4种嗜盐古菌发酵的龙头鱼鱼露特性比较*

高瑞昌，陆文婷，刘向东，崔恒林，袁丽

(江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江，212031)

鱼露(fish sauce)，又称鱼酱油，是闽菜、潮州菜和东南亚料理中常用的调味料之一。它是以小鱼虾为原料，利用鱼体所含的蛋白酶和其他酶以及在多种微生物共同参与下，对原料鱼中的蛋白质、脂肪等成分进行发酵酿制而成［1］。传统的天然发酵过程非常缓慢，这是限制其产量和规模的主要因素。某些嗜盐古菌作为外源添加物可以加快鱼露的发酵，其一，它与鱼中的微生物群落在发酵过程中起协同作用［2］;二，它能产生胞外蛋白酶，在高盐高渗的环境下催化蛋白质的水解，加速鱼露的发酵，而且不会有其他速酿方法产生不良风味等问题［3］。本文利用前期筛选出的4种具有良好产蛋白酶活性的嗜盐古菌进行鱼露发酵，通过对鱼露发酵过程中产生的亚硝酸盐、总胺、氨基酸态氮和挥发性风味物质等指标进行评价，以期挑选出更加适宜发酵鱼露的菌种，为鱼露的快速发酵提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

实验材料:TBN4-Halalkalicoccus tibetensis，TNN48-Halogranum rubrum，RO2-11-Halogranum rubrum，9738-Halomicrobiummukohataei，江苏大学食品与生物工程学院保藏菌种(课题组前期从台南盐田筛选，鉴定);龙头鱼，购自镇江欧尚超市。

实验设备:PHS-3C型pH计(LIDA)、LRH系列生化培养箱，上海一恒科技有限公司;SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司;电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司;722N可见分光光度计，上海精科;HP6890/5973气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司;顶空固相微萃取器SPMC-57328U，美国Agilent公司;自动氨基酸分析仪，德国sykamS433D/S433。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼露的制作

利用购自欧尚超市新鲜的龙头鱼，去除内脏，切碎，并加入20%的食盐，混匀，分别加入109CFU数量级 TBN4，TNN48，9739，RO2-11 菌种，并以未加入任何菌种含有20%食盐的鱼肉作为对照组，放置于37℃恒温培养箱进行发酵。发酵4.5月后，测定各鱼露的指标含量，并与新鲜原料鱼相比较。

1.2.2 理化指标的测定

氨基酸态氮(AAN)含量:甲醛滴定法［4］;总酸的测定，参考文献［5］;可溶性总氮(TSN):凯式定氮法［4］;组胺含量的测定，参考文献［6］。

亚硝酸盐含量:分光光度法［7］。称取经绞碎并混合均匀的样品20 g于100 mL烧杯中，加硼砂饱和溶液40 mL，搅拌均匀后，以70℃以上的热水100～150 mL将样品全部洗入250 mL容量瓶中，放入沸水浴中加热15 min，取出冷却后，边转动容量瓶边加入亚铁氰化钾溶液(106g/L)20 mL，摇匀后，再加入醋酸锌溶液(220 g/L)20 mL，以沉淀蛋白质。然后，加水至刻度，混匀，放置30 min后，弃去上层脂肪，清液用滤纸过滤，弃去初滤液5～10 mL，滤液备用。吸取上述滤液40 mL于50 mL容量瓶中，同时吸取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL NaNO2标准液(相当于 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg的NaNO2)分别置于50 mL容量瓶中，各加水至25 mL处。在样品管及标准管中分别加入0.4%对氨基苯磺酸溶液(4 g/L)4 mL，混匀后静置3～5 min，然后又在各管及标准管中分别加入0.2%盐酸萘乙二胺溶液(2 g/L)2 mL，加水至刻度，摇匀，静置15 min后，用1 cm的比色皿，以零管调节零点，于波长538 nm处，测吸光度，绘制标准曲线并查出待测液的亚硝酸盐含量。

亚硝酸盐(以NaNO2计)含量计算:

式中:X1—试样中NaNO2的含量，mg/kg;A1—测定用样液中NaNO2的质量，μg;m—试样质量，g;V1—测试用样液体积，mL;V0—试样处理液总体积，mL。

