－基质细胞－细胞外基质支架共培养技术体外模拟构建肿瘤组织微环境，部分再现肿瘤细胞在体的生物学特性包括其增殖、耐药，侵袭与转移等，并结合分子细胞生物学及组织学技术分别在分子、细胞以及组织水平对其进行表征和评价。目前我们已在构建多药耐药肿瘤3维培养模型及体外3维培养条件下模拟肿瘤侵袭与转移方面取得初步进展。该研究工作将为深入阐释肿瘤微环境与肿瘤生物学特性的相关性提供新体系，而且也将为抗肿瘤药物的研发提供理想的筛选与评价工具（本研究受国家自然科学基金面上项目31470952资助）。

78.多药耐药乳腺癌细胞3维培养模型的体外构建与评价 刘伟 张秀珍 徐红 侯亮 路英进 陈佩佩 郭亚楠 李博文 王秀丽 大连医科大学组织胚胎学教研室 大连116041 新近研究表明，肿瘤微环境与肿瘤细胞多药耐药（MDR）的发生、发展密切相关。受限于传统的平面培养体系在模拟肿瘤微环境方面的巨大缺陷，近年来有关肿瘤3维（3D）模型体外构建的研究倍受关注。本实验旨在体外构建MDR乳腺癌3D培养模型，以期为乳腺癌MDR产生机制及其逆转的研究提供有力的研究工具。实验以MDR细胞株MCF－7／A及敏感株MCF－7／S为细胞模型，对照2D培养组，分别考察3D培养组内（胶原为培养支架）细胞的形态、增殖（CCK－8检测）、活性（活性染色，HE染色）；同时检测各培养组内细胞对阿霉素、紫杉醇、卡铂、5－氟尿嘧啶的药物敏感性，通过实时定量PCR检测 MDR相关基因p－gp、mrp－2、GST－π、Her－2、TopoⅡ m RNA的表达水平，并采用 Western blot及免疫荧光检测耐药蛋白的表达。实验结果表明，3D培养组内 MCF－7／S和MCF－7／A呈聚团生长，细胞增殖及活性良好。对比2D培养组，3D培养组细胞对各模式化疗药物的敏感性（IC50）显著降低，且细胞内阿霉素药物浓度明显升高。此外，3D培养组内细胞均显著高表达p－gp、mrp2、GST－π等耐药相关基因，其中MCF－7／A细胞的p－gp表达水平增强48倍。与之相一致，Western blot检测结果表明P－gp蛋白表达水平3D较2D培养组显著升高。本研究中我们已成功构建具有MDR表型及功能的乳腺癌3D培养模型。该模型将可能在模拟在体肿瘤微环境，以深入阐明MDR发生机制并寻求克服MDR的靶向性治疗中发挥巨大潜能（本研究受国家自然科学基金面上项目31470952资助）。

79.发生发育小鼠肾石蜡切片制作方法 顾玲 丛敬 林庚 张婕 田莹莹 翟效月 中国医科大学组织与胚胎学教研室沈阳110122 为满足研究发生发育小鼠肾微细结构形态发生的需要，本实验室探索出针对不同发生发育时间点肾组织石蜡块制作的合适条件。4%多聚甲醛浸泡固定（胎鼠全肾）或心脏灌流固定（从生后5天以后的鼠）后，取全肾或肾组织块，入同种固定液续固定，逐级乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡及包埋。石蜡切片5μm厚，脱蜡、逐级乙醇梯度水化，以苏木素或苏木素－伊红染色后的形态观察作为最佳方案的筛选依据。反复实验后的各时间点肾组织石蜡块硬度适宜，较易得到连续的石蜡切片。经形态学染色后，低倍光镜下（20×）可见，肾组织被膜完整，皮髓质各区及各带结构紧致而清晰，并保持在原位；肾小管及血管管腔开放；高倍光镜下（40×），发生发育肾组织中的成熟的细胞具有成年小鼠肾各类型细胞的形态结构特征，而处于发育阶段的未成熟细胞具有较为合理的核浆比例，核圆且核仁清晰。实验证明，随着小鼠发生发育，肾组织梯度乙醇脱水时间逐渐增加，透明时间逐渐延长，包埋石蜡的硬度从软到硬，染色时间也相应变化。

