SU11274逆转肝细胞生长因子诱导不同EGFR基因型非小细胞肺癌细胞株对吉非替尼耐药

严春花，玄香兰，张佳，安昌善

1.延边大学附属医院呼吸内科，吉林 延吉133000；

2.延边第二人民医院呼吸内科，吉林 延吉133000

SU11274逆转肝细胞生长因子诱导不同EGFR基因型非小细胞肺癌细胞株对吉非替尼耐药

严春花1，玄香兰2，张佳1，安昌善1

1.延边大学附属医院呼吸内科，吉林 延吉133000；

2.延边第二人民医院呼吸内科，吉林 延吉133000

背景与目的：肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)诱导敏感非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)细胞对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)耐药，其机制与c-Met激活有关。本研究探讨c-Met抑制剂SU11274逆转HGF诱导的不同EGFR基因型NSCLC细胞株对吉非替尼耐药及逆转耐药机制。方法：选择人NSCLC细胞株PC9(EGFR突变型)、H292(EGFR野生型)和A549(EGFR野生型)，应用吉非替尼和SU11274单独或联合作用于HGF诱导的细胞株。实验分为6组：C组(不加药对照组)、H组(HGF处理组)、G组(吉非替尼处理组)、S组(SU11274处理组)、HG组(HGF+吉非替尼处理组)和HGS组(HGF+吉非替尼+SU11274处理组)。MTT法检测对细胞增殖的影响，流式细胞术检测细胞凋亡的影响；应用蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞中c-Met及其下游通道Stat3、Akt和Erk1/2蛋白表达水平。结果：吉非替尼对3种细胞的生长抑制作用均呈浓度依赖性，HGF处理能够缓解吉非替尼的增殖抑制作用(P＜0.05)；不同浓度吉非替尼联合SU11274作用于HGF诱导细胞时，3种细胞株存活率比吉非替尼单独作用于HGF诱导细胞时明显降低(P＜0.05)；HGS组的细胞凋亡比HG组明显增加(P＜0.05)；HGS组的c-Met、Stat3、Akt和Erk1/2活化蛋白量比HG组明显减少。结论：c-Met抑制剂SU11274可逆转HGF诱导的不同EGFR基因型NSCLC细胞株对吉非替尼耐药，其机制可能与抑制HGF活化的c-Met及其下游通道蛋白表达有关。

肝细胞生长因子；吉非替尼；耐药：SU11274；非小细胞肺癌

目前，分子靶向药物表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth facter receptortyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)逐渐成为治疗非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的重要手段。EGFR-TKI有效率与EGFR基因型有很大的相关性［1-2］，存在原发或获得性耐药，开始对EGFR-TKI疗效明显的患者一段时间后逐渐出现获得性耐药［3］。HGF诱导NSCLC细胞对吉非替尼耐药，且与c-Met激活有关［4-6］。有研究报道，c-Met抑制剂(E7050、PF-2341066)可逆转HGF诱导的EGFR突变型NSCLC细胞株对吉非替尼耐药［7-8］。SU11274是选择性的c-Met抑制剂。本研究选择EGFR不同基因型人NSCLC细胞(EGFR突变型和野生型)，用SU11274作用于HGF诱导对吉非替尼耐药的NSCLC细胞，检测其对细胞增殖、凋亡以及c-Met信号通道蛋白的影响，探讨SU11274是否逆转HGF诱导的不同EGFR基因型NSCLC细胞对吉非替尼耐药及逆转耐药机制，为临床提供联合用药的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

