姜黄素抑制Wnt 信号通路对人胰腺癌细胞增殖凋亡的影响

李立方，苏银玲，任学群

(河南大学 淮河医院，河南 开封 475004)

胰腺癌是较常见的消化系统恶性肿瘤，该疾病的早期诊断十分困难，多数新发病例已存在周围器官侵犯和/或远处转移，手术切除率不到30%，5年生存率低于5%［1］.胰腺癌的发病率仍呈逐年上升趋势，2009年美国在因肿瘤致死疾患中居第4位［2］.姜黄素是从姜科植物姜黄的地下根茎中提取的一种多酚类色素，是一类具有多种生物学效应的天然活性物质，其药理作用广泛，能够抗炎、抗氧化、抗诱变、降血脂及抗动脉粥样硬化.近年来，国内外学者发现姜黄素能够同时参与多重抗肿瘤生长增殖的途径，影响肿瘤发生发展的多个环节与步骤，具有直接和间接的抗肿瘤作用［3－6］.本研究以不同浓度姜黄素作用于人胰腺癌细胞SW1990，观察其对SW1990 细胞生长、增殖、凋亡及对Wnt 信号传导通路中核心蛋白β－catenin 水平和下游相关靶基因c－myc、VEGF、cyclinD1 表达的影响.

1 材料与方法

1.1 材料

人胰腺癌SW1990 细胞株(中国科学院上海生物研究所细胞库)，姜黄素纯度＞98%(国家标准物质网－北京世纪奥科生物技术有限公司)，用二甲基亚砜(DMSO)培养基稀释成5mmol/L，等量分装，－20℃保存.MTT 试剂盒购自Sigma 公司，Annexin V－FITC 凋亡检测试剂盒由贝博试剂提供.RPMI1640 培养基，胎牛血清为Biowest 产品.β－catenin 抗体为Cell－Based Cell signaling technology 公司产品.PCR 相关试剂由天根生化科技(北京)有限公司提供.酶标仪(F200)为瑞士Tecan 公司产品，流式细胞仪(Accuri C6)为 美国BD 公司产品，凝胶成像系统及PCR 仪购自美国Bio－rad 公司，WB 等相关设备购自上海天能科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

SW1990 细胞培养于含100 mL/L 胎牛血清的RPMI1640 培养基，在37 ℃、CO2浓度为50 mL/L 的 二氧化碳培养箱中培养，每48 h 换液传代1 次.

1.2.2 四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色试验

设对照组和加用姜黄素组(20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L 姜黄素)，取对数生长期细胞，常规胰酶消化后用含100 mL/L 胎牛血清RPMI1640 培养液制成单细胞悬液，接种于96 孔培养板，每孔100 μL(含约5×103个细胞)，待细胞贴壁后去培养液并加药，同时取等量的DMSO 作为对照组，每组设6 个复孔，另设6 个调零孔(不加细胞，只加100 μL 培养液)，继续培养48 h.弃上清，每孔加入含MTT 10 μL 的培养液100 uL，4 h 后终止培养，弃上清液，每孔加入150 μL 的DMSO，置水平摇床上震荡10 min，以凋零空调零，在酶标仪(Tecan F200)上测492 nm 波长的吸光度(OD)值，计算各组药物浓度的抑制率及半抑制浓度(IC50)，试验重复3 次并取平均值.

1.2.3 流式细胞仪检测姜黄素诱导SW1990 细胞凋亡

取对数生长期细胞，常规胰酶消化后用含100 mL/L 胎牛血清的RPMI1640 培养液制成单细胞悬液，计数后种于六孔板中，每孔约含2* 105个细胞，待细胞贴壁后去培养液并加药，分别加入2 mL 含有0、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L 姜黄素的培养液，培养48 h 后，用不含EDTA 的胰酶消化离心收集细胞，用冷的PBS 洗涤细胞两次.然后用400 μL 1X Annexin V 结合液悬浮细胞，在细胞悬液中加入5 μL Annexin V－FITC 染色液，轻轻混匀后避光孵育15 min，后加入10 μL PI 染色液避光孵育5 min，在1 h 内用流式细胞仪(Accuri C6)检测.