80.全层铺片技术在消化管Cajal间质细胞研究中的应用 孙海梅 杨姝 张国权 周德山 首都医科大学组织学与胚胎学教研室 北京100069 消化管壁内的Cajal间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICC）是胃肠起搏细胞，并具有传导神经冲动的作用。多种胃肠动力障碍疾病与ICC的分布和形态异常有关。直观、全面地观察ICC在消化管壁的分布和形态变化，对于深入研究ICC与胃肠运动相关疾病的关系具有重要的意义。消化管壁全层铺片技术结合ICC特异性蛋白C－kit免疫荧光染色可以弥补冰冻切片或石蜡切片在显示ICC实验中的不足，更好地显示消化管壁ICC的分布和形态结构。本实验选择成年BALB／c小鼠，雌雄不限，实验前将动物禁食24 h，1%戊巴比妥钠麻醉动物后处死，快速取出完整胃、部分小肠和结肠，置于预冷的0.01mol／L PBS中，反复冲洗、去除腔内容物。结扎胃的贲门端或者肠管的一端，用注射器将预冷的丙酮或4%多聚甲醛固定液注入胃或肠腔内，使其维持最大充盈状态，再结扎另一端。置入相同固定液中固定24 h。制作全层铺片前去除结扎部分，将胃沿小弯侧剪开或将肠沿肠系膜缘剪开，取0.5 cm×0.5 cm大小的样本，置于平皿中，黏膜面向上。在解剖显微镜下，用进口钟表镊依次将黏膜层和黏膜下层去除，再将环行平滑肌层、纵行平滑肌和浆膜层分离，剪成适当大小的标本块，置于预冷的0.01mol／L PBS中。按常规免疫荧光染色法对铺片进行C－kit染色，荧光显微镜下观察。结果显示，采用消化管壁全层铺片行免疫荧光c－Kit染色可以更好地显示ICC的完整形态和分布，对于深入研究ICC与胃肠运动相关疾病的关系，具有重要的意义。本技术的关键点：①选择丙酮固定液效果优于4%多聚甲醛固定液；②对消化器官要进行充分地充盈固定，这样使腔壁的肌层变得很薄，易于染色且成片后效果较好；③在胃、小肠和结肠制备铺片的难易程度有所差异，同一器官的不同部位制备铺片也有所区别。

81.碘化丙啶PI可对尼氏体进行标记从而用于神经元特异性染色和计数 牛俊飞 曾美琪 冯先玲 陈献雄 沙鸥 深圳大学医学部医学系 深圳518060 碘化丙啶 （Propidium iodide，PI）是一种实验室中常用的核酸染料，能够与RNA和DNA结合。PI的最大激发光波长为535nm，最大发射光的波长为617nm，因此其在激发条件下呈现红色荧光。PI常和凋亡早期标记物Annexin V共同使用，以对凋亡细胞进行鉴定、分析，而在普通的形态学染色实验中PI常作为细胞核的衬染试剂。本实验主要是在大鼠神经组织中比较PI和尼氏体染料的染色效果，并提出对神经元尼氏体选择性标记的新方法。我们将正常的SD大鼠的不同组织，包括三叉神经节、背根神经节、脊髓、肝脏和小肠的冰冻切片和石蜡切片分别进行PI和苏木素－伊红（HE）染色；部分切片在进行上述染色前，分别进行DNA酶或RNA酶的处理，另一部分切片则进行PI和尼氏荧光燃料的双重染色。这些切片通过普通荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜分别进行观察和分析。结果显示，所有神经组织的神经元细胞质具有很强的颗粒状PI染色信号，而神经元细胞核染色强度较弱；相反，神经胶质细胞的细胞核呈现PI染色强阳性，而胶质细胞的胞浆染色不明显。但是，在使用RNA酶预处理之后，神经元细胞质的PI信号消失。此外，在神经元细胞质中的PI信号与尼氏体染料的信号具有一致性。当神经组织用DNA酶处理之后，PI信号只出现在神经元细胞质中，但并不出现在神经胶质细胞中。因此，我们的研究表明，当神经元的特异性标记物不易获得时，PI可以作为一种经济快捷的神经元标记替代物进行神经元标记和计数（本研究受国家自然科学基金NSFC 81171154资助）。

82.教学切片Ehrlich苏木精－伊红的染色质控要求 赵荧张栩胤 北京大学医学部人体解剖学与组织胚胎学系 北京100191 制备一张优质的教学切片，更多的关注于石蜡切片制备的质量，如标本新鲜性和固定质量、标本后续处理是否恰当以及切片制备的质量等。然而，HE染色质量，即组织细胞结构清晰，染色透明度高，核浆颜色分明，红蓝色彩匹配适度，也具有同等的重要性。首先，Ehrlich苏木精质量决定着细胞核染色质量。不同配制方法的主要差别在硫酸铝钾的计量上。硫酸铝钾的铝离子与氧化型苏木精（苏木红）螯合生成蓝紫色的铝－苏木红色淀（正电荷），与细胞核内脱氧核糖核酸的磷酸基（负电荷）结合而完成染色的。色淀的数量决定着苏木精染色效力，硫酸铝钾过饱和状态可提高铝－苏木红色淀的结合率。自然氧化最适合Ehrlich苏木精，阳光照射、环境温度、通风性、容器空余空间以及搅动染液频率均可增强其氧化进程。对组织切片染色效果的检验是确定苏木精成熟与否的唯一标准。第二，Ehrlich苏木精属退行性染色，多染多退是其染色特点。分化液推荐使用0.5%盐酸酒精（70%），酸浓度较低，能更好地把控分化程度，显微镜镜检以细胞核染色质清晰为蓝色、细胞质及其他成分为淡淡的亮灰色为好。若镜检呈现胞核颜色过深或过浅都会影响红蓝颜色的匹配度。另外，对粘蛋白（软骨粘多糖）显示以及酸性脱钙液处理的骨组织染色细节显示更为Ehrlich苏木精的染色特点。第三，伊红染色与苏木精颜色的相匹配是HE染色的最佳效果。HE染色中，苏木精染色是基调，伊红染色是通过其红色到粉色的颜色渐变与苏木精相匹配，可区分显示不同类型的细胞胞质以及不同类型纤维和基质。在伊红最佳p H3－4.5范围染色，能增强其染色性和色彩锐度。第四，脱蜡和水合、脱水和透明两个过程对染色的重要性不可忽视。前者可能导致染色不鲜艳、色浅；后者脱水不彻底，导致透明不完全而影响切片的清晰性和透明度。第五，固定剂与HE染色的匹配性。Susa、Zenke、Helly固定剂与Ehrlich苏木精－伊红（伊红Y，1% 水溶液）染色搭配是最佳，为组织细胞着色提供鲜亮的染色效果，即细胞核染色质呈现强烈着色性，对组织结构、细胞胞质及嗜酸性颗粒产生鲜艳的红色和粉红色。

