土壤修复过程中微生物数量、酶活性与石油降解率的关系

张秀霞，武海杰，白雪晶，郭云霞，张守娟

（中国石油大学 环境与安全工程系，山东 青岛 266580）

石油开采、运输、储存和利用造成的土壤石油污染日益严重。目前，土壤石油污染的处理方法主要有物理法、化学法以及生物修复法，其中，生物修复方法因处理彻底、费用低而备受关注［1］。微生物能够利用石油烃作为生长所需的碳源和能源，并在酶的催化下将其水解为甘油、脂肪酸，最终降解为 H2O、。徐金兰等［3－4］研究表明，生物修复过程中，高效石油降解菌的投加可加快石油污染物的降解，远远高于只有土著微生物的自然状态的石油降解。

当高效降解菌应用于石油污染土壤时，由于营养物质、空间以及代谢产物（如表面活性剂）而与土著微生物产生协同或竞争作用，直接导致微生物数量增加或减少，从而影响石油降解效率。张甲耀等［4－8］研究表明，微生物数量、土壤酶活性均与石油污染物的降解有一定关系。笔者在单因素花盆实验优化降解条件的基础上，在花盆中投加高效石油降解菌，模拟原位修复石油污染土壤，研究微生物（细菌、真菌和放线菌）数量、土壤酶活性与石油降解率之间的相关性，为石油污染土壤的生物修复提供理论基础。

1 实验部分

1.1 材料

供试土壤采自新疆克拉玛依油田的重油九区大坝附近的石油污染土壤。其pH值为7.2～7.4，含水率（质量分数，下同）22.35%～25.28%，有机质质量分数122～152g/kg，全氮质量分数18～25g/kg，有效磷质量分数12.0～21.6g/kg，石油烃质量分数4.07%～5.03%。实验过程中，供试土壤去除植物残体以及砾石，过3mm筛，经过自然风干7d后使用。

1.2 实验方法

1.2.1 高效降解菌降解条件的优化

在恒温恒湿的培养箱中花盆实验模拟微生物原位修复，将高效降解菌应用于石油污染土壤的修复。根据石油降解率对微生物的降解条件进行优化得出，最佳接种量为15%（质量分数）、表面活性剂（吐温80）质量分数为0.1%、CNP比为100∶10∶1（即有机质含量与全氮、速效磷的质量分数比）、翻耕频率为1次/d、温度37℃、含水率在22%～26%。进行28d的花盆修复，每隔7d测定1次土壤的微生物数量、土壤酶活性和石油含量。采用紫外分光光度法测定土壤石油含量［9］。

1.2.2 土壤微生物数量的测定

采用稀释平板涂布培养计数法，细菌采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养计数，真菌采用马丁氏培养基培养计数，放线菌采用高氏1号培养基培养计数，结果以每1g干土所含数量表示［10］。

1.2.3 土壤酶活性的测定

采用苯酚钠比色法测定脲酶活性，采用邻苯三酚（焦性没食子素）比色法测定多酚氧化酶活性，采用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性，采用2，3，5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）还原法测定脱氢酶活性，采用茚三酮比色法［11］测定蛋白酶活性。

2 结果与讨论

2.1 修复过程中土壤微生物数量的变化

在优化降解条件下，对石油污染土壤进行28d原位修复，每隔7d测定1次土壤中微生物总数（包括细菌、真菌和放线菌）。由于细菌、真菌和放线菌的生长速率、代谢途径以及对石油烃的利用性不同，导致在修复过程中微生物数量增长发生了变化，实验结果列于表1。

表1 石油污染土壤修复过程中微生物数量的变化Table 1 The variety of microorganism population quantity during remediation of oil contaminated soil

由表1可知，在修复初期，由于高效石油降解菌对土壤环境处于适应阶段，微生物数量几乎没有改变。只有土著微生物修复的土壤，由于土著微生物数量有限，高浓度的石油污染物对微生物的生长与代谢产生抑制作用［12］，因此，微生物数量几乎不变；随着修复的进行，高效石油降解菌逐渐适应了环境，微生物数量激增；到了修复后期，由于易降解的石油组分被快速降解，一些难降解的高分子物质会对微生物产生毒害作用［13］，同时由于酸性物质的积累使得土壤微生物总数增长缓慢。

由表1还可知，当高效石油降解菌投加到石油污染土壤时，由于要适应环境条件且受石油浓度的选择性作用，使得细菌数量变化不大，此时微生物总数几乎不变；随着时间的延长，适应了该环境的高效降解菌大量繁殖，利用石油污染物作为碳源，同时获取适量的N、P等营养物质，细菌数量激增；随着修复的进行，由于易被微生物利用的石油组分减少、营养的失衡以及酸性物质的积累［14］，引起部分细菌增长缓慢或者死亡。