总胺值的测定［8］:在250 mL锥形瓶中，加入适量1～5 g试样(视胺值大小而定，称准至0.000 2 g)，然后加入50 mL无水乙醇，煮沸1 min，除去游离氨，冷却至室温，加入5滴0.2%溴酚蓝指示剂，用0.5 mol/L盐酸异丙醇溶液滴定至黄色为终点。总胺价(KOHmg/g)计算:

式中:C—HCl标准溶液浓度，mol/L;V—HCl标准溶液的用量，mL;M—试样质量，g;56.11—每摩尔KOH相当的质量，g。

挥发性盐基氮(TVB-N)含量的测定:微量扩散法［6］。称取10 g样品于锥形瓶中，加100 mL水，不时振摇，浸渍30 min后过滤，滤液置于冰箱中备用。将水溶性胶涂于扩散皿的边缘，在皿中央内室加入1 mL 2%硼酸吸收液及1滴0.2%甲基红乙醇溶液和0.1%亚甲蓝水溶液等体积混合指示液。在皿外室一侧加入1.00 mL样液，另一侧加入1 mL饱和碳酸钾溶液，注意勿使2滴接触，立即盖好;密封后将皿于桌面上轻轻转动，使样液与碱液混合。将扩散皿置于37℃温箱内放置2h，揭去盖，用0.01 mol/L HCl标准溶液或硫酸标准溶液滴定，终点呈蓝紫色。同时做试剂空白试验。

式中:X—样品中挥发性盐基氮的含量，mg/100g;V1—测定用样液消耗HCl或H2SO4标准溶液体积，mL;V2—试剂空白消耗HCl或H2SO4标准溶液体积，mL;N—HCl或H2SO4标准溶液的摩尔浓度，mol/L;m—样品质量，g;14—1 mol/L HCl或 H2SO4标准溶液1 mL相当氮的质量，mg。

1.2.3 游离氨基酸组成的测定

(1)鱼露样品脱盐

由于在制作鱼露时，加入20%盐，鱼露样品内盐含量过高，在测游离氨基酸组成时需先进行脱盐。

在一定量的鱼露样品中加入3%(重量)活性炭，于80℃下脱色30 min，趁热过滤得滤液浓缩至干为固形物，将固形物置于250 mL圆底烧瓶中内加一定量冰乙酸，小火加热，回流并不断搅拌，待固形物不再溶解后，将溶液趁热过滤并将滤液减压蒸馏除去溶剂可得混合氮基酸或向滤液内滴加8～10倍体积丙酮，则氨基酸会立即析出，过滤［9］。

(2)自动氨基酸仪分析［10］

称取一定量样品，加入9倍体积1%的磺基水杨酸，10 000 r/min 离心 15 min，取上清液用 0.22 μm滤膜过滤，供上机使用。

1.2.4 挥发性风味物

(1)顶空固相微萃取(SPME)方法［11-12］

先要将顶空固相微萃取头插入气相色谱进样口，高温老化至无杂峰。将5 mL鱼露样品放入15 mL封闭瓶中于50℃加热平台上保持10 min，将 SPME萃取头插入瓶中，使之与样品液面保持一定的距离，磁力搅拌速度为 100 r/min，50℃条件下萃取 40 min，与瓶内气体达到饱和。

(2)GC-MS参数条件

色谱柱:毛细管色谱柱 DB-WAX(60 m×0.25 mm，0.25 μm);进样口温度 250℃，SPME 插入进样孔解吸 3 min;程序升温:始温 40℃，保持 4 min，以5℃/min升温至90℃，再以10℃/min升温至230℃，保持10 min;载气(He)流速 1.0 mL/min，不分流。质谱条件:接口温度250℃，离子源温度200℃，电子能量70 eV，质量扫描范围33～450 amu。