83.肥大细胞甲苯胺蓝－PAS染色改良法 张祥令 苏敏 黄悦 洪艳 许爱萍 贵州医科大组织学与胚胎学教研室 贵阳550004 肥大细胞是疏松结缔组织中常见的细胞，其胞质中充满粗大的嗜碱性颗粒，有异染性，颗粒易溶于水，颗粒内含有肝素、组胺和嗜碱性粒细胞趋化因子等 。肥大细胞染色方法种类很多，常用甲苯胺蓝染色，但普通的甲苯胺蓝染色对于该颗粒的显示不是十分明显，对比度不强。为了满足教学和科研的需要，我们经过反复实验，筛选出甲苯胺蓝－PAS染色法。该方法能够快速染色，且特异性强，效果稳定，并能将肥大细胞的典型形态结构清楚显示，为肥大细胞的研究提供了一种简便可行的新的染色方法。取材时采用拉断脊柱法处死小鼠，取皮下组织平铺于载玻片上，风干后经AFA固定液固定40min；进行甲苯胺蓝－PAS染色，其结果肥大细胞铺片沿着小血管3～5成群分布，结构典型清晰，细胞形态完整，胞质中充满粗大的异染性紫红色颗粒，颗粒明显，核不着色。在制作肥大细胞时，可用皮下组织或取肠系膜铺片，铺片制作技术难点主要在于是否得到平展的膜组织；因此组织铺片时，不能太用力拉，如果用力太大，细胞被拉破坏；如果拉力不够，铺片太厚，组织不平，细胞被结缔组织覆盖，不利于标本的镜下观察，也不利于组织封片。固定时应适当延长固定时间，在制作过程中为了防止其他杂质污染标本，固定前要用95%酒精充分洗去皮下组织表面的血液和杂质。肥大细胞的固定，使用AFA固定液，对肥大细胞的颗粒和核固定较佳，颗粒更清晰可见。作为教学切片使用的标本要求较高，肥大细胞形态结构典型，胞质内嗜碱性颗粒清晰。

84.卵巢癌SKOV3、SKOV3／DDP细胞中胞质及线粒体钙离子含量的激光共聚焦显微镜术检测 刘师兵1于洋1李松岩1田洪艳2李质馨2徐冶1吉林医药学院1医学科研实验室；2组胚教研室 吉林132013为了检测卵巢癌SKOV3（顺铂敏感）和SKOV3／DDP（顺铂耐受）细胞对钙离子激动剂（ATP、thapsigargin）反应的差异，我们采用钙离子敏感的荧光探针Fluor－4／AM（检测胞质钙）和Rhod－2／AM（检测线粒体钙）进行检测。细胞提前一天铺24孔板，钙离子探针负载完成后，将24孔板放置于共聚焦显微镜载物台上，加药前采集图像1－2 min，再于采图区加入药物50μl，然后检测钙离子含量变化。结果发现，SKOV3细胞在加入ATP（200μmol／L）后，胞质钙离子含量急剧上升然后缓慢下降，在加药约180s后恢复到基础水平，而线粒体钙离子含量在加药后出现快速升高，在加药约20 s后达到峰值，并持续处于高水平；SKOV3／DDP细胞在加入ATP后，胞质钙离子表现为大幅度剧烈震荡，持续约160 s后恢复到基础水平，而其线粒体钙离子含量在加药后出现短暂小幅升高，很快恢复，与加药前相比变化不明显。我们采用毒胡萝卜內脂（thapsigargin，TG）作用于两种细胞，结果发现，在SKOV3细胞，加入TG（10μmol／L）后，胞质钙离子迅速出现上升峰（持续约5 min），恢复至基础水平然后持续增加，而线粒体钙离子在加药后出现快速剧烈的上升峰（持续约10 min），然后恢复至基础水平并维持60 min后，逐渐持续升高；而在SKOV3／DDP细胞，加入TG后胞质钙离子出现快速剧烈上升峰（持续约3 min），然后恢复至基础水平，表现为低幅波动，而其线粒体钙离子在加药后出现低幅周期性震荡，没有明显升高。以上结果表明，对顺铂敏感性差异显著的两种卵巢癌细胞SKOV3，其对钙离子激动剂的反应性存在显著差异，顺铂敏感的SKOV3细胞对钙离子激动剂敏感，其胞质和线粒体钙离子随着药物作用而明显升高；而顺铂耐受的SKOV3／DDP细胞对钙离子激动剂不敏感，其胞质和线粒体钙离子在药物作用后能够很快恢复至基础水平（本研究受国家自然科学基金面上项目81372793资助）。