1.2.4 免疫印迹法(Western blot)检测核心蛋白β－catenin 的表达

取对数生长期的人胰腺癌细胞SW1990，以5×105个/mL 的密度接种于培养瓶中培养.分别以加入0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L 姜黄素的培养液，培养48 h 后按胞浆蛋白提取试剂盒说明方法裂解细胞膜，收集胞浆蛋白.然后各组取等质量胞浆蛋白上样，采用5%的浓缩胶，8%分离胶进行SDS－PAGE 电泳，转膜，洗膜5 次，每次3 min，加入封闭液并封闭1 h.加入新鲜配制的1∶1000 稀释兔抗β－catenin 及β－actin 单克隆抗体，4 ℃孵育过夜.洗涤液洗膜3 min×3 次，加入相应二抗1∶1500 稀释(辣根过氧化物酶标记马抗兔IgG 抗体)，37 ℃平缓摇动1 h.用ECL 化学发光试剂盒中的A、B 液等量混匀洒在膜上，放入X 光片盒中进暗室曝光.用Image J 图像分析软件进行分析.

1.2.5 半定量RT－PCR 检测不同浓度姜黄素对胰腺癌SW1990 细胞中c－myc、VEGF、cyclinD1 mRNA 的影响

提取总RNA，并合成cDNA 第一条链，总反应体系25 μL.各条引物序列如下c－myc:5'－CCAGGACTGTATGTGGAGCG－3'，5'－CCTGAGGACCAGTGGGCTGT－3';VEGF:5'－GCAGAATCATCACGAAGTGGT－3'，5'－CATTTGTTGTGCTGTAGGAAGC－3;cyclinD1:5'－ATCTACACCGACAACTCCATCC－3'，5'－GCATTTTGGAGAGGAAGTGTTC－3';β－actin:5'－AGAGCTACGAGCTGCCTGCTG－3'，5'－AGTACTTGCGCTCAGGAGGA－3'.

上述引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成.将PCR 产物用2%浓度的琼脂糖进行凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察电泳带及其位置，摄影，Image J 软件将图像转换成灰度值.对各条带灰度值与β－actin 条带灰度值的比值进行分析.

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0 软件进行统计学处理，所有计量资料均用均数±标准差(珋±s)表示，组间比较采用单因素方差分析(One－way ANOVA)，相关性检验采用Pearson 相关分析，P≤0.05 差异有统计学意义.

2 结果

2.1 MTT 法检测姜黄素对SW1990 细胞增殖的影响

按下列公式计算生长抑制率:生长抑制率(IR%)=(1－加药组平均A 值/对照组A 值)×100%，经不同浓度的姜黄素处理48 h 后，SW1990 细胞生长受到不同程度的抑制，随药物浓度的增大，抑制率逐渐增高，呈现剂量依赖性关系(r=0.96，P＜0.05).各浓度组细胞增殖抑制率与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，各浓度组间比较亦有统计学意义(P＜0.05，图1).经计算得出IC50=56.74 μmol/L.

2.2 流式细胞仪测姜黄素对SW1990 细胞凋亡的影响

图1 不同浓度姜黄素作用于胰腺癌细胞SW1990 48h 后的生长抑制率曲线

SW1990 细胞在培养瓶中贴壁生长，呈多角形，在姜黄素作用下，它们生长速度减慢，形态发生改变，部分细胞变圆，脱壁.用0、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L 姜黄素 处理作用48 h 后，其凋亡率分别为8.1%、11.7%、16.3%、28.1%、37.5%、56.8%，呈现浓度依赖性(r=0.96，P＜0.05).各浓度组细胞凋亡率与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，各浓度组间比较亦有统计学意义(P＜0.05，图2).

图2 不同浓度姜黄素对胰腺癌SW1990 细胞凋亡率的影响

2.3 免疫印迹法(Western blot)检测姜黄素对SW1990 细胞核心蛋白β－catenin 的表达水平的影响

经0、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L 姜黄素作用48 h 后的实验组细胞，胞浆β－catenin 蛋白含量低于空白对照组(见图3).在SW1990 细胞中，除20 μmol/L 浓度组外，其他浓度组与空白对照组比较均有统计学意义(P＜0.05).药物浓度越大，胞浆β－catenin 蛋白含量越少，呈剂量依赖性(r=－0.96，P＜0.05).

