超声协同CDA酶法制备龙虾壳聚糖*

窦勇，胡佩红

1(江苏财经职业技术学院，江苏淮安，223003)2(淮安正昌饲料有限公司，江苏淮安，223005)

壳聚糖(chitosan)又称脱乙酰甲壳素，是由甲壳素经脱乙酰基而得，化学名聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，是天然多糖中唯一的碱性多糖，广泛用于纺织、医药、造纸、化妆品、食品工业和生物技术等领域［1］。一般把N-脱乙酰度55%以上的甲壳素(能溶解于1%的乙酸或1%的HCl中)称为壳聚糖，低于55%的仍称为甲壳素;根据脱乙酰度不同，将壳聚糖分为高(85% ～95%)、中(70% ～85%)、低(55%～70%)脱乙酰度3类［2-3］。目前，国内外有关壳聚糖制备报道十分广泛，其主要制备方法是传统的高浓度强碱法，近年来不少研究学者采用微波法、超声波法有机溶剂介质法等方法制备壳聚糖，但这些方法仍然离不开强碱的作用，其反应时间长，能耗高，产品性质不稳定，对环境造成污染极大［4-7］。

我国淡水资源十分丰富，是淡水小龙虾养殖和加工大国，每年产生的淡水小龙虾加工废弃物数以吨计，既污染环境又浪费了资源。显然，为充分利用虾壳自然资源，减少环境污染，以淡水小龙虾加工废弃物为原料，开发高效、无污染的环境友好型的壳聚糖生产方法势在必行。本研究旨在以淡水小龙虾壳为原料，利用超声波“空化作用”，改善甲壳素脱乙酰基酶(Chitin Deacetylation，简称CDA)与甲壳素之间的相互作用，利用CDA酶的高效催化性和专一性，提高脱乙酰反应速度和脱乙酰度，通过响应面法优化制备工艺参数，建立环境友好型的酶法制备高脱乙酰度壳聚糖的最佳工艺，为环境友好型的酶法工业化生产壳聚糖奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

淡水小龙虾，购于淮安市城南农贸市场;Na2·EDTA、NaOH、双氧水等试剂均购于国药化学试剂有限公司，均为分析纯;CDA粗酶液(采用1.3.3方法测定酶活力为195.34 U/mL，实验室自制:从淮安市某淡水小龙虾养殖基地淤泥中筛选出1株高产CDA酶霉菌，经鉴定为构巢曲霉菌，将该菌接种于液体发酵培养基，于30℃、150 r/min摇床培养96 h后，所得发酵液低温离心后取上清液，即为CDA粗酶液)。

1.2 主要仪器

多功能超声波清洗机(SCQ-1000C)，上海汗诺仪器有限公司;粉碎机(JYL-305)，山东九阳小家电有限公司;恒温鼓风干燥箱(DHZG-9070A)，上海一恒科学仪器有限公司;电热恒温水浴锅(HWS-28)，上海一恒科学仪器有限公司;数显黏度计(NDJ-8S)，上海方瑞仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 超声协同CDA制备壳聚糖工艺

虾壳样品预处理→超声辅助EDTA脱钙脱蛋白→过滤→烘干→双氧水脱色→水洗至中性→烘干→甲壳素→超声协同CDA酶法脱乙酰→过滤→水洗至中性→烘干→壳聚糖

1.3.2 脱乙酰度、黏度的测定和壳聚糖得率计算［6-7］

脱乙酰度(D.D.)测定参考文献［6］方法进行，黏度测定参考文献［7］方法进行。壳聚糖得率计算按公式(1)计算:

1.3.3 CDA酶活单位定义［8］

［8］，采用分光光度法测定酶活，以每小时产生1 μg对硝基苯胺所需要的酶量定义为1个酶活力单位(粗酶液酶活单位:U/mL)。

1.3.4 传统碱法制备淡水小龙虾壳聚糖

参考文献［9］“一步法”壳聚糖制备方法，采用1.3.2、1.3.3方法测其D.D.值、黏度及相对得率。

1.3.5 超声波法制备淡水小龙虾壳聚糖［7］

称取5 g左右自制甲壳素粉末，加入盛有80 mL 50%NaOH的烧杯中，并置于超声波清洗机中，经超声波(频率40 kHz，功率400 W)预处理1 h后，在90℃下恒温搅拌反应10 h，结束后冷却至室温，过滤，用水反复冲洗至中性，烘干即为壳聚糖，采用1.3.2、1.3.3方法测定其D.D.值、黏度及相对得率。

1.3.6 超声协同CDA酶法制备淡水小龙虾壳聚糖［10-13］

将自制甲壳素粉碎过40目筛于烧杯中，按料液比1∶20加入蒸馏水，于100℃水浴中加热预处理1 h后，置于超声波清洗机中，在一定超声功率下，经超声波预处理60 min后，加入CDA粗酶液，磁力搅拌水浴于50℃下恒温酶解一定时间，期间以0.1 mol/L NaOH调节pH 7.5，以使酶活性最高，酶反应结束后，以100℃水浴下连续灭活15 min终止酶反应，迅速冷却至室温，9 000 r/min离心10 min，蒸馏水反复洗涤至中性，沉淀物烘干，即得壳聚糖，采用1.3.2、1.3.3方法测定其D.D.值、黏度及相对得率。