85.常规石蜡制片中脱水透明流程的改进及其应用 郑翔 周雪 四川大学华西基础医学与法医学院基础医学专业实验室 成都610041 常规石蜡制片是组织学与病理学的核心技术之一，目前乙醇－二甲苯、乙醇－三氯甲烷或乙醇－丁醇流程为标本脱水透明所采用的主要流程。标本易硬化和严重收缩是乙醇－二甲苯流程的缺点，而后两种方法耗时较长，且标本仍有明显收缩。在70%乙醇浸透后，改用70%－四氢呋喃1：1（v／v）液和2份纯四氢呋喃依次脱水，然后常规浸蜡。对于厚度不超过5 mm的标本，各步脱水时间约为30 min。改进后，标本无收缩，镜下结构真实、精细；即使浸泡过夜也不会出现过度硬化，切片操作难度小。脱水透明全过程耗时一般不超过4 h，远快于乙醇－二甲苯流程。四氢呋喃毒性很低，对人体危害小；其挥发性强，易于从石蜡中清除，提高了包埋蜡的回收效率。在免疫染色、原位杂交等实验中，乙醇－四氢呋喃流程的效果与传统方法相当，不会影响检测结果。新的乙醇－四氢呋喃流程应用于研究与教学，可大大提升质量与效率。比如，采用新流程后，快速制作整齐美观的阵列片成为可能。阵列片一方面可用于教学和考试，另一方面也可制作科研对照切片，确保染色结果的可比性和准确性。又如，绘制脑定位图谱时某些动物大尺寸的脑标本难以进行石蜡切片；如果分割包埋，因标本收缩会造成极大的定位误差。乙醇－四氢呋喃流程中标本不收缩，可分割包埋，切片连续性好，定位尺寸准确。此外，借助摇床可将脱水透明流程的耗时缩短到90 min以内，有助于开展显微制片技术课程的教学。综上，乙醇－四氢呋喃脱水流程具有无收缩、不硬化、速度快等显著优势，可取代现有流程应用到石蜡显微制片的日常工作中。

86.虚拟切片和数码互动在组织学中的应用 冯先玲 沙鸥 王晓梅 刘健华 深圳大学医学部基础医学系 深圳518060 传统的组织学实验教学主要是学生利用显微镜观察玻璃切片，而这种教学模式存在诸多弊端，如切片制作繁琐、成本高、易破损、易褪色以及玻璃切片观察对显微镜的依赖，使得学生学习受到空间和时间的限制。随着信息技术和数字化的发展，探索玻璃切片转换为虚拟数字切片，建立数字切片库，成为当前组织学实验教学改革的主要内容。深圳大学医学部初步建成了虚拟显微镜数字切片库及远程访问系统，在本院临床医学专业学生中采用了传统玻璃切片结合数字切片观察的实验教学模式，并联合应用显微镜数码互动系统和远程访问系统进行授课。课程结束后，对参与该实验教学模式教学的学生进行问卷调查，结果显示，大多数学生都认为虚拟显微镜数字切片与传统玻璃切片相比有一定的优越性。数字切片高效仿真模拟显微镜功能，图像清晰且可以根据需要放大缩小，更重要的是学生可以借助网络远程访问数字切片库，打破了实验教学在时间和空间的局限性，使学生在有效的时间内获得更多的知识。与此同时，数码互动系统所展现出的便捷、直观，以及强大的示教和双向沟通能力，很大程度上提高了形态学实验教学的效果，并被师生广泛的认可和接受，目前已广泛应用于形态学实验教学中。数字切片与显微镜数码互动联合应用于传统的组织学实验教学中，实现了数字化显微实验互动教学和远程服务，提高了教学效果，得到了广大师生肯定和支持。但现阶段，数字切片库仍在不断地完善中，数字切片完全取代玻璃切片进行教学的条件尚不成熟。在不久的将来，数字切片将克服现阶段的不足，并将逐渐广泛的应用到形态学实验教学中。

87.基于网络的虚拟显微镜系统辅助教学平台的应用 田衍平 李成仁 刘运来 秦茂林 肖岚 李红丽第三军医大学基础医学部组织学与胚胎学教研室 发育生物学教研室 重庆400038 由于学生的数量大，师资短缺和教学设备的限制，国内组织学课程的教学常使用传统的课件讲授、传统教材和光学显微镜的方式进行教学。该方式在传授知识方面是一种很好的方法，但不利于学生主动学习和问题解决能力的培养。研究显示，基于网络的虚拟显微镜（virtual microscopy，VM）系统是一种有效的教育策略。本研究描述我校VM系统在本科生组织学与胚胎学教学中的应用，并评估该策略促进学生主动学习和问题解决能力的效果。以我校229名大学二年级学生为研究对象，分成VM组和光学显微镜组（light microscopy，LM）两组进行教学。VM组使用虚拟显微镜系统进行教学，通过案例分析，自主学习并进行学生间讨论，线上线下与教员交流等形式进行学习，LM组采用传统教学方式进行。教学完成后对学习结果进行分析。结果显示，在基础知识得分方面两组没有显著性差异；然而在案例分析题和组织结构的鉴别方面，VM组平均得分显著高于LM组。问卷调查结果显示，在使用VM系统学习过程中，学生的学习效率和问题解决的能力得到显著提高。此外，学生在课外资源获取能力，批判性思维和自信心方面也得到很好的锻炼。因此，基于网络的虚拟显微镜系统作为一个有效的辅助教学平台，在组织学与胚胎学教学的应用能促进学生主动学习和问题解决的能力。