图3 姜黄素对SW1990 细胞内β－catenin 蛋白表达水平的影响.(con 为对照组)

2.4 半定量RT－PCR 检测姜黄素对Wnt/β－catenin 信号通路下游靶基因mRNA 表达水平的影响

经0、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L 姜黄素作用后的SW1990 细胞，c－myc、VEGF、cyclinD1 mRNA 表达量较空白对照组均减少，且呈剂量依赖性(r=－0.99，－0.92，－0.93，P＜0.05).在SW1990 细胞中，c－myc mRNA 的表达在浓度为20 μmol/L 时与空白对照组比较无统计学意义(P＞0.05)，其余浓度组与空白对照组比较、其余浓度组之间比较均有统计学意义(P＜0.05);VEGF mRNA 的表达，20 μmol/L 组与空白对照组、40 μmol/L 组进行比较无统计学意义(P＞0.05)，其余浓度组与空白对照组、其余浓度组之间比较均有统计学意义(P＜0.05).cyclinD1 mRNA 的表达，各浓度组与空白对照组、其余浓度组之间比较均有统计学意义(P＜0.05，图4).

3 讨论

图4 姜黄素对Wnt 靶基因mRNA 表达水平的影响.(M 为DNA Marker，con 为对照组)

Wnt/β－catenin 信号通路是常见且研究得较为透彻的Wnt 通路，又称为经典通路［7］.正常情况下当该信号通路未被激活时，胞质的β－catenin 与APC、轴蛋白(axin)、GSK－3β 结合经酪蛋白激酶(CK)1α 和GSK－3β 磷酸化，并经泛素化降解，以维持胞质低水平的游离β－catenin.Wnt 信号通路异常激活时，Wnt 与细胞膜受体卷曲蛋白(Fz)、低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)5/6 结合形成受体复合体，通过Fz 将信号转导至胞质散乱蛋白(Dsh)，后者通过抑制GSK－3β 以阻止β－catenin 的磷酸化降解，致胞质β－catenin 聚集并转运至细胞核，并形成转录活性复合体，启动下游靶基因如原癌基因c－myc、cyclinD1、VEGF 等的转录，致细胞过度增殖，由此参与肿瘤的发生发展［8－10］.

姜黄素(curcumin，Cur)来源于食品，具有价廉，毒性低，抗癌谱广、不良反应小等优点，最近被肿瘤学家们认为是一种潜在的第3 代抗癌化疗药物［11，12］.姜黄素抗癌作用的机制是多方面的，其中诱导肿瘤细胞凋亡可见于多种肿瘤的研究中，但其诱导机制仍不是很清楚，关于姜黄素对经典Wnt 信号通路活性的调控作用的报道甚少.我们的研究结果说明，姜黄素能有效抑制人胰腺癌细胞株SW1990 的增殖，细胞增殖活力随姜黄素药物浓度增大而不断下降，其抑制作用程度呈剂量依赖性.既往实验发现，姜黄素能够通过激活过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)和增强BTG2 mRNA 的表达而下调CyclinD1(CyclinD1 在多种肿瘤细胞中过量表达，能够介导细胞从G1 期向S 期过渡［13］)从而抑制肿瘤细胞生长［14，15］.除影响肿瘤细胞周期外，姜黄素还可能通过降低肿瘤细胞的抗凋亡蛋白(如c－myc、bcl－2、bcl－xl 等)水平和提高凋亡蛋白(Fas)水平从而诱导肿瘤细胞凋亡［16，17］.除此之外，姜黄素能够抑制肿瘤细胞EGFR 的表达、促进Caspase－3 的活化等抑制肿瘤细胞的存活与生长，诱导其凋亡［18，19］.本研究中，PCR 实验结果表明姜黄素可以下调人胰腺癌细胞SW1990 中c－myc、VEGF、cyclinD1 mRNA 的表达.但Wnt 途径肯定不是姜黄素抑制效应的主要或者唯一途径，还需一系列的实验来进一步的研究.

总之，恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一，其发生、发展是一个多因素作用、多基因参与和多阶段经历才最终形成的极其复杂的生物学过程，但目前尚无非常理想的抗肿瘤药物.虽然原有药物不断改进发展，新药不断开发问世，但其疗效、安全性等仍未能达到令人满意的效果［20，21］.寻找新的抗肿瘤分子靶位、提高肿瘤治疗的临床疗效等方面越来越受到关注，信号通路在肿瘤发生、发展中起着重要作用，故继续进一步探究其各组分及相互作用机制，开发该通路特定靶点有效拮抗剂，无疑将对抗肿瘤药物的发展产生巨大的影响，有望开拓肿瘤治疗的一个新局面.

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，Hao Y，et al.Cancer statistics，2008［J］.CA Cancer J Clin，2008，58:71－96.