土壤中真菌数量在修复7d没有出现变化，表明该浓度石油类污染物质的存在抑制了真菌的生长［15］；随着修复的进行，真菌数量开始增长，此时的石油污染物在不断地代谢和降解条件下适宜于真菌的生长，但细菌和放线菌的对数增长却对真菌的生长产生抑制作用，因此真菌数量增长缓慢；到了修复末期，随着可利用碳源的减少，石油中不易降解组分（如芳香类）不断的积累，真菌对芳香烃有很强的降解作用［13］，此时细菌和放线菌处于竞争状态，这两者的作用刺激了真菌的对数增长。

土壤中放线菌数量在修复7d呈现缓慢增长的趋势；修复时间增至14d、21d，放线菌数量呈现对数增长，这是因为随着石油污染物的代谢和降解，会选择性地刺激放线菌的生长［16］；修复末期，由于微生物生长需要消耗大量的营养元素，导致土壤中营养供给不足，微生物数量呈现下降的趋势。

2.2 修复过程中土壤酶活性的变化

在优化降解条件下，对石油污染土壤进行28d原位修复，每隔7d测定1次土壤酶活性，包括脲酶、蛋白酶、脱氢酶、过氧化氢酶以及多酚氧化酶，实验结果示于图1。

由图1可知，修复初始阶段，土壤脲酶活性逐渐增加，修复14d后，脲酶活性的增长速率逐渐下降，修复后期脲酶活性的增长速率又有所升高。石油的部分组成物质在初始阶段可以被土壤中与脲酶活性有关的微生物利用［17］，微生物总数增多，因此脲酶活性增强，与陈亮等［18］关于脲酶活性与微生物总数关系的结果一致；修复14d后，由于可利用碳源的减少，以及营养物质的缺乏导致微生物总数的减少，土壤脲酶活性有所下降，表明脲酶对环境中的营养物质变化较为敏感［19］；随着石油污染物的不断降解，土壤中微生物总数和种类不断增多，从而使得脲酶活性有所增强［20］。

图1 修复过程中土壤酶活性随时间的变化Fig.1 The variety of enzyme activity with time during remediation of oil contaminated soil

由图1还可知，在修复初始阶段，土壤蛋白酶的活性几乎没有变化，随着修复的进行，蛋白酶活性略有变化，但变化幅度不大。土壤蛋白酶活性的增加可能是因为土壤中有效氮素为微生物提供营养，使得微生物总数增多，但变化不明显。

在修复初始阶段，土壤脱氢酶活性有所增加；随着修复的进行，活性变化反而不明显；到了修复后期，活性几乎无变化。脱氢酶在生物修复的初始阶段作用非常显著，它可以活化有机物中的氢原子，使石油污染物发生氧化，同时也由于高效降解菌的添加使得微生物总数有所增加，从而导致土壤脱氢酶活性增加，与王靖等［21］关于微生物总数与土壤脱氢酶活性的结论具有一致性。随着修复的进行，易降解的石油类物质减少，微生物总数也随之下降，因此脱氢酶活性增加缓慢。

随着修复的进行，土壤过氧化氢酶活性有较大的增长趋势，到了修复后期，酶活性的增长速率开始下降，但仍然呈现增强的趋势。过氧化氢酶活性可以反映土壤除去呼吸过程中产生的过氧化氢的能力，若过氧化氢一直积累却始终得不到分解，将会对土壤中的微生物产生毒害作用。在修复初始阶段，一定浓度的石油污染物可以作为底物碳源，被与过氧化氢酶有关的土壤微生物利用，从而使酶活性有所增强，过氧化氢得到降解，此时，土壤中微生物总数有所增加，从而使得过氧化氢酶活性增强；随着修复的进行，土壤中可利用的碳源减少，使得与这种酶相关的微生物的数量稍有减少，从而使过氧化氢酶活性的增长速率下降。

在修复初始阶段，土壤多酚氧化酶活性有所增加；随着修复的进行，酶活性增加的速率变大；到了修复后期，酶活性增长的速率有所下降，但始终呈现增强的趋势。多酚氧化酶是石油氧化分解过程中具有重要功能的一类酶［22］，其活性与土壤中酚的含量成正相关。在石油污染土壤的生物修复过程中，会产生多种酚类物质，从而刺激微生物产生多酚氧化酶，提高了土壤中多酚氧化酶的活性。在修复初期，一定浓度的石油作为底物被与多酚氧化酶相关的微生物所利用［17］，从而促进石油的降解，使得酶活性有所增强，酶活性的增强在一定程度上是微生物总数增多的表现；随着修复的进行，多酚氧化酶活性增加的速率加快，是因为在修复过程中不断产生酚类物质，刺激微生物产生大量的多酚氧化酶，而且随着石油污染物的降解，削弱了高浓度石油污染物对多酚氧化酶活性的抑制作用，从而使得酶活性有所增强；到了修复末期，由于土壤中多酚类有毒物质的积累［23］影响到了微生物的数量，从而使酶活性增长的速率有所下降。