1.3.7 RSM 优化设计［11，14］

采用Design Expert 8.0.5软件，根据Box-Behnken设计原理，以脱乙酰度Y为响应值，从预试验结果中选取加酶量、酶解时间、超声功率3个对D.D值影响较大因素设计试验，以期获得高D.D.的最佳条件，因素水平设计见表1。

表1 Box-Behnken设计试验因素水平编码表Table 1 Box-Behnken design factors and levels code table

2 结果与分析

2.1 模型建立及其显著性检验

RSM分析试验设计与结果见表2，利用Design Expert 8.0.5软件对表2数据进行回归拟合，得到脱乙酰度(Y)对此3因素编码值的二次多项回归模型为:Y=-319.632+0.717 5X1-0.772 5X2-0.467 5X3+0.98X1X2-0.44X1X3-0.885X2X3-5.718X12-2.248X22-2.998X32。

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Box-Behnken experiment design and results

该模型方差分析与回归方程系数显著性检验结果见表3，模型P＜0.000 1，差异极显著;失拟项P=0.100 2＞0.05，差异不显著，说明该模型对实际试验拟合度好，试验误差小。方差分析结果显示，决定系数R2=0.991 4校正系数，信噪比(Adeq Precision)=25.22远大于4，表明模型预测值与实际值拟合良好，可信度均很高，能够很好用于超声协同CDA酶法制备壳聚糖的D.D.的分析和预测。表3数据可见，一次项中X1、X2偏回归系数差异高度显著，说明超声功率、加酶量对本法制备的壳聚糖D.D.有高度显著的影响，X3偏回归系数差异显著，说明酶解时间对壳聚糖D.D.影响显著。交互项中除X1X2影响高度显著，X2X3影响显著，而X1X3交互作用不明显，说明超声功率和加酶量交互作用对D.D.影响最大，加酶量与酶解时间交互作用对D.D.影响显著，而超声功率与酶解时间交互作用对其影响很小。由F值可以看出，以上3因素对壳聚糖D.D.的影响顺序为:加酶量＞超声功率＞酶解时间。

表3 回归方程方差分析结果Table 3 ANOVA results of regression equation

2.2 RSM分析

利用Design Expert 8.0.5软件作响应曲面及等高曲线，考察所拟合的响应面形状，分析超声波功率、加酶量、酶解时间3因素之间交互作用对壳聚糖D.D.的影响，其响应曲面及等高曲线如图1～图3所示。

2.2.1 超声波功率与加酶量交互关系

由图1可以看出，当酶解时间一定时，随着超声功率的增大，D.D.先升高后降低，变化幅度很大，说明在一定范围内提高超声功率有利于甲壳素脱乙酰基，而超声功率过大，可能造成空化气泡在负相位受压过大而直接破裂，减小甚至失去超声“空化作用”［15］，从而不利于甲壳素的脱乙酰基。而加酶量对其影响较小，等高线呈椭圆形，说明超声波功率与加酶量交互作用明显。

图1 超声波功率与加酶量交互作用的响应面与等高曲线图Fig.1 Response surface and high profile of the interaction between ultrasonic power and enzyme dosage

2.2.2 超声波功率与酶解时间交互关系

从图2可以看出，当加酶量一定时，随着超过功率的增大，壳聚糖D.D.均呈现先上升后下降的趋势，在适宜的超声功率下，促进了甲壳素颗粒粉碎，增加其与CDA酶活性中心的结合几率，充分发挥了酶的高效催化活性，D.D.达到最大值;而高功率超声会产生瞬态空化作用，空化泡崩溃的瞬间，释放出高温高压，导致大量自由基的形成，高能量的自由基可能直接攻击CDA酶分子发生结构变化，使CDA活力下降，D.D.也随之降低［16］;而当加酶量一定时，D.D.随酶解时间的延长呈现平稳略有下降趋势，原因可能是因酶解时间过长，产生大量的乙酸，降低了CDA酶的活性，从而影响了D.D.。此外，右侧等高线呈近圆形，说明等高线呈椭圆形交互作用不明显。

图2 超声波功率与酶解时间交互作用的响应面与等高曲线图Fig.2 Response surface and high profile of the interaction between ultrasonic power and enzymolysis time

2.2.3 加酶量与酶解时间交互关系

图3显示，当超声功率不变时，随着酶解时间和加酶量的增加，响应面曲线变化幅度不明显。说明，当超声功率不适宜时，随加酶量和酶解时间的变化，酶法脱乙酰基效果不明显。等高线呈椭圆形，说明等高线呈椭圆形交互作用明显，当超声功率适宜时，能充分发挥超声与CDA酶的协同作用。

图3 加酶量与酶解时间交互作用的响应面与等高曲线图Fig.3 Response surface and high profile of the interaction between enzyme dosage and enzymolysis time

