同位素内标-多反应监测同步在线质谱全扫描确证火锅料中罂粟壳成分

祝伟霞， 孙转莲， 袁 萍， 杨冀州 ， 刘亚风， 孙武勇

（河南出入境检验检疫局，河南 郑州450003）

罂粟壳中残留约0.2% 的吗啡和其他生物碱，该浓度含量的生物碱对吸毒者不起作用，但不法分子将其掺入火锅料或调味品吸引消费者，食客吃了这种食品易产生依赖性成瘾。长期食用含有罂粟生物碱的食物会对人类的神经系统、消化系统、内分泌系统造成危害。早在20 世纪90 年代，卫生部、公安部、工商局联合发布了〔91〕第32 号《关于查处在食品中使用罂粟壳（籽）等违法行为的通知》，组织各地依法查处罂粟壳火锅。食品整治办〔2008〕3 号公布《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第一批）》，将火锅料中非法添加罂粟壳作为重点监测项目（http:／／www.moh.gov.cn／sps／s7892／201406／38e5c8a53615486 888d93ed05ac9731a. shtml）。为了有效地监督我国火锅料的质量安全，建立一种准确可靠的罂粟生物碱确证分析方法非常必要。

近年来，为了监控毒品交易，研究者在吸毒者毛发［1］、血液［2］、尿液［3］、唾液［4］等生物样本中开展吗啡、可卡因、可待因等违禁生物碱的筛查，常采用分子生物学方法［5］、气相色谱-质谱联用法［6］、液相色谱-荧光检测法［7］、液相色谱-质谱法［2-4，8］分析罂粟生物碱。鉴于我国食品安全的现状，国内研究者率先建立了液相色谱-质谱法［9，10］测定火锅中吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁等5 种违禁生物碱的分析方法，并发布1 项地方标准［11］。这些方法均是采用液相色谱-质谱的多反应监测（MRM）技术分析食品中5 种违禁生物碱。但采用MRM 技术检出的火锅料阳性结果不能获得其质谱全扫描确证信息，易产生假阳性结果。本文将样品在模拟食用模式下浸泡提取罂粟壳中5 种标志性生物碱，阳离子混合模式固相萃取净化，采用MRM 同步在线增强子离子全扫描技术（EPI），根据其质谱信息实现了低浓度目标物的定性鉴定，解决了火锅料中5 种特征生物碱阳性确证难题；同时采用同位素内标跟踪准确定量，为执法部门提供了可靠的技术保障。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪（美国Waters 公司），API 5500Q 液相色谱-质谱仪（配QTrap 线性离子阱质谱，美国Applied Biosystems 公司）；SA-31 振荡器（日本大和公司）；CF15RXII 离心机（日本Hitachi 公司）；24 位固相萃取装置（德国CNW 公司）；N-EVAP112 氮吹仪（美国Organomation Associates 公司）；Oasis MCX 柱（6 mL／150 mg，美国Waters 公司）；0.2 μm 有机相滤膜（天津津腾公司）；吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可丁、20 mg／L 吗啡D3 和可待因D3 混合标准溶液（中国食品药品检定研究院）；甲醇和乙酸乙酯（色谱纯，美国Fisher 公司）；冰乙酸和乙酸铵（色谱纯，美国Sigma-Aldrich 公司）；浓氨水、浓盐酸均为市售分析纯试剂；水为Millipore 纯水系统制得的高纯水（电阻率≥18 MΩ·cm）。

1.2 溶液的配制

分别称取标准品10 mg 于100 mL 容量瓶中，加入甲醇-水（1∶1，v／v）溶解并定容至刻度，得到质量浓度为100 mg／L 的单标准储备溶液，于-18 ℃下冷冻保存，有效期为6 个月。取上述单标准储备液，用甲醇-水（1 ∶1，v／v）稀释成质量浓度为1 mg／L 的混合工作溶液，放入冰箱中于2 ～4 ℃下储存，有效期为1 个月。基质标准工作溶液:按照操作方法所述制得空白样品提取液，使用前用其稀释混合标准溶液制成合适浓度的标准工作溶液。同位素内标溶液:取适量吗啡D3 和可待因D3 标准溶液，用甲醇-水（1∶1，v／v）配制成质量浓度为0.8 mg／L工作溶液。0.125 mol／L 盐酸溶液:将11.25 mL 浓盐酸定容到1 000 mL 水中即得。5% 氨化乙酸乙酯-甲醇（1∶1，v／v）:取5 mL 氨水加入至95 mL 乙酸乙酯-甲醇（1∶1，v／v）混合液中即得。5 mmol／L乙酸铵甲醇:称取0.385 g 乙酸铵加入1 mL 水溶解后，用1 L 甲醇稀释即得。10 mmol／L 乙酸铵溶液（pH 3.6）:称取0.77 g 乙酸铵加入700 水溶解，用冰乙酸调pH 3.6，用水定容至1 L 即得。