88.组织学数字化教学与自主学习平台建设 刘向前 王小丽 李和 华中科技大学同济医学院基础医学院组织学与胚胎学教研室 武汉430030 随着计算机和网络技术的快速发展，各种数字化教学资源不断涌现。数字切片，也称虚拟显微镜或虚拟切片，是上世纪末才逐渐发展起来的一种新技术，近年已广泛应用于病理诊断、形态学教学与医学研究等方面。我校于2008年就建设了数字切片库用于各形态学科，特别是医学组织学的实验课教学，取得了良好的效果。为了进一步深化教学改革，方便学生自主学习和开展"翻转课堂"教学，我们与山东易创电子有限公司合作，更新完善了组织学数字切片网络平台，并新增了课件管理、考试系统和统计分析等栏目。课件管理将组织学基本理论知识与数字切片实验指导教程集于一体，一方面，教师可将其用作组织学理论课与实验课的教学课件；另一方面，可以避免学生在学习过程常常将理论课与实验课相脱节的错误学习方式，从而加深对组织学各知识点的理解和掌握，提高学习效率。考试系统包括题库建设、试卷管理、考试管理和成绩统计等，除了用于学生对组织学理论与实验知识的自我测试，从而查漏补缺，也可用于教师随时掌握学生的学习情况，进行及时辅导，还可用于教师进行快速的出题组卷。此外，栏目中还设置了老师问答、内容讨论等师生互动部分，从而极大地拓展了数字切片网络平台的教学功能。

89.专业化社会化的网络学科导航平台为医学教育体系保驾 林冬静1徐冶2田洪艳1李质馨1刘忠平1窦肇华1吉林医药学院1组织学与胚胎学教研室；2基础实验室中心 吉林132013 《中国医学教育改革和发展纲要》明确指出我国的医学教育事业初步建立了包括学校基础教育、毕业后教育、继续教育的连续统一的医学教育体系。目前，医学教育的规模、质量、效益有了明显提高。为了更加有效的改革医学教育专业口径过窄、素质教育薄弱、教学模式单一、教学内容陈旧、教学方法过死等状况，高等医学教育实施了一系列改革计划，注重医学生基础理论、基本知识、基本技能的培养，促进了医学生在知识、能力、综合素质和创新思维等方面的发展，使医学教育质量稳步提高。本文通过分析和整合国内、外专业化社会化的网络学科导航，其中涵盖国家精品课程共享服务信息平台、医药生命科学专业网站、专业性科技工作者的学术团体三大领域，以及利用这些信息化设备进行教学的便携式电子书包，为各体系人员的学习提供一个分享、下载的拓宽资源。借助整合这些信息资源，辅以培养学生和相关从业人员的自学能力、获取知识的能力和创新能力，其目的性强、针对性强、省时省力，达到事半功倍的教学功能。

90.中山大学组织学与胚胎学慕课教学平台的建立及实践 冯英 丁英 曾园山 中山大学中山医学院组胚教研室 广州510080 在网络时代，知识的学习和传播方式本身正在发生变化。而现有的知识生产和传播媒介（如大学、媒体等）从制度体系上不能完全适应这种变革，因而导致了慕课传媒课堂的渴求现象。慕课是顺应这一大变革而产生的动态知识建构模式，是更多元的知识传播途径和更人性化学习过程，一定程度上促进了知识传播及收到网络时代下学生的欢迎。中山大学《组织学与胚胎学》课程通过搭建慕课教学平台，以最小的成本、最快的速度，建起功能完备、有创新研究意义、具备中国特色的新型教学平台。该平台的建立从一定程度上克服了传统教学来源不一、难度参差及内容重叠、缺乏连贯的缺点，使学生可以通过注册"在线云课堂"加入自己感兴趣的课程，制定自己的学习计划，然后进行在线学习、练习、讨论和自我测试，从而达到提升学生的学习兴趣、师生互动和个性化学习及终生学习的良好作用，并对教学观念及方法、学习方法的改变产生巨大影响，而且提升了各学科整体的教学水平，并能与其他学校、其他专业进行教学资源的共享。在此基础上，我们将继续完善并推广本学科慕课教学平台，充分发挥其大规模、开放、在线课程的特征，结合本专业本身教学特点，解决实际教学问题，从而进一步提升我们的专业教学效果，为组织学与胚胎学这门基础课程的教学改革及实践做出应有的贡献，充分调动广大师生的教学及学习积极性。

91.人体组织学数字化切片视听课程的构建及探索 冯树梅1廖礼彬1秦纹1李甜1郭琼1李艳1白生宾1海米提1李秀梅1夏潮涌2钟近洁11新疆医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室 乌鲁木齐8300112暨南大学医学院组织学与胚胎学教研室 广州510632 为在互联网时代全面提升教学水平，拓展多元化学习方式，建立全新的数字化教学模式。我教研室以自制人体组织学石蜡切片为基础，建立了全套人体组织学全景数字化扫描切片库，并通过数字化切片的无缝观察，同步人声讲解，视频录播、图像编辑、字幕显示等技术方法，制作出人体组织学数字化切片视听课程。该视听课程上传至互联网后，可提供在不同倍数下数字化切片浏览，并配有专业教师讲解及字幕显示，可供学生在课前课后随机进行学习，实现虚拟化教学和移动学习，同时人体组织学数字化视听课程是对传统实验教学的有益补充，是对数字化切片的进一步提升，也是对数字化教学模式的大胆尝试。