2 结果与分析

2.1 龙头鱼的基本成分

龙头鱼去除内脏后，含有10.6%的蛋白质，1.2%的脂肪。由此可看出，龙头鱼含有较丰富的蛋白质和较低的脂肪含量，适合鱼露的发酵。

2.2 鱼露中氨基酸态氮含量

氨基酸态氮指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量。该指标越高，说明鱼露中的氨基酸含量越高，鲜味越好。由图1可知，5种鱼露的氨基酸态氮含量在发酵4.5个月后呈上升趋势。未发酵时氨基酸态氮含量为0.02 g/100 mL，发酵4.5月后，接种TBN4的鱼露氨基酸态氮含量最高，达到0.458 g/100 mL，对照组其次，为0.447 g/100 mL，这与龙头鱼肌肉中的内源性蛋白酶密切相关。而在发酵过程中，嗜盐菌一方面可以分解蛋白质产生氨基酸，但另一方面也可能利用氨基酸充当氮类营养物质，从而使得前期生成的氨基态氮含量又进一步降低。TBN4菌株的体现最为明显。通过Duncan法进行方差分析可知，TBN4与其他嗜盐菌发酵的鱼露氨基酸态氮含量存在显著性差异(P＜0.05)，含量最高。

图1 鱼露发酵4.5个月后氨基酸态氮含量Fig.1 Amino nitrogen content of fish sauce fermented for 4.5 months

2.3 鱼露中亚硝酸盐含量

发酵4.5月后，对照组亚硝酸盐含量3.964 mg/kg，接种TBN4鱼露亚硝酸盐含量3.189 mg/kg，接种TNN48鱼露亚硝酸盐含量3.542 mg/kg，接种9738鱼露亚硝酸盐含量3.085 mg/kg，接种RO2-11鱼露亚硝酸盐含量2.607 mg/kg，所有发酵样品中的亚硝酸盐含量微量，可忽略不计(国家标准为50 mg/kg)。可能原因一，高盐环境能够有效地抑制其他杂菌的生长，使得生产亚硝酸盐的杂菌不能生长，一定程度上减少了亚硝酸盐的产生;原因二，TBN4、TNN48、9738和RO2-11在生长过程中均能消耗亚硝酸盐，尤其RO2-11具有较强的消耗亚硝酸盐能力，见图2。

为验证推测，实验进一步在嗜盐菌液体培养基中加入一定量的亚硝酸盐，置于37℃恒温培养箱中培养，结果如图2所示。数据显示4种嗜盐古菌均具有消耗亚硝酸盐的特性，特别是RO2-11具有较强的转换能力，在培养1周后，培养基中的亚硝酸盐基本就被消耗掉，这一特性对解决传统鱼露发酵过程中容易产生亚硝酸盐的问题将具有很好的应用前景。

图2 培养基中亚硝酸盐含量的变化Fig.2 Changes of the medium in the nitrite content

2.4 鱼露中总胺含量

由图3可知，5组样品在发酵4.5个月后总胺含量较原料鱼大幅度地下降，其中接种TBN4的鱼露中最低，为10.53 mgKOH/g，对照组的总胺含量最高，为12.32 mgKOH/g。原料鱼总胺含量高，可能是因为鱼中含有丰富的蛋白质，尚未被发酵。对照组和接种嗜盐菌的鱼露中具有高盐环境，可以抑制杂菌生长，避免腐败使总胺含量较低。在接种嗜盐菌的各鱼露中，总胺含量相差不大(P＜0.05)。就总胺的含量降低而言，这4种嗜盐菌均适合发酵鱼露。

图3 鱼露发酵4.5个月总胺含量Fig.3 Total amine content of fish sauce fermented for 4.5 months

2.5 鱼露中总酸含量

总酸含量的变化可能因为是发酵过程中微生物产生的乳酸和产生的挥发性盐基氮酸碱相互作用，最终动态平衡［13］。由图4可知，发酵4.5个月后，各种鱼露的总酸均呈上升趋势。原料鱼由于未发酵产生酸类物质，因而总酸含量很低。而对照和4种嗜盐古菌发酵鱼露的总酸含量均显著高于原料鱼(P＜0.05)。其中，接种TBN4鱼露中总酸含量最少(P＜0.05)，为3.32 g/kg，其他鱼露的总酸含量均超过4.1 g/kg。总酸含量上升可能因为是在发酵过程中，蛋白质分解产生游离氨基酸均会使得酸度升高，而同时如图3和图5所示，发酵样品中胺类物质和呈碱性的挥发性盐基氮以及杂菌产生的氨类物质的含量都非常少［14］，使总酸被中和的量也较少，因此在发酵过程中总酸含量是呈上升趋势。