1.3 仪器条件

色谱柱:CAPCELL PAK ST （150 mm × 2.1 mm）；柱温:35 ℃；流动相:5 mmol／L 乙酸铵甲醇（A）与10 mmol／L 乙酸铵溶液（pH 3.6）（B）；梯度洗脱程序:0 ～1.0 min，10% A；1.0 ～3.0 min，10% A ～90% A；3.0 ～6.0 min，90% A；6.0 ～6.1 min，90% A ～10% A；6.1 ～10.1 min，10% A。Vaclo 六通阀位置:0 ～1.0 min 至废液，1.0 ～6.0 min进质谱；6.1 min 后至废液。流速:0.3 mL／min；进样量:10 μL。

电喷雾离子源正离子电离（ESI ＋）MRM 模式；雾化气压力:413.7 kPa （60 psi）；气帘气压力:172.4 kPa （25 psi）；喷雾电压:5 000 V；去溶剂温度:550 ℃；去溶剂气压力:344.8 kPa （50 psi）；碰撞气压力:69 kPa （10 psi）；每个离子对驻留时间:100 ms；去簇电压（DP）:80 V；每种化合物的检测离子对、碰撞室出口电压（CXP）、射入电压（EP）、碰撞能量（CE）等质谱参数见表1。在线全扫描条件:每次选择2 个最强峰，动态背景扣除，不排除前级扫描过的离子，扫描强度阀值为3 000 cps，EPI扫描范围为m／z 50 ～450，在CE 为35 eV 下扫描，其他质谱参数同MRM 模式，用标准溶液在MRMEPI 方法下获得子离子扫描质谱图，并建立质谱标准图库，供5 种生物碱定性检索用。

表1 5 种生物碱的质谱参数Table 1 MS parameters of the five alkaloids

1.4 样品前处理

称取5.0 g 试样于50 mL 具塞离心管中，加入50 μL 同位素内标工作溶液，加入25 mL 0.125 mol／L 盐酸溶液，涡旋1 min 后，于80 ℃水浴中加热提取30 min，每隔10 min 涡旋混匀1 min，取出冷却至50 ℃左右，缓慢加入10 mL 正己烷，涡旋混匀2 min，于4 000 r／min 下离心10 min，弃去上层溶液，待净化。

MCX 柱依次用6 mL 甲醇、6 mL 水、6 mL 稀盐酸溶液活化后，将10 mL 样液上载至固相萃取柱中，待样液全部流出后用6 mL 水、6 mL 甲醇淋洗，柱体保持抽干5 min，然后用5 mL 氨化乙酸乙酯-甲醇混合液洗脱，收集洗脱液并用氮气流浓缩至干，加入1 mL 5 mmol／L 乙酸铵甲醇-10 mmol／L 乙酸铵（pH 3.6）（1∶9，v／v）溶解残渣，经滤膜过滤后进行仪器测定。

2 结果与讨论

2.1 罂粟生物碱分析对象的选择

为了确定罂粟中主要的生物碱，本方法将粉碎后的罂粟壳0.1 g 加入10 mL 1% （v／v）乙酸提取后进行仪器测定，测定结果经归一化计算，检出吗啡50.2%、可待因8.6%、罂粟碱5.0%、那可丁35.5%、蒂巴因0.5%、原阿片碱0.2%。因此本方法将含量较高的吗啡、那可丁、可待因、罂粟碱、蒂巴因作为火锅料中违禁添加罂粟壳的特征标志物。

2.2 提取方法的选择

火锅料富含多种动植物油脂及辛辣物质，样品均匀性差。目前提取火锅料主要采用有机溶剂、强酸或弱酸缓冲液等方法。本方法将阴性火锅料样品添加罂粟壳后，分别试验了乙腈、稀盐酸溶液、pH 5.2 的乙酸铵溶液的提取效果，结果表明稀盐酸溶液的测定值最高（吗啡135.2 μg／kg、可待因27.5 μg／kg、蒂巴因1.3 μg／kg、罂粟碱11.6 μg／kg、那可丁75.4 μg／kg）；乙腈提取时蒂巴因未检出，吗啡、可待因、罂粟碱和那可丁的测定结果均较稀盐酸低35% 左右；乙酸铵溶液提取时吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁均低12% 左右。因此本方法选用稀盐酸作为提取溶液。