选择人NSCLC细胞株PC9(EGFR突变型，敏感株)、H292(EGFR野生型，敏感株)和A 5 4 9(E G F R野生型，原发性耐药株)，均由上海市肺科医院中心实验室提供；DMEM培养液及新生牛血清购自美国Hyclone公司；吉非替尼原料购自济南汇丰达化工有限公司；HGF购自美国Humanzyme公司；SU11274购自美国Sigma公司；MTT粉购自美国Amresco公司；Annexin Ⅴ-FITC凋亡检测试剂盒购自美国BD PharMingen公司。兔抗人p-Met(Tyr1349)、c-Met、p-Akt(Ser473)、Akt、Erk1、p-Stat3(Ser727)、Stat3和GAPDH抗体均购自美国Epitomics公司，p-Erk1/2(Tyr202/Y204)购自美国Cell Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔购自美国Jection公司；NC膜购自美国Whatman公司；ECL化学发光试剂购自美国Thermo公司。其它试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养及药物配制

分别将PC9、H292和A549细胞常规培养于含10%新生牛血清的DMEM培养液中，置于CO2体积分数为5%、37 ℃恒温细胞培养箱中温育，每3～4 d换液传代1次。HGF用含0.1%BSA的蒸馏水稀释成500 μg/mL的母液。吉非替尼原料用DMSO溶解稀释成浓度为100 mmol/L的母液，用药时DMSO终浓度＜0.1%。SU11274用DMSO溶解稀释成浓度为100 mmol/L的母液，用药时DMSO终浓度＜0.1%。

1.3 MTT法检测细胞增殖

取100 μL含细胞数为1×10³个的细胞悬浮液接种于96孔板，每组设5个复孔。细胞贴壁后，每孔内加入40 ng/mL HGF和(或)浓度为0、0.01、0.04、0.1、0.4、1、4和10 μmol/L的吉非替尼和(或)最小SU11274浓度。72 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，放入细胞培养箱中温育。4 h后，离心、弃上清液，每孔加入200 μL DMSO，摇床上混匀约30 min至结晶完全溶解，用酶标仪测量波长530 nm时吸光度(A)值。细胞存活率(%)=(A实验组均值-A空白组均值)/(A对照组均值-A空白组均值)×100%。实验重复3次。用细胞存活率做出量效曲线，用作图法分析得出1种药物对不同细胞的IC50。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

取5×105个对数生长期细胞接种于6孔板。贴壁后弃原培养液，加入40 ng/mL HGF和(或)1 μmol/L吉非替尼和(或)最小SU11274浓度。48 h后，胰酶消化并收集全部细胞到5 mL试管中，离心、弃上清液，0.9%NaCl溶液洗涤1次。加入1×Binding Buffer调整细胞浓度为1×106个/mL，取100 μL(1×105个细胞)到新的5 mL试管中。各管内加入5 μL FITC和5 μL PI，室温、避光15 min。上机前加入400 μL 1×Binding Buffer，在1 h内进行检测。实验重复3次。

1.5 蛋白质印迹法(Western blot)检测蛋白表达水平

取5×105个对数生长期的细胞接种于6 mm2细胞培养皿，细胞贴壁后加入40 ng/mL HGF和浓度分别为0、0.5、1、2.5、5和10 μmol/L的SU11274。24 h后，冰上裂解细胞提取总蛋白，用BCA法定量，取30～40 μg蛋白经8%～10% SDSPAGE电泳分离后转印至NC膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗温育4 ℃过夜，TBST洗膜10 min、3次后二抗室温摇床温育1 h，TBST洗膜5 min、5次后ECL化学发光试剂显色、曝光成像。ImageJ2x软件测定各条带灰度值。选择其中SU11274最小有效抑制浓度后，每种细胞实验分6组：C组(对照组)、H组(HGF处理组)、 S组(SU11274处理组)、G组(吉非替尼处理组)、HG组(HGF+吉非替尼处理组)和HGS组(HGF+吉非替尼+SU11274处理组)。加入40 ng/mL HGF和(或)1 μmol/L吉非替尼和(或)最小SU11274浓度，检测各组细胞内c-Met、p-Met、Stat3、p-Stat3、Akt、p-Akt、Erk1/2和p-Erk1/2蛋白的表达水平。

