胰腺神经内分泌肿瘤中DJ-1蛋白高表达的临床意义

杨立新，张丽娜，张天彪

1.沈阳医学院附属中心医院内分泌科，辽宁 沈阳 110024；

2.沈阳医学院附属中心医院重症医学科，辽宁 沈阳 110024；

3.中国医科大学生物化学与分子生物学教研室，辽宁 沈阳 110001

胰腺神经内分泌肿瘤中DJ-1蛋白高表达的临床意义

杨立新1，张丽娜2，张天彪3

1.沈阳医学院附属中心医院内分泌科，辽宁 沈阳 110024；

2.沈阳医学院附属中心医院重症医学科，辽宁 沈阳 110024；

3.中国医科大学生物化学与分子生物学教研室，辽宁 沈阳 110001

背景与目的：胰腺神经内分泌肿瘤(pancreatic neuroendocrine neoplasms，PNENs)症状复杂多样，易发生误诊和漏诊。本研究旨在探讨PNENs中DJ-1蛋白表达水平及其在病程进展及预后中的临床意义。方法：采用ELISA法检测16例PNENs及25例健康人血清中DJ-1蛋白的水平，采用免疫组织化学法检测了78例PNENs病理组织中DJ-1蛋白的表达情况。结果：PNENs患者血清中DJ-1蛋白水平显著高于健康人(36.19±6.71 vs 24.68±5.94 ng/mL；P＜0.001)；53.8%的PNENs组织中DJ-1蛋白呈阳性表达(42/78)；PNENs组织中DJ-1表达水平与淋巴结转移(P=0.033)、远处转移(P=0.017)、TNM分期(P=0.012)、以及病理分级(P=0.049)呈显著正相关；作为非独立风险因素，DJ-1阳性表达与PNENs患者OS(P=0.003)及DFS(P=0.018)缩短均显著相关。结论：PNENs存在DJ-1蛋白高表达，且与肿瘤的侵袭转移、病程进展及不良预后相关。

胰腺神经内分泌肿瘤；DJ-1；免疫组织化学；生存分析

胰腺神经内分泌肿瘤(pancreatic neuroendocrine neoplasms，PNENs)起源于胰腺小管的多能干细胞，约占所有胰腺肿瘤的1%～2%［1］。PNENs的症状复杂多样，临床医师对其认识普遍不足，常发生误诊和漏诊，导致病程迁延，由良性发展成恶性，给患者带来严重的健康损害。目前临床上对PNENs的诊断主要借助于影像学及血清神经内分泌标志物检测等手段，但不易判断其严重程度及提示预后［2］。因此，筛选能提示PNENs严重程度及预后的的新型分子标志物成为该研究领域的热点。

DJ-1基因(也称为Parkinson 7，PARK7)，在人体多种组织均有表达，参与抑制细胞凋亡、抗氧化及细胞转化等多种功能［3-4］，是近年新发现的癌基因［5］。近年研究发现，在诸如肺癌、宫颈癌、食管癌及白血病等多种恶性肿瘤组织中均存在DJ-1蛋白高表达，且与化疗耐药、患者生存期缩短等相关［6-9］；同时，在恶性肿瘤患者血清或其它体液中，DJ-1蛋白水平较健康人亦显著增高，且随着肿瘤的进展而增高［10-13］。在关于PNENs的研究中，国内外鲜见有关DJ-1基因及蛋白表达的报道。

本研究应用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测16例PNENs及25例健康人血清中DJ-1蛋白的水平；采用免疫组织化学法检测了78例PNENs组织中DJ-1蛋白的表达情况，并分析PNENs组织中DJ-1表达水平与患者临床病理参数及随访预后资料的相关性，以探讨DJ-1表达水平在PNENs病程进展及预后中的临床意义，判断DJ-1可否作为PNENs的新型分子标志物。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

DJ-1/PARK7 ELISA检测试剂盒购自美国MyBioSource公司(MBS027308)；兔抗人DJ-1多克隆抗体购自圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司(sc-32874)；UltraSensitive TM SP超敏浓缩试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司(KIT-9720)；DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司(LI-9032/9033)。