92.创新型教学模式在人体发生学教学中的尝试 吴岩 赛恒 李斌 刘晓峰 吴迪 吕鹏 张雪梅 内蒙古医科大学组织胚胎学教研室 呼和浩特010059 本研究尝试将“翻转课堂”和CBL教学模式引入人体发生学教学，探讨该方法在研究生选修课教学实践中的优势。选择2014级选修人体发生学课程的研究生作为研究对象，应用“翻转课堂”结合CBL教学模式展开教学。教学前进行充分的准备工作；课堂上教师通过结合微视频等进行知识回顾，通过现场答疑和病例讨论对重点问题分层次多形式讲解；在教学过程中随时与学生沟通，征求学生意见，课程结束后，对学生进行问卷调查并对结果进行统计分析。由于将教学安排重新规划，将知识传递放在课前完成，学生能够自己掌握学习内容和学习进度。在课堂内大量应用短小视频，增加了师生互动和讨论，争取最大程度将学生普遍反应的难点问题来进行知识的建构和内化。老师把课堂让位于学生，由课堂内容的传授者变为学习过程的指导者与促进者，学生则由被动接受的听众转变为积极主动的参与者。通过联系临床实际的案例及与其密切联系的一系列提问，既联系教学内容又具有启发性和针对性，学生的注意力能迅速集中到课堂内容上，使学生作为课堂的主体能积极主动参与到案例问题的分析讨论之中，形成自主性研究问题的思维，进而推进课堂研讨的氛围，同时又锻炼和提高了学生解决实际问题和综合分析问题能力。学生对于知识的理解和教学效果的认可优于传统教学。研究生人体发生学教学中"翻转课堂"结合CBL的教学模式被证明是一种深受学生欢迎、取得显著教学效果的一次成功创新尝试可以在本科教学中加以推广。

93.胚胎学教学内容的改进 马征来 暨南大学医学院组织学与胚胎学教研室广州510632 目前医学院校组织学与胚胎学教育过程中所存在一些不足，教学内容枯燥乏味，仅仅简略地用一些破旧的教具讲述三胚层分化、颜面部的分化、模式图化了的心脏外形变化以及各腔室的分隔，不形象、不具体、不生动；内容枯燥乏味，气氛缺乏活力，学生厌学老师厌讲。为了使胚胎学教学内容变的丰富，生动，所以改变胚胎学教学的这一现状迫在眉睫。通过对传统的骨骼染色方法进行创新改进，我们首创"水晶骨骼艺术"，运用独特的方法对骨骼染色后可使骨骼达到裸眼4D－Xray的视觉效果，让观赏者既有很强视觉冲击力，又可以达到探索、认识和感受大自然的目的。通过骨骼染色，一改传统的模式图的教学模式，可以清晰的显示胚胎时期软骨内成骨、膜内成骨、以及混合成骨方式；同时意外的收获是：发现胚胎时期心脏流出道的观察方法（以鸡胚为模型），即不同时期的胚胎95%酒精固定过夜，去皮稍稍去内脏，95%酒精继续浸泡4天，1%氢氧化钾软化至半透明，随后梯度甘油透明，心脏的流出道可以清晰的展示出来。如此既可以用于心血管发生的教学也可以用于科学研究。目前我们已经创作出一些具有代表意义的作品，如骨骼发生、心脏发生、眼睛发生、神经发生的等，下一步计划做更多的作品，丰富胚胎学教学内容，提高教学质量，充分激发学生的学习积极性。

94.组织学与胚胎学实验教学中融入生理学知识的TBL教学模式的探索 张标 陈东 叶晓霞 马瑗锾衣艳梅 吴民华 广东医学院组织学与胚胎学教研室 湛江524023 传统的组织学与胚胎学实验教学融入生理学知识采用以授课为基础的学习（lecture－based learning，LBL）模式，在此过程中，学生处于被动接受知识，按照实验指导机械地观察切片中的形态结构，没有认真思考结构和功能的联系，因此教学效果并不理想。以团队为基础的学习（team－based learning，TBL）是以学生为主体，以团队为基础，提倡学生自主学习的新型教学模式。能否采用TBL教学模式提高组织学与胚胎学的实验教学的效果呢？广东医学院组织学与胚胎学教研室在临床医学专业进行了组织学与胚胎学实验教学中应用TBL教学模式融入生理学知识的探索。实践证明，与传统的LBL教学模式相比较，TBL教学模式极大激发了学生的学习兴趣，变被动学习到主动探究，提高了学生学习的主动性和积极性，增强了学生灵活运用理论知识分析问题和解决问题的能力，学生的综合素质有了一定的提升。对采用TBL教学模式的学生问卷调查分析，100%的学生表示喜欢该教学模式；90.3%的学生认为组织学与胚胎学实验教学融入生理学知识很好；93.5%的学生认为通过自主学习、团队合作及师生互动提高了自身分析和解决问题的能力。通过统一命题、统一考试、统一阅卷，实验课考试成绩TBL教学班及格率100%，平均成绩85.8分；LBL教学班及格率为90.2%，平均成绩为80.0分。期末总评成绩，TBL教学班及格率100%，平均成绩72.4分；LBL教学班及格率为81.3%，平均成绩为68.9分。由此可见，采用TBL教学模式，将结构和功能相结合，有利于提高组织学与胚胎学的教学效果。