图1 不同浓度SU11274作用后c-Met下游通道蛋白磷酸化情况Fig. 1 The phosphorylation of c-Met downstreams signaling pathway proteins after treating with different concentrations of SU11274

1.6 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件对结果进行统计分析。计量资料用±s 表示，2组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SU11274单独作用对HGF诱导的细胞中c-Met及其下游信号蛋白表达的影响

不同浓度SU11274作用于HGF诱导的细胞后，Western blot检测结果显示，p-Met、p-Stat3和p-Akt蛋白表达有不同程度受到抑制。SU11274浓度为1 μmol/L时HGF刺激3种细胞被激活的c-Met、p-Stat3和p-Akt蛋白表达均开始受到抑制(图1)。而1 μmol/L SU11274对PC9、H292和A549细胞生长几乎没有抑制作用，其细胞存活率分别为(96.8±3.2)%、(95.9±2.5)%和(102.1±1.3)%，故选择1 μmol/L进行后续实验。

2.2 吉非替尼单独作用和联合SU11274对HGF诱导的细胞生长抑制的影响

吉非替尼以不同浓度单独作用于PC9、H292和A549细胞72 h后，MTT法检测结果显示，均产生细胞生长抑制作用，且呈浓度依赖性。吉非替尼作用于HGF诱导的细胞后，其IC50值比非HGF诱导组明显增高，与SU11274联合作用于HGF诱导的细胞后IC50值明显降低(P＜0.05，图2)。在吉非替尼相同浓度的条件下，HGF诱导组细胞存活率比非诱导组明显提高，差异有统计学意义(P＜0.05，图2)。

图2 吉非替尼作用于HGF单用或联合SU11274处理的PC9、H292、A549细胞株药物浓度-存活率曲线Fig. 2 The concentration-survival curve of gefitinib and HGF treated PC9, H292, A549 cells with or without SU11274

1 μmol/L SU11274联合不同浓度吉非替尼(0.01、0.04、0.1、0.4、1、4和10 μmol/L)作用于HGF诱导的细胞72 h后，在相同药物浓度下细胞存活率比单独不同浓度吉非替尼(0.01、0.04、0.1、0.4、1、4和10 μmol/L)作用于HGF诱导的细胞存活率明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05，图2)。

2.3 吉非替尼单独作用和联合SU11274对HGF诱导的细胞凋亡的影响

用1μmol/L吉非替尼作用于PC9、H292和A549细胞72 h后，细胞凋亡率分别为(4.7±2.0)%、(31.8±10.4)%和(10.8±3.6)%。用1 μmol/L吉非替尼单独作用于HGF诱导的细胞72 h后，细胞凋亡率分别为(4.4±1.7)%、(21.5±8.2)%和(3.1±1.4)%。除了PC9细胞外，HGF诱导组的凋亡率比非HGF诱导组显著减少(P＜0.05)。SU11274(1 μmol/L)联合吉非替尼(1 μmol/L)作用于HGF诱导的细胞72 h后，细胞凋亡率比单用吉非替尼作用于HGF诱导细胞后的凋亡率显著升高(P＜0.05，表1)。

2.4 吉非替尼单独或联合SU11274对HGF诱导的细胞中c-Met及其下游通道蛋白的影响

Western blot检测结果显示，吉非替尼单独作用于诱导前细胞时，细胞中p-Stat3、p-Akt和p-Erk1/2蛋白表达水平均明显下降。吉非替尼单独作用于HGF诱导的细胞时，细胞中p-Met、p-Stat3、p-Akt和p-Erk1/2蛋白表达水平均明显升高。当SU11274和吉非替尼联合作用于HGF诱导的细胞时，细胞中p-Met、p-Stat3、p-Akt和p-Erk1/2蛋白表达水平均明显下降(图3)。

表1 吉非替尼单用或联合SU11274对HGF诱导的细胞凋亡率Tab. 1 The effects of gefitinib with or without SU11274 on the apoptosis induced by HGF