1.2 血清样本及病理组织样本

本研究所用血清样本来自沈阳医学院附属中心医院2011—2013年收治的16例PNENs患者群体，收集患者入院治疗前空腹采集的外周静脉血样，并分离得到血清样本；另外收集了在本院体检中心进行健康体检的25例健康人空腹静脉血样，并分离得到血清样本。上述血清标本加入0.02%叠氮钠后，于-80 ℃冰冻保存，以备检测。组织样本均来自沈阳医学院附属中心医院2004年—2009年78例PNENs患者手术切除的病理组织，手术前患者均未接受放疗或化疗。

1.3 ELISA检测

应用DJ-1 ELISA检测试剂盒检测16例PNENs患者及25例健康人血清样品中DJ-1蛋白水平，具体操作步骤参照说明书进行。

1.4 免疫组织化学染色及结果判读

保存于-80℃的手术切除组织经室温解冻后，用4%多聚甲醛固定2 d，常规制作石蜡包埋组织块，切4 μm厚石蜡切片，固定于经多聚赖氨酸处理的防脱载玻片上。将组织切片依次进行二甲苯脱蜡，乙醇脱苯、水化处理，于柠檬酸盐缓冲液(pH为6.0)中在80 kpa压力下修复5 min。经H2O2、正常山羊血清处理后，切片滴加DJ-1一抗(1︰200稀释)并于4 ℃温育过夜。次日切片经生物素标记二抗以及链真菌抗生物素蛋白-辣根过氧化酶(SP)复合物温育后，滴加新鲜配制的DAB 溶液显色，并进行苏木素复染。以PBS液代替DJ-1抗体作为阴性对照。

DJ-1蛋白阳性表达部位为细胞质。染色结果综合染色强度和着色肿瘤细胞百分率进行判定。染色强度评分为：无染色0分，弱染色1分，中等强度染色2分，强染色3分；着色肿瘤细胞百分率评分为：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＜75%为4分；染色强度和着色肿瘤细胞百分率的乘积为总积分，范围0～12，总积分≤3定义为阴性表达，总积分＞3定义为阳性表达。阅片工作由两位有经验的临床病理医师进行盲法判读。

1.5 统计学处理

采用SPSS 16.0软件包对数据进行处理。采用独立样本t检验分析PNENs患者和健康人血清样本中DJ-1蛋白水平的组间差异；采用Pearson χ2检验或Fisher确切概率法分析DJ-1蛋白表达水平与PNENs患者临床病理参数相关性。自疾病确诊至发生局部复发或远处转移之间的时间定义为无病生存期(disease-free survival，DFS)，自疾病确诊至患者因该病死亡或已知的最后1次随访之间的时间定义为总体生存期(overall survival，OS)；本研究采用log-rank检验绘制Kaplan-Meier曲线，并采用Cox回归来进行单变量和多变量分析，进行生存分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 患者临床资料

本研究中PNENs患者的临床资料如表1所示，78例PNENs患者中，男性45例，女性33例；患者平均年龄为57.9岁(21岁～79岁)；其中27例(34.6%)患者淋巴结发生转移。本研究中共收集到68例PNENs患者的生存资料，随访率为87.2%，随访时间为44～113个月，随访中位时间为98个月；随访患者中因PNENs死亡16例，PNENs复发28例，患者OS的平均值为105.4个月，DFS的平均值为97.6个月，患者5年生存率为98.5%。本样本中部分患者临床资料收集不完全。

2.2 PNENs患者血清中DJ-1蛋白的水平

应用ELISA法检测了25例正常健康人及16例PNENs患者血清样品中DJ-1蛋白水平。结果发现，正常健康人血清中DJ-1蛋白平均水平24.68±5.94 ng/mL，PNENs患者血清中DJ-1蛋白平均水平为36.19±6.71 ng/mL。采用独立样本t检验进行比较发现，与正常健康人相比，PNENs患者血清中DJ-1蛋白水平显著增高(P＜0.001)。