图4 鱼露发酵4.5个月后总酸含量Fig.4 Total acid content of fish sauce fermented for 4.5 months

2.6 鱼露中挥发性盐基氮含量

在鱼露发酵4.5个月后，测定各组样品的挥发性盐基氮含量，结果如图5。

图5 发酵4.5个月后挥发性盐基氮含量Fig.5 Content of volatile basic nitrogen of fish sauce fermented for 4.5 months

挥发性盐基氮(TVB-N)是指动物性食品由于酶和细菌的作用，在腐败过程中，使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质。由图5可看出，原料鱼挥发性盐基氮含量为0.040 g/100 g，发酵4.5个月后，各种鱼露的挥发性盐基氮的含量相比未发酵时，均有不同程度的上升(P＜0.05)，而一般鱼露挥发性盐基氮含量要求不高于0.25 g/100g，因此无论是对照组还是接菌组中的挥发性盐基氮的含量都远远低于该值。对照组TVB-N含量上升可能是由于在发酵过程中，在杂菌的作用下产生少量的挥发性盐氮。而在接种嗜盐古菌的鱼露中，由于嗜盐古菌的存在，能够有效的抑制杂菌的产生，能相对地减少盐基氮的产生。接种TBN4鱼露中挥发性盐基氮含量的增多，可能是因为TBN4具有良好的蛋白酶活力，后期随着酶的水解作用，氨基酸含量增加的同时也存在异常发酵即蛋白质酸败［12］，氨基酸再进一步分解为氨、三甲胺等挥发性盐基含氮化合物［15］。

2.7 鱼露中可溶性总氮含量

在鱼露发酵4.5个月后，测定各种鱼露的可溶性总氮含量，见图6。

图6 发酵4.5月后可溶性总氮含量Fig.6 Total soluble nitrogen content of fish sauce fermented for 4.5 months

可溶性总氮(TSN)能反映微生物群体利用氮源发酵情况，是反映鱼体蛋白质被分解程度的指标，主要包括游离的氨基酸态氮、小分子肽氮及可溶性蛋白氮等［14］。由图6可知，龙头鱼经过发酵4.5个月后，可溶性总氮含量比原料鱼有较显著地增加，但是对照和接入嗜盐古菌的样品相差不大。未发酵时，鱼体的可溶性总氮含量为0.02 g/100mL，接种9738鱼露的可溶性总氮含量为0.93 g/100mL，接种TBN4溶性总氮含量为1.13 g/100mL，而对照组鱼露可溶性总氮含量为1.09 g/100mL。对照组中可溶性总氮含量上升可能是因为内源性蛋白酶分解蛋白质造成的。而接种嗜盐古菌的鱼露可能是因为具有产蛋白酶能力的嗜盐古菌能将蛋白质分解为氨基酸及肽类物质，使得可溶性总氮含量上升。但同时嗜盐古菌也可能利用可溶性氮充当营养物质，使可溶性总氮又进一步降低。而接菌种的样品中，TBN4鱼露中可溶性总氮含量最高(P＜0.05)，可能是因为TBN4具有良好的蛋白酶活力，同时也可能是该菌株对产生的可溶性氮的消耗能力小于其他3株菌。

2.8 鱼露中组胺含量

在鱼露发酵4.5个月后，测定各种鱼露的组胺含量，见图7。

图7 发酵4.5月后组胺含量Fig.7 Histamine content of fish sauce fermented for 4.5 months

食物中的组胺产生主要是由于几种细菌激发组氨酸的脱羧酶活性［16］。若组胺被人体吸收，进入免疫系统，可能会引发过敏现象。由图7可知，发酵4.5个月后，各种鱼露内的组胺含量均比未发酵时的组胺含量高。据孙国勇等［17］报告，在鱼露前期发酵过程中，组胺含量开始会有所升高，而后下降。本实验显示原料鱼组胺含量为2.81 mg/100 g(国家标准为50 mg/100 g)，可忽略不计。对照组中组胺含量最高，达到87.6 mg/100 g，远高于原料鱼(P＜0.05)。发酵4.5月后，接种TBN4鱼露中的组胺含量最低，为2.43 mg/100 g显著低于对照组和其他菌种发酵样品(P＜0.05)。而其他3株古菌的组胺产生量也显著低于对照组(P＜0.05)。原料鱼组胺含量低，可能是因为组胺分解酶活性与盐度有关［16］，20%盐会降低组胺分解活力。而嗜盐古菌可能具有降解组胺的能力［16］，且 TBN4＞ RO2-11＞TNN48＞9738。