2.3 土壤修复过程中石油降解率的变化

在优化降解条件下，对石油污染土壤进行28d原位修复，每隔7d测定1次石油降解率，实验结果示于图2。

由图2可知，在修复初始阶段，投加高效降解菌的土壤的石油降解率没有明显的提高；随着修复的进行，石油降解速率加快；到了修复末期，石油降解速率有所下降，但仍然呈现增大的趋势。在土壤修复初始阶段，高效降解菌首先要适应环境，而且接种数量有限，使得石油降解率没有明显提高；此时微生物总数没有快速增加，因为在这一阶段高效降解菌比较容易利用石油污染物作为能源和碳源，在降解过程中发挥主导作用，从而抑制土著微生物的活性和生物可利用性［24］。随着修复的进行，一定浓度范围的石油污染物可以促进土壤微生物的生长增殖；此时微生物总数急剧增加，微生物的增长速率最快，最有利于石油污染物的降解。到了修复末期，由于可利用碳源减少，以及有毒有害物质积累，使得微生物总数有所减少，石油降解速率逐渐下降。

图2 土壤修复过程中石油降解率随时间的变化Fig.2 The variety of oil degradation rate with time during remediation of oil contaminated soil

2.4 土壤修复过程中微生物数量、土壤酶活性和石油降解率的相关性分析

2.4.1 微生物数量与石油降解率的相关性

根据修复过程中微生物数量和石油降解率的变化（表1和图2），采用SPSS18.0分析软件建立微生物（细菌、真菌和放线菌）数量和石油降解率之间的相关性，结果列于表2。

表2 土壤修复过程中石油降解率和微生物数量的相关性分析Table 2 Correlation analysis between oil degradation rate and microbial populations during remediation of oil contaminated soil

由表2可知，微生物总数变化和石油降解率之间相关性非常显著，相关性系数为0.977。由此可知，微生物总数越多，越有利于石油污染物的降解，与刘敬奇等［5］的研究结果一致。

细菌数量和石油降解率之间相关性非常显著，相关性系数为0.989，细菌数量越多越有利于石油污染物的降解。Sathishkumar等［25］研究表明，细菌比真菌和放线菌更能有效地降解石油，且土壤中本身存在的细菌由于能够利用范围很宽的石油污染，因此随着细菌数量的激增，石油降解率显著增加。

真菌和放线菌数量与石油降解率之间相关性不显著，可能是因为真菌和放线菌在土壤中的数量有限，也可能是因为真菌和放线菌降解石油污染物中的难降解组分，从而对石油降解率的贡献不大。

2.4.2 土壤酶活性与石油降解率的相关性

采用SPSS18.0分析软件建立土壤酶活性和石油降解率之间的相关性，结果列于表3。

表3 土壤修复过程中石油降解率和土壤酶活性的相关性分析Table 3 Correlation analysis between oil degradation rate and soil enzyme activity during remediation of oil contaminated soil

由表3可知，脲酶活性、脱氢酶活性和多酚氧化酶活性与石油降解率之间的相关性非常显著，相关性系数大于0.96。土壤中一定浓度的石油可以作为碳源被土壤中与脲酶活性、过氧化氢酶活性和多酚氧化酶活性有关的微生物所利用（见2.3节），且随着土壤中可利用碳源的减少，使得与这些酶相关的微生物的数量相应减少，表现为酶活性的下降，最终导致石油降解率的下降。

由表3还可知，蛋白酶和脱氢酶活性与石油降解率之间的相关性显著，相关性系数分别为0.944和0.934。蛋白酶和脱氢酶在石油污染土壤修复过程中酶活性变化不显著（见2.3节）可能与这些酶相关的微生物数量变化不显著有关。

3 结 论

（1）石油污染土壤中微生物总数、细菌数量、脲酶活性、过氧化氢酶活性和多酚氧化酶活性与石油降解率的相关性非常显著，且呈正相关关系；因此在修复时应致力于提高微生物总数、细菌总数以及增强脲酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶活性，以达到高石油降解率。

（2）蛋白酶和脱氢酶活性变化与石油降解率呈显著正相关关系，因此在修复石油污染土壤时可以提高蛋白酶和脱氢酶活性，以达到提高石油降解率的目的。

（3）真菌数量和放线菌数量变化与石油降解率的相关性不显著。

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