95.组织学与胚胎学实验课创新性教学模式的探讨 吴迪吴岩李斌赛恒刘晓峰 内蒙古医科大学组织胚胎学教研室 呼和浩特010059 组织学与胚胎学知识结构涉及平面与立体、局部与整体相结合的特点，实验课成为组织学与胚胎学教学的必要环节。改进实验课教学方法，激活学生的思维能力，培养学生的观察能力，增强学生的动手能力，是组织学与胚胎学教学一直在探索的方向。本研究对象为2014级本科口腔班29人。授课方式由教师提前一周将实验内容发给学生，要求学生完成对相关理论知识的讨论和学习，并针对实验课观察切片内容制成PPT。实验课上，最初15分钟由教师提出学习要求、提出问题，之后由学生报告准备的PPT，教师进行点评。然后，学生自行观察切片并绘制光镜图，并可利用现代教学互动平台拍摄收集自制组织学图谱。最后，教师根据学生的学习情况，再提出问题，引导学生思考或补充讲解，针对实验课内容进行总结分析。通过应用这种教学模式，调动了学生的学习主动性和自觉性，增强了学生学习兴趣，学生的学习能力普遍提高。这种教学模式以学生为主体，课下学生参与备课，课上学习环节以讨论交流为主，教师引导、鼓励学生主动提问和积极参与，不仅有利于学生对知识的深化掌握，也有助学生语言表达能力、交流能力和思考能力的提高（本研究受内蒙古自治区高等教育科学研究"十二五"规划立项课题NGJGH2014034资助）。

96.2013级临床本科组织学与胚胎学课程全英教学体会 陈鹳霏1冯先玲1马保华2管又飞1谢苗1范新民1马晓松1沙鸥11深圳大学医学部医学系 深圳518000，2山东大学医学院组织胚胎学教研室 济南250012 全英教学是当今中国高校面对时代发展而产生的新的教学模式，是势在必行的重要措施。在医学教育中推行全英教学有利于培养具有国际竞争力的高级医学人才。深圳大学医学部本着"高端、精英、超前、精湛"的办学理念，学部引进的绝大多数教师均具有海外留学背景，英语口语流利；录取的学生则要通过面试择优录取英语水平佳的同学，使得全英教学成为可能。临床医学本科专业组织学与胚胎学课程一直使用全英教学改革模式。教师课前编写合适的英文课件和教学计划在每次课前发给学生予以预习，课堂中用通俗的语言反复解释重点知识点，加强互动等方式提高学生对全英课程的兴趣。本文对30名2013级临床医学专业学生进行了反馈意见调查分析。结果显示，绝大部分同学对组织学与胚胎学全英教学持赞同态度，组织学与胚胎学课程中采用全英教学教学效果良好。当然，组织学与胚胎学全英教学也面临着诸多问题。英语水平相对较差的同学，要在理解抽象的专业知识的基础上，同时掌握大量复杂生僻的医学专业词汇，难免会在上课时产生抵触情绪；额外占用大量时间记忆专业词汇，导致学生对书本知识的广度和深度挖掘受到影响；缺少合适的英文教材，也在学习时也给同学们造成了困扰。我们要正确看待教学过程中产生的问题，设法克服困难，在借鉴国内外先进的教学理论与经验的基础上，结合自身实际，创造性的探求全英教学的出路，培养高素质高层次的医学人才。相信经过不断努力，不断实践，全英教学会取得更优异的成果。

97.从2014年IFAA国际解剖学工作者协会联合会议看基础医学教学改革现状与发展趋势 郑蔓茵梁怡琳谢天顺牛俊飞曾美琪管又飞谢苗刘志刚范新民沙鸥 深圳大学医学部医学系深圳518060 国际解剖学工作者协会联合会议（IFAA）第18届大会暨中国解剖学会第30届学术会议于2014年8月在北京国际会议中心顺利召开，深圳大学医学部部分老师和学生有幸参加了此次学术盛会，并在会议期间就基础医学，包括解剖学和组织胚胎学的教学改革现状以及发展趋势进行了现场问卷分析。本文就此次会议交流内容、问卷调查结果进行了统计和分析，发现各地区医学院校在会议交流内容、课程设置、教学改革状况等方面均存在一定差异和距离，特在此与各位同行进行分析和探讨。本调查结果显示，①国内外各地区医学院校的局部解剖学实践课平均学时（实体解剖课）占总学时比例均超过百分之五十；②国内有63%的院校引入虚拟切片，并结合传统的玻璃切片进行实践教学；③以问题为中心的体系和按照器官系统进行综合教育的体系正逐渐在国内的开展，并且随着学生自主学习能力的提高，有可能占据教学体系的重心。此调查结果也表明，解剖学教育中强调的理论与实践相结合的观点深入人心；在医学解剖学教学中，虚拟现实技术不会取代实体操作教学，两者结合是解剖学教学的可能趋势；随着虚拟现实技术的提高，成本的控制和观念上的更新，虚拟现实切片教学将会进一步在全球普及开来，最终替代传统的玻璃切片教学，这是组织学与胚胎学教学发展的可能趋势；国内医学教学方法将逐渐发展为以学生为中心，培养学生自主学习，自主讨论和自主解决问题的能力，使学生早期接触临床，树立独立创新意识和自主精神的启发式教育模式。