2.3 DJ-1蛋白在PNENs组织中的表达

应用免疫组化法检测DJ-1蛋白的表达情况，78例PNENs组织中，有42例DJ-1蛋白呈阳性表达，阳性率为53.8%(42/78)，DJ-1蛋白在PNENs组织中阴性表达和阳性表达的情况见图1。

2.4 DJ-1与PNENs临床病理参数的相关性

应用Pearson χ2检验或Fisher确切概率法分析DJ-1蛋白表达与PNENs患者的临床病理参数的相关性(表2)，结果发现，与无淋巴结转移的组织相比，在发生淋巴结转移的PNENs组织中，DJ-1表达水平显著增高(P=0.033)；同样与无远处转移的组织相比，在发生远处转移的PNENs组织中DJ-1表达水平亦显著增高(P=0.017)；与TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期的组织相比，Ⅲ～Ⅳ期的PNENs组织中DJ-1表达水平显著增高(P=0.012)；此外，随着PNENs组织病理分级增加，DJ-1表达水平显著增高(P=0.049)。DJ-1表达水平与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、有无瘤栓、以及分化程度等病理参数之间无显著相关性(P＞0.05)。

表1 78例PNENs患者的临床病理特征Tab. 1 Clinicopathological characters of 78 PNENs cases

图1 DJ-1蛋白在PNENs病理组织中的阴性表达和阳性表达Fig. 1 Expression of DJ-1 in PNENs pathological tissues

表2 DJ-1蛋白表达与PNENs病理参数的相关性Tab. 2 Correlation of DJ-1 expression and clinicopathological features of PNENs patients

2.5 DJ-1对PNENs患者生存期的影响

应用log-rank检验分析DJ-1蛋白表达水平与PNENs患者的OS及DFS的关系，本研究结果发现，DJ-1阳性表达可显著缩短患者的OS(P=0.003，图2A)及DFS(P=0.018，图2B)。

单变量COX回归法分析结果发现，肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、分化程度、病理分级及DJ-1表达水平均与患者的OS及DFS显著相关，此外，远处转移和瘤栓与DFS亦显著相关(表3)。鉴于单变量COX回归分析的结果，本研究引入肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、瘤栓、TNM分期、分化程度、病理分级、及DJ-1表达水平等病理参数，进一步进行多变量COX回归分析，结果发现淋巴结转移(OS，P=0.041；DFS，P=0.013)和病理分级(OS，P=0.015；DFS，P=0.019)为影响OS及DFS的独立风险因素，此外，影响DFS的独立风险因素还有远处转移(P=0.020)和分化程度(P＜0.001，(表4)。

表3 单变量Cox回归法分析PNENs临床病理参数与患者OS及DFS的相关性Tab. 3 Univariate Cox regression analysis of clinicopathological data correlated with OS and DFS in PNENs

表4 多变量Cox回归法分析PNENs临床病理参数与患者OS及DFS的相关性Tab. 4 Multivariate Cox regression analysis of clinicopathological data correlated with OS and DFS in PNENs

图2 DJ-1蛋白表达对PNENs患者OS和DFS的影响Fig. 2 The influence of DJ-1 expression on the OS and DFS of PNENs patients.

3 讨 论

DJ-1在多种恶性肿瘤中存在过表达，且与肿瘤的侵袭转移、病程进展以及不良预后等相关。在胰腺肿瘤领域，He等［14］发现在胰腺癌中存在DJ-1高表达，并且与肿瘤分期、侵袭、转移和预后有关；在神经内分泌肿瘤领域，Miyajima等［15］研究发现星形细胞瘤中DJ-1蛋白表达随肿瘤WHO分级增加显著增高；Zhang等［16］和Krause等［17］的研究均发现在甲状腺组织恶性病变的过程中存在DJ-1表达水平的增加。但是对PNENs中DJ-1的表达尚未见报道。本研究应用ELISA法检测了16例PNENs患者及25例正常健康人血清中DJ-1蛋白的水平，发现与其它肿瘤相似，PNENs患者血清中DJ-1蛋白水平著增高于健康人，这提示DJ-1在PNENs的发生、发展过程中可能起到一定的作用。