图3 吉非替尼单用或联合SU11274作用对HGF诱导的c-Met及其下游通道蛋白表达的影响Fig. 3 The expressions of HGF-induced c-Met and downstream signaling pathway proteins affected by gefitinib alone or accompanied with SU11274

3 讨 论

EGFR是一种跨膜酪氨酸激酶受体，是人类表皮生长因子受体家族中的一员。EGFR基因与配体结合后，EGFR基因在细胞内区的酪氨酸发生自身磷酸化，活化下游信号通道，调控上皮来源细胞的增殖、侵袭及迁移。吉非替尼是小分子EGFR-TKI，阻止EGFR自身磷酸化，阻断EGFR介导的下游通道活性，表现为抑制肿瘤细胞生长、迁移、侵袭和肿瘤血管生成等。EGFR突变与EGFR-TKI有效率有很大的相关性，存在原发性或获得性耐药。EGFR基因2次突变(T790M)［9］和MET基因扩增［10］是EGFR-TKI耐药的两大主要分子机制，其它可能的机制有胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)过表达［11］、蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)缺失［12］、HGF高表达［13-14］等。HGF/c-Met信号通路参与EGFRTKI获得性耐药［4-5］。

HGF属于成纤维细胞的衍生因子，与特异性c-Met受体结合，使其发生自身磷酸化，激活细胞内信号途径，促进多种组织细胞增生分裂、细胞运动和血管生成。在各种恶性肿瘤中发现异常的HGF/c-Met信号通道，且与不良预后相关。Senguta等［15］测定高侵袭状态肺癌患者血清中HGF含量明显升高，血清HGF含量升高可能与EGFR-TKI耐药有关。目前，c-Met抑制剂主要有PF02341066、GW2974和SU11274等。SU11274可减少T790M-EGFR型NSCLC细胞对EGFR-TKI耐药［16-17］。本研究选择的PC9细胞具有EGFR基因突变型敏感株，H292细胞为EGFR基因野生型敏感株，A549细胞为EGFR基因野生型耐药株，从IC50值可以看出其耐药性。吉非替尼抑制PC9、H292、A549细胞增殖作用均呈浓度依赖性，HGF诱导后IC50显著升高，说明HGF明显提高吉非替尼抑制细胞增殖的IC50，使3种肺癌细胞存活率升高，增加了耐药性。吉非替尼促进细胞凋亡，HGF诱导后则明显降低其促进细胞凋亡作用。

细胞除了表达EGFR外同时还表达其它含酪氨酸激酶活性的跨膜受体，称之为EGFR旁路酪氨酸激酶信号。c-Met属于受体酪氨酸激酶家族的一员。c-Met与其配体HGF结合，激活细胞内MAPKs、PI3K/Akt和c-Src/FAK、STAT信号通路。本研究中，吉非替尼对PC9、H292、A549的生长抑制作用呈浓度依赖性，HGF诱导后吉非替尼抑制细胞的生长曲线往右移。HGF诱导后吉非替尼对PC9、H292、A549细胞的IC50值明显升高，使不同基因型肺癌细胞存活率升高。40 ng/mL HGF和不同浓度吉非替尼及SU11274 (1 μmol/L)作用后，PC9、H292和A549细胞的存活率恢复到原来的水平。在EGFR野生型细胞中，HGF能明显减少吉非替尼对肺癌细胞的凋亡，而在EGFR突变型细胞中，HGF不能明显减少吉非替尼对肺癌细胞的凋亡。在SU11274联合作用下，吉非替尼对HGF诱导3种肺癌细胞的凋亡率显著提高。