［2］Jemal A，Siegel R，Ward E，Hao Y，et al.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2009，59:225－249.

［3］Goel A，Aggarwal BB.Curcumin，the golden spice from Indian saffron，is a chemosensitizer and radiosensitizer for tumors and chemoprotector and radioprotector for normal organs［J］.Nutr Cancer，2010，62:919－930.

［4］Reuter S，Eifes S，Dicato M，Aggarwal BB，et al.Modulation of anti－apoptotic and survival pathways by curcumin as a strategy to induce apoptosis in cancer cells［J］.Biochem Pharmacol，2008，76:1340－1351.

［5］Tharak an ST，I namoto T，Sung B，Aggar wal BB，et al.Curcumin potentiates the antitumor effects of gemcitabine in an orthotopic model of human bladder cancer through suppression of proliferative and angiogenic biomarkers［J］.Biochem Pharmacol，2010，79:218－228.

［6］Cheng CY，Lin YH，Su CC.Curcumin inhibits the proliferation of human hepatocellular carcinoma J5 cells by inducing endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction［J］.Int J Mol Med，2010，26:673－678.

［7］Vincan E.Frizzled/WNTsignalling:the insidious Promoter of tumour growth and Progression［J］.Front Biosci，2004，9:1023－1034.

［8］Luo J，Chen J，Deng ZL，et al.Wnt signaling and human diseases:what are the therapeutic implications［J］.Lab Invest，2007，87(2):97－103.

［9］Clevers H.Wnt/beta－catenin signaling in development and disease［J］.Cell，2006，127(3):469－480.

［10］Klaus A，Birchmeier W.Wnt signalling and its impact on development and cancer［J］.Nat Rev Cancer，2008，8(5):387－398.

［11］汪海慧，成扬.姜黄素药理作用研究进展［J］.上海中医药大学学报，2007，21(6):73－76.

［12］陈宏，陈宇英，张振书，等.姜黄素抗大肠癌作用研究［J］.肿瘤研究与临床，2006，18(1):4－7.

［13］Aoki H，Takada Y，Kondo S，et al.Evidence that curcumin suppresses the growth of malignant gliomas in vitro and in vivo through induction of autophagy:Role of Akt and ERK signaling pathways［J］.Mol Pharmacol，2007，72(1):29－39.

［14］Aggarwal BB，Banerjee S，Bharadwaj U，et al.Curcumin induces the degradation of cyclin E expression through ubiquitindependent pathway and up－regulates cyclin－dependent kinase inhibitors p21 and p27 in multiple human tumor cell lines.Biochem pharmacol，2007，73(7):1024－1032.

［15］Kwon YK，Jun JM，Shin SW，et al.Curcumin decreases cell proliferation rates through BTG2－mediated cyclin D1 down－regulation in U937 cells［J］.Int J Oncol，2005，26(6):1597－1603.

［16］Anto RJ，Mukhopadhyay A，DenningK，et al.Curcumin(diferuloylmethane)induces apoptosis through activation of caspase－8，BID cleavage and cytochrome c release:its suppression by ectopic expression of bcl－2 and bcl－xl［J］.Carcinogenesis，2002，23(1):143－150.

［17］吴勇，陈元仲，许建华，等.姜黄素对人类Burkitt 淋巴瘤抗癌作用的研究［J］.中华肿瘤杂志，2002，24(4):348－351.

［18］Lev－Ari S，Starr A，Vexler A，et al.Inhibition of pancreatic and lung adenocarcinoma cell survival by curcumin is associated with increased apoptosis，down－regulation of COX－2 and EGFR and inhibition of Erk1/2 activity［J］.Anticancer Res，2006，26(6B):4423－4430.

［19］Su CC，Lin JG，Li TM，et al.Curcumin－induced apoptosis of human colon cancer colo 205 cells through the production of ROS，Ca2+and the activation of caspase－3［J］.Anticancer Res，2006，26(6B):4379－4389.

［20］Ghosh JC，Altieri DC.Aetivation of P53－dependent apoptosis by acute ablation of glyeogen synthase kinase－3beta in colorectal cancer cells［J］.Clin Cancer Res，2005，11:4580－588.

［21］Bazzi H，Fantauzzo KA，Richardson GD，Jahoda CA，et al.The Wnt inhibitor，DiekkoPf 4，is induced by canonical Wnt signaling during ectodermal appendage morphogenesis［J］.Dev Biol，2007，305:498－507.