本研究进一步采用免疫组化法检测了78例PNENs组织中DJ-1蛋白的表达情况，并与患者的临床病理参数进行相关性分析。研究结果发现，当PNENs出现淋巴结转移或者远处转移时，DJ-1表达水平则随之增高，并且晚期PNENs较早期PNENs表达更多的DJ-1。说明DJ-1可能参与PNENs的侵袭转移、病程进展过程。

在卵巢癌［13］、喉癌［18］、食管癌［8］、肝癌［19］等诸多恶性肿瘤中，均发现DJ-1蛋白高表达与不良预后相关。本研究结果发现，DJ-1阳性表达与PNENs患者OS及DFS缩短显著相关，说明PNENs高表达DJ-1蛋白可提示患者不良预后。

近年来，PNENs的诊断与治疗取得了较快的进展，但是鉴于该类疾病的病情复杂、症状不明显、可恶性转化等特征，在其早期诊断方法，尤其是快速简捷的新型分子标志物检测上还有很多的难点尚未攻克。DJ-1蛋白在多种肿瘤中均发现有作为分子标志物的潜质，可提示肿瘤进展、药物敏感性及预后等。本研究的结果也支持DJ-1有作为PNENs的诊断分子标志的潜质。后续研究将扩大患者样本量，设置对照组，进一步确定DJ-1能否作为PNENs的一种诊断分子标志物。

综合本研究的结果，PNENs存在DJ-1蛋白高表达，且与肿瘤的侵袭转移、病程进展及不良预后相关。

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The clinical significance of DJ-1 over expression in pancreatic neuroendocrine neoplasms

YANG Lixin1, ZHANG Lina2, ZHANG Tianbiao3(1. Department of Endocrinology, Central Hospital Affliated to Shenyang Medical College, Shenyang Liaoning 110024, China; 2. Department of ICU, Central Hospital Affliated to Shenyang Medical College, Shenyang Liaoning 110024, China; 3. Department of Biochemistry and Molecular Biology, China Medical University, Shenyang Liaoning 110001, China)

YANG Lixin E-mail: sy_yanglx@126.com

Background and purpose:The symptoms of pancreatic neuroendocrine neoplasms (PNENs) are complicated, that might lead to misdiagnosis. This study aimed to detect the expression level of DJ-1 in PNENs and explore the clinical significance of DJ-1 in PNENs.Methods:DJ-1 protien levels in the serum of 16 cases of PNENs patients and 25 cases of healthy persons were detected by ELISA analysis; The expressions of DJ-1 in 78 cases of PNENs tissues were detected by immunohistochemical staining.Results:The DJ-1 level in the serum of PNENs patients was signifcantly higher than healthy persons (36.19±6.71 vs 24.68±5.94 ng/mL; P＜0.001); 53.8% (42/78) cases of PNENs tissues showed DJ-1 positive staining; DJ-1 expression level in PNENs tissues had signifcantly positive correlation with lymph node metastasis (P=0.033), distant metastasis (P=0.017), TNM stage (P=0.012), and pathology grade (P=0.049); As a dependent risk factor, DJ-1 expression was signifcantly associated with shorter OS (P=0.003) and DFS (P=0.018) of PNENs patients.Conclusion:High expression of DJ-1 protein correlated with invasion and metastasis, disease progression, and poor prognosis in PNEN.

Pancreatic neuroendocrine neoplasms; DJ-1; Immunohistochemistry; Survival analysis

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.02.006

R735.9

A

1007-3639(2015)02-0112-07

2014-09-12

2014-12-15）

辽宁省自然科学基金项目（201202279）。

杨立新 E-mail:sy_yanglx@126.com