HGF与c-Met结合后c-Met发生自身磷酸化，激活Met下游通道(MAPK、PI3K/Akt、c-Src/ FAK和STAT等)。c-Met抑制剂和EGFR-TKI联合用药逆转HGF诱导的EGFR突变型NSCLC细胞株对EGFR-TKI耐药，其机制与抑制c-Met下游通道激活有关［3-4］。本研究结果显示，吉非替尼在无HGF刺激下明显抑制PC9、H292和A549细胞内Akt、Stat3及Erk1/2的活化，但在HGF诱导下不能抑制PC9、H292和A549细胞内c-Met、Akt、Stat3和Erk1/2活化，同时检测的非磷酸化的c-Met、Akt、Stat3和Erk1/2总量无明显变化。说明c-Met及其下游通道蛋白磷酸化参与了HGF诱导不同EGFR基因型NSCLC对吉非替尼耐药机制。

本研究中，在HGF诱导的PC9、H292和A549细胞凋亡，吉非替尼联合SU11274组比单用吉非替尼组HGF激活的c-Met及其下游通道蛋白c-Met、Akt、Stat3和Erk1/2的磷酸化表达减少。在吉非替尼作用下，PC9、H292和A549细胞中HGF诱导激活的c-Met及其下游通道蛋白c-Met、Akt、Stat3和Erk1/2被SU11274抑制。提示c-Met抑制剂可逆转HGF诱导不同EGFR基因型NSCLC细胞株对吉非替尼耐药，其机制与逆转c-Met及下游通道c-Met、Akt、Stat3和Erk1/2的激活有关。联合应用EGFR-TKI与HGF拮抗剂或c-Met抑制剂对分泌HGF或表达c-Met及EGFR-TKI耐药的NSCLC患者可能更加有效，其临床疗效令人期待。

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SU11274 reverse gefitinib resistance induced by hepatocyte growth factor in different EGFR gene type of non-small cell lung cancer cells

YAN Chunhua1, XUAN Xianglan2, ZHANG Jia1, AN Changshan1(1.Department of Respiratory Disease, Yanbian University Hospital, Yanji Jilin 133000, China; 2. Department of Respiratory Disease, Yanbian Second People’s Hospital, Yanji Jilin 133000, China)

AN Changshan E-mail: cs_an2003@aliyun.com

Background and purpose:Hepatocyte growth factor (HGF) induce epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI) resistance in non-small cell lung cancer (NSCLC) cells, the mechanism might be related with activation of c-Met. The present study aimed to explore whether c-Met inhibitor SU11274 reverse gefitinib resistance induced by HGF in different EGFR gene types of NSCLC.Methods:PC9 (EGFR-activating mutant), H292 (EGFR-wild type) and A549 (EGFR-wiled) were chosen. The experiments were divided into 6 groups: C group (control), H group (HGF), G group (geftinib), S group (SU11274), GH group (geftinib+HGF), GSH group (geftinib+SU11274+HGF). The cell survival was measured by MTT assay; the cell apoptosis was measured by fow cytometry (FCM); the expressions of c-Met, Stat3, Akt and Erk1/2 protein were examined by Western blot.Results:Gefitinib inhibited cell growth of 3 cells lines in a dose-dependent manner, and treating with HGF could relieveinhibition of cell growth caused by geftinib. The cell survival when treating the HGF-induced cell lines with defferent concentration of geftinib combined with SU11274 was signifcantly decreased than that when treating HGF-induced cell lines with geftinib alone. In 3 cell lines, the apoptosis rate in HGS group was higher than that in HG group (P＜0.05). In three cells lines, the p-Met, p-Stat3, p-Akt and p-Erk1/2 expressions in HGS group were lower than that in HG group (P＜0.05).Conclusion:SU11274 reversed geftinib resistance induced by HGF in different EGFR gene types of NSCLC cells, the mechanism might be related with inhibiting the HGF-induced activation of c-Met and its downstream signaling pathway.

Hepatocyte growth factor; Geftinib; Resistance; SU11274; Non-small cell lung cancer

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.02.004

R735.7

A

1007-3639(2015)02-0099-06

国家自然科学基金项目(81160291)。

安昌善 E-mail:cs_an2003@aliyun.com