因火锅料食用方法特殊，研究又考察了稀盐酸溶液在不同温度下5 种生物碱的提取效果，结果表明温度越高，生物碱提取效率越高，在80 ℃时达到最高，升温至100 ℃，测定值不变。同时加热时间延长，生物碱的测定值也呈线性增加，30 min 时最佳。因此本方法选择于80 ℃下提取30 min。

2.3 净化方法的优化

火锅料中罂粟生物碱的提取和净化主要采用液液萃取、QuEChERS 和固相萃取等方法。液液萃取是在碱性条件下采用氯仿、乙醚或乙酸乙酯液液萃取，该方法操作复杂，主要用于常规含量样品的分析。本实验考察了QuEChERS 法净化5 种生物碱的效果。样品经乙腈提取后，经硫酸镁、C18、PSA填料净化后直接测定。该方法操作简单，但基质干扰物多，净化效果差，5 种生物碱回收率均在40% 左右。本实验还考察了3 种固相萃取柱的净化效果:1.pH 8.5 的弱碱性溶液过亲水-亲脂平衡SPE 柱（HLB）；2.稀盐酸溶液过强阳离子SPE 柱（MCX）；3.乙酸铵缓冲液过弱阳离子SPE 柱（WCX）。结果表明以上3 种SPE 方法对待测生物碱均有较好的富集，试剂标准溶液过柱的洗脱回收率均大于90%；但受样品基质的影响，HLB 柱和WCX 柱对火锅料中的目标物回收率为44.1% ～72.5%，而MCX柱的回收率为73.8% ～94.3%。因此本方法选用MCX 柱作为SPE 净化柱。在该SPE 方法中，5 种待测生物碱与固相萃取填料之间发生阳离子交换作用，反应速度慢，因此在进行固相萃取操作过程中，要控制样液流速小于1 mL／min。

采用添加1.0 mg／kg 的阳性样品试验了5% 氨化甲醇、5% 氨化乙酸乙酯、5% 氨化乙酸乙酯-甲醇（1∶1，v／v）等不同溶剂的洗脱效率。分析结果表明9 mL 5% 氨化甲醇、12 mL 5% 氨化乙酸乙酯、5 mL 5% 氨化乙酸乙酯-甲醇可完全洗脱5 种生物碱。最终本方法选择5 mL 5% 氨化乙酸乙酯-甲醇作为净化柱的洗脱溶剂。

2.4 标准溶液的稳定性考察

为了考察标准溶液的稳定性，在1 年时间内测定了标准储备液的稳定性（见图1）。结果表明，180天内5 种生物碱测定值的相对标准偏差小于0.05%；吗啡和可待因240 天、那可丁和罂粟碱300天时开始降解；蒂巴因在360 天内稳定，测定值的RSD 为0.04%。

图1 标准储备液在不同贮存时间的测定结果Fig.1 Determination results of standard stock solution at different storage times

2.5 定量方法的优化

质谱的电喷雾电离模式易产生基质效应。为了考察本方法的基质效应，分别制得试剂标准溶液与基质标准溶液，对比结果发现，5 种生物碱均有基质抑制现象，吗啡和罂粟碱的信号响应降低1／2，可待因、那可丁和蒂巴因均降低约4／5。由于每种火锅底料基质是唯一的，基质标准溶液很难制得，因此采用外标法定量时准确度差。为了弥补基质的电离抑制效应，本方法采用同位素内标法定量。

2.6 色谱条件的选择

5 种生物碱属极性到中等极性化合物，由于吗啡、可待因的两性电荷特征，2 种分析物在普通C18柱中易出现双峰，在高比例水相和有机相中均可被洗脱。方法试验了极性酰胺基柱（Amide）分离5 种生物碱的效果，5 种分析物在该体系中的保留行为与反相柱相反，水作为强洗脱液，增加其比例可使化合物的保留时间缩短，那可丁和罂粟碱峰形对称，但蒂巴因峰形拖尾，吗啡和可待因色谱峰宽达2 min，调节流动相的pH 为3.5 ～6.0 时，色谱峰未改善。采用CAPCELL PAK ST 柱分析5 种生物碱，结果发现5种分析物均获得对称的峰形，在梯度洗脱条件下，待测化合物保留时间主要在2.0 ～3.5 min 之间。

2.7 质谱参数的优化

采用1 mg／L 单标准溶液以流动注射的方式分别在正、负离子模式下进行母离子全扫描，确定化合物的分子离子。该类化合物的结构使其在正离子模式下易产生强信号［M ＋H］＋峰。再分别以待测物的准分子离子峰为母离子进行子离子全扫描。由子离子质谱图可以看到，吗啡和可待因具有相同的裂解模式，其子离子碎片均是以不稳定多环中间体C13H11O的中性丢失、电子重排获得；罂粟碱、那可丁、蒂巴因的特征碎片均以失去甲基或甲氧基为主要裂解方式［12］。方法选取丰度较强、干扰较小的两对子离子作为定性与定量离子，优化质谱参数时发现，DP 对5 种待测物影响小，在1 ～100 V 之间时响应强度相同，其他质谱参数见表1。