98.人体解剖学教学中多种教学手段的运用 安东 蒋吉英 潍坊医学院人体解剖学教研室 潍坊261053 解剖学的内容多、概念多、系统性和实践性强，很多同学感觉难以理解和记忆，针对这些特点，现在出现了传统教学模式、CBL、PBL、RBL等多种教学模式，但每一种教学模式都有很大优点的同时，也存在一定的不足。如何 合理地使用不同的教学方法，以提高学生的学习兴趣，培养学生分析问题和解决问题的能力，增强学生的创新能力和合作交流的能力，值得我们去思考和探讨。本研究针对每一堂课的内容，将不同的教学方法结合起来，取长补短，同时也根据不同教学方法的不足而提出我们自己的方法，比如画图法等。不仅使课堂内容非常充实，而且可以让学生更好的理解要学习的内容，能够锻炼学生的主动学习的能力和创新的思维，激发学生学习的兴趣，真正做到教学互动，提高教学质量，真正能够体现教学改革的要义。

99.地方医学院局部解剖学“翻转课堂”教学模式初探 王晓萃 蒋吉英 王益光 潍坊医学院人体解剖学教研室 潍坊261053 以培养创新能力的医学生为导向，局部解剖学翻转课堂为目标（学生自己制作课件讲授内容、教师当堂补充、答疑），构建一个科学合理的评价体系。获得评价反馈信息，从而为进行医学专业课程或教学模式等改革提供方向和指导，进而全面提高基础医学教育教学的质量。此种教学改革改变了传统"满堂灌"式教育，充分调动学生学习的积极性、主动性和创造性，注重培养学生独立思考、主动探索知识的能力，拓宽学生的视野，充分发挥学生的专业热情和创新意识。

100.关于人体解剖学研究生创新素质培养的思考 梁翠宏 蒋吉英 于树娜 潍坊医学院解剖教研室潍坊261053 研究生的创新素质是指研究生的创新意识、创新思维、创新能力等方面，是决定着研究生培养质量的关键。人体解剖学作为一门基础医学课程，其研究生的创新素质培养现状向来令人堪忧。影响解剖学研究生创新素质培养的原因除了相对滞后的教学方法和教学内容之外，解剖学研究生导师数量匮乏及学术水平参差不齐、扩招导致部分滥竽充数的学生混入研究生队伍之中、以及研究生本身缺乏创新的意识和动力等原因都不可忽视。因此，在适当的政策倾斜以及加强导师自身素养的前提下，建立健全科学的评价机制、教学机制及课程体系，推进各学科间的交叉和融合，将有助于解剖学研究生创新素质的培养。

101.混合式翻转课堂及其在组织学教学中的应用 董为人 黄文华 王华峰 张琳 南方医科大学实验教学管理中心 广州510515 基于混合式学习理念，我们设计了集小组讨论、自主学习、问题导向学习、慕课等为一体的混合式翻转课堂，并将其应用于人体组织学教学。该方案基于大量的网络学习资源，分为课前准备（个人学习和小组讨论）、课堂辩论（问题演示、组间辩论）、教师总结（案例或问题）三个阶段，每个阶段都有相应的评价量表。该方案刺激了学生的学习兴趣，培养团队精神，提升了自主学习能力，深受学生欢迎，并已在国内推广中。

102.南方医科大学“移动／云桌面”体系的构建 董为人1王华峰1薛翔1黄文华1柯志勇1金春华1罗深秋1庄国威21南方医科大学实验教学管理中心 广州510515；2三盟公司 广州510000 传统实验室桌面电脑存在缺乏移动性、管理维护成本高等缺陷。随着信息技术尤其是云技术的发展，移动学习、环保节约已成未来实验室建设的新趋势。本研究拟建立可移动性或云桌面实训体系。与三盟科技有限公司合作，购置服务器、交换机、瘦客户机等，安装桌面虚拟化操作系统VMware，将实验平台的实验内容虚拟到云；增加移动学习等功能。建成1个云桌面实训实验室（含1个教师端，32个学生端），通过桌面云端漫游访问实验内容；可用可移动设备实现云桌面瘦客户机的所有功能。校企合作共建云桌面，实现可移动性学习是可行的。

103.南方医科大学“器官－系统为中心”的医学整合课程体系的构建 董为人 薛翔 黄文华 黄巧冰 王华峰 谢小燕 南方医科大学实验教学管理中心 广州510515 在广泛调研的基础上，南方医科大学采用以器官系统为中心，将基础医学和临床医学课程进行融通整合辅以问题导向学习的整合课程体系。共分为14个模块，即医学基础引论、神经科学、感染与免疫、内分泌系统与代谢、循环系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统、血液系统与肿瘤、运动系统与皮肤、生殖与发育、五官科学、人文与社会医学和临床技能。每个模块一般按照系统发生、结构、功能及其调节，系统疾病的病理基础、系统疾病的药理学基础、系统疾病的辅助检查、系统疾病的诊疗等排序。每个模块穿插2－3个案例，使各学科内容融会贯通，使学生早期接触临床，强化临床思维，同时培养学生多方面的能力，尤其是自主学习、批判性思维、问题探究及解决、人文素养等。