2.9 鱼露发酵后游离氨基酸的组成

在鱼露发酵4.5个月后，测定各种鱼露的游离氨基酸组成，如表1。

游离氨基酸的组成虽然不能体现某种特殊风味，但却是形成某种特殊风味的基础，氨基酸的组成对风味的形成有重要的影响［18］。缬氨酸、丙氨酸、苏氨酸和谷氨酸为鱼露鲜味氨基酸，而赖氨酸能影响鱼露的滋味［19］。由表1可知，各鱼露中游离氨基酸组成种类丰富，为人体提供了大量的必需氨基酸，具有丰富的营养价值［20］。其中，接种RO2-11鱼露中所含游离氨基酸含量最低，为16.294 g/100mL，必需氨基酸和鲜味氨基酸组成较其他鱼露含量低，赖氨酸含量也仅为2.179 g/100mL。接种TBN4和9738鱼露中所含游离氨基酸含量较高，分别为29.226 g/100mL和29.927 g/100mL，必需氨基酸和鲜味氨基酸组成较其他鱼露含量高，赖氨酸含量分别为3.160 g/100mL和3.113 g/100mL。与对照组相比，接种嗜盐菌的鱼露中含有天冬酰胺和半胱氨酸，天冬酰胺具有降血压的功效，半胱氨酸对广泛的毒物具有解毒功效。由此可见，利用TBN4和9738发酵鱼露能够得到全面丰富的氨基酸，并且必需氨基酸和鲜味氨基酸含量高，是理想的发酵剂。

表1 各鱼露游离氨基酸组成 g/100mLTable 1 Free amino acid composition of each fish sauce

2.10 鱼露挥发性风味物

在鱼露发酵4.5个月后，测定各种鱼露的挥发性风味物，如表2。

各鱼露中均含有烷烯类物质，但烃类化合物大多数分子质量较大且阈值也较高，一般不能成为鱼露气味的主要贡献体。鱼露中醇类物质含量较少，但醇类物质阈值一般偏高(1.5 mg/L)，对鱼露的风味影响较小，但适量的醇类物质能提高鱼露的风味。研究表明，酮类物质与鱼露干酪味的形成有关，但同样也因为其阈值较高，对鱼露风味的影响较小。据研究有机酸能够促进海鲜风味物质的释放［14］。接种TNN48的鱼露酸类物质含量最高，占总量的26.6%，9738和RO2-11其次，含量为11.11%和13.62%。虽然含硫化合物含量较低，但因为其阈值也较低，故对于鱼露特殊风味的产生也有较大作用。然而只有接种TBN4的鱼露中检测到二甲基二硫和二甲基三硫的存在。其他类挥发性风味物质中主要含有含氮化合

物，是氨基酸和糖类经美拉德反应而产生的具有肉香的化合物，主要为呋喃和咪唑［14］，而在接种TBN4的鱼露中未检测到含氮物质的存在。

表2 各鱼露挥发性风味物质Table 2 Volatile flavor compounds of each fish sauce

3 结论

利用嗜盐古菌发酵，一方面促进了风味物质的产生，另一方面又能够减少亚硝酸盐和组胺等有害物质的产生。在4种嗜盐菌发酵的鱼露中，接种TBN4的鱼露中氨基酸态氮、可溶性总氮含量、挥发性风味物质总量最高，游离氨基酸含量丰富，而对人体健康会产生不良影响的组胺的含量最低;接种9738的鱼露中氨基酸态氮含量最高;接种RO2-11的鱼露挥发性风味物质总量较高，有害物质组胺的含量较低。因此可考虑使用TBN4单独发酵和9738、RO2-11与TBN4混合发酵鱼露。

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