2.8 假阳性结果的确证

受火锅料基质的影响，在MRM 模式下分析时，吗啡常检出“阳性”，虽保留时间有差异，但样品中吗啡两个定性离子同时出现，仍然为定性造成困难。为了提高质谱测定结果的准确性，本方法采用线性离子阱串联质谱（Q-Ttrap MS）的在线EPI 全扫描技术，可同时获得其子离子质谱图进行对照分析。方法优化了非动态排除干扰进行扫描时的结果，表明该模式下质谱扫描选择性差；采用动态排除干扰后对最强峰进行扫描，以3 000 cps 作为信号阀值，子离子扫描目标性强，5 种生物碱含量在LOQ 水平时均可获得子离子扫描质谱图。将获得的子离子全扫描质谱图建立相应标准图库，样品分析完成时可自动检索定性，因此本方法减少了单一MRM 模式下的假阳性几率（见图2）。

图2 （a）吗啡标准溶液与（b）吗啡阴性样品质谱图Fig.2 Comparison of mass spectra of （a）morphine standard solution and （b）negative morphine sample

2.9 方法检出限、定量限、线性范围、添加回收率和精密度

将S／N ≥3 定义为LOD，S／N ≥10 定义为LOQ，本方法的LOD、LOQ、线性范围、线性方程（其中X 为分析物含量（μg／kg），Y 为分析物与内标物的峰面积比）分别为:吗啡的LOD 和LOQ 分别为0.5 μg／kg 和2 μg／kg，线性范围为1 ～200 μg／kg，线性方程为Y ＝0.051 7X ＋0.012 8（R ＝0.999 9）；可待因的LOD 和LOQ 分别为0.2 μg／kg 和1 μg／kg，线性范围为0.5 ～200 μg／kg，线性方程为Y＝0.054 9 X ＋0.002 29（R ＝0.999 9）；蒂巴因的LOD 和LOQ 分别为0.05 μg／kg 和0.2 μg／kg，线性范围为0.1 ～200 μg／kg，线性方程为Y ＝0.265X-0.012 7（R ＝0.999 9）；那可丁的LOD 和LOQ 分别为0.05 μg／kg 和0.2 μg／kg，线性范围为0.1 ～200 μg／kg，线性方程为Y ＝0.286X ＋0.12（R ＝0.999 5）；罂粟碱的LOD 和LOQ 分别为0.05 μg／kg 和0.2 μg／kg，线性范围为0.1 ～200 μg／kg，线性方程为Y ＝0.050 5X ＋0.124（R ＝0.999 7）。

在阴性麻辣火锅汤液、火锅底料、火锅调味料、火锅肉汤等样品中，分别添加LOQ、2 倍LOQ、4 倍LOQ 3 个水平的标准溶液，每个水平平行测定10次，内标法定量，由表2 可见回收率范围为64.2% ～110.6%，RSD 为4.2% ～12.5%。

表2 阴性样品中5 种生物碱的加标回收率和精密度Table 2 Recoveries and precisions of the five alkaloids spiked in blank samples

2.10 实际样品测定

采用该方法对691 个火锅料实际样品进行了检测，共检出9 个阳性样品，测定结果见表3；阳性样品均采用MRM 同步在线子离子扫描质谱方法确证，质谱图经标准数据库检索，匹配度达90% 以上，其特征碎片、离子丰度比、保留时间相同，可确认为阳性。图3 为其中1 个样品的MRM 色谱图和EPI质谱图。

表3 9 个阳性样品的检测结果Table 3 Results of nine positive samples

图3 阳性火锅样品的MRM 色谱图和EPI 质谱图Fig.3 MRM chromatograms and EPI mass spectra of a positive hot pot sample

3 结论

本研究在着重解决火锅底料中罂粟壳成分阳性确证问题的基础上，提出了酸溶液加热提取-固相萃取浓缩与净化的前处理方法，结合MRM-EPI 技术进行定性，同位素内标法定量，完成了罂粟壳中5 种特征生物碱的准确测定。该方法快捷可靠，可直接用于分析基质复杂的火锅料、调味品、肉汤等样品中的生物碱成分，并已成功应用于餐饮市场抽查样品的检测，为火锅料中违禁罂粟壳的监督提供了可靠的技术基础。鉴于目前仍然存在一些不法商家添加罂粟壳至食品中的现象，准确有效地检测火锅底料中禁用罂粟壳成分具有重要的现实意义。

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