2.3 RSM优化结果与验证试验

根据回归模型，通过Design Expert 8.0.5软件分析得出，超声协同CDA酶制备壳聚糖的最佳条件优化结果为:超声功率475.91 W，加酶量9.45%，酶解时间3.5 h;预期的D.D.为90.98%。为了验证Box-Behnken试验设计的预测结果可靠性，根据响应面优化结果及预试验的最佳条件，结合实际操作，采用超声功率476 W、超声处理时间60 min、加酶量9.45%、酶解温度50℃、酶解时间3.5 h，进行3组平行试验制备壳聚糖，所得壳聚糖D.D.的平均值为91.09%，这与响应面预测评分90.98%十分接近，说明该模型预测结果与实际结果相符度、可信度高，具有实用价值。

2.4 超声协同酶法与传统碱法及单一超声法制备壳聚糖效果比较

从表4可知，超声协同CDA酶法制备的壳聚糖D.D.为91.09%，黏度为95 mPa·s，制备时间4.5 h，壳聚糖相对得率为85.87%，可见超声协同酶法制备壳聚糖的D.D.、黏度、制备时间和相对得率等产品质量参数明显比传统热碱法、单一超声法效果好。制备时间来看，超声协同酶法，利用了酶的高效催化活性和超声波的“空化作用”大大降低了脱乙酰基的时间，提高了D.D.，酶法条件温和也保证产品性质稳定，其D.D.和黏度明显高于其他两种方法，可见采用超声协同酶法制备淡水小龙虾壳高效、可行，制备时间短，产品具有高D.D.、高黏度的优点，制备过程中不需添加强酸、强碱，保护了环境，将成为未来壳聚糖工业化生产的方向。

3 结论

本研究在预实验基础上，通过响应面法优化了超声协同酶法制备龙虾壳聚糖工艺，得到其最佳制备条件为:超声功率476 W、超声处理时间60 min、加酶量9.45%、酶解温度50℃、酶解时间3.5 h，在此工艺条件下，壳聚糖的D.D.高达91.09%、黏度95 mPa·s，相对得率81.87%，总制备时间为4.5 h，产品为白色粉末。本研究采用自制CDA粗酶液，在酶的纯化及酶学性质及其催化脱乙酰机理方面有待于进一步研究。龙虾壳聚糖的超声协同CDA酶制备法具有制备时间短、产品脱乙酰度高、相对得率高的优点，其最大优势在于一改长期以来无法脱离强碱制备壳聚糖的现状，甲壳素提取所使用的 EDTA回收率可达100%，整个制备过程没有使用强酸、强碱等环境污染试剂，是一种环境友好型的制备方法，必将广泛运用。

表4 不同方法制备壳聚糖效果比较Table 4 Comparison of preparing chitosan effect with different methods

参考文献

［1］ Nidhi Pareek，Vivekanand V，Singh R P.Advances in Enzyme Biotechnology［M］.India:Springer，2013:125-136.

［2］ 李军立，张波，马力.壳聚糖的超声波降解及最佳工艺研究［J］.西华大学学报(自然科学版)，2011，30(5):100-103.

［3］ 宋巍，陈元维，史国齐，等.不同脱乙酰度壳聚糖的制备及结构性能的研究［J］.功能材料，2007，38(10):1 705-1 708.

［4］ Assaa^d Sila，Najwa Mlaik，Nadhem Sayari Rafik Balt，et al.Chitin and chitosan extracted from shrimp waste using fish proteases aided process:Efficiency of chitosan in the treatment of unhairing effluents［J］.J Polym Environ，2014，22:78-87.

［5］ 朱利平，黄惠莉.真菌甲壳素脱乙酰酶(CDA)研究进展［J］.食品工业科技，2010，31(11):394-400.

［6］ 季锦林，汤立新，钱清华.间歇法提取虾甲壳素和制备壳聚糖的工艺优化［J］.食品科技，2013，38(4):200-209.

［7］ 莫祺红，卢洁，黄佩芳，等.超声波预处理脱乙酰化制备壳聚糖的研究［J］.食品科技，2009，34(8):200-209.

［8］ 万芳芳.高产甲壳素脱乙酰酶菌株的筛选及发酵研究［D］.长沙:中南林业科技大学，2012.

［9］ 周安娜，张国栋，张文艺.“一步法”壳聚糖制备新工艺［J］.食品工业科技，2003，24(1):73-75.

［10］ Win N N，Stevens W F.Shrimp chitin as substrate for fungal chitin deacetylase［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2001，57(3):334-341.

［11］ 刘振春，韩宇，孙慧娟，等.超声波辅助酶法制备绿豆ACE抑制肽的工艺研究［J］.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2014，42(8):1-8.

［12］ 许庆陵，曾庆祝.虾壳甲壳素及壳聚糖提取工艺的研究［J］.中国食品添加剂，2013(6):104-109.

［13］ Márcia Barreto Cardoso，Roberta Signini，Sérgio Paulo Campana-Filho.On the sonication of chitin:effects on its structure and morphology and influence on its deacetylation［J］.Polymer Bulletin，2001，47(2):183-190.

［14］ 李侠，马艳梅，孙慧娟，等.超声波一双酶法协同提取玉米须黄酮工艺的优化［J］.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2014，42(4):416-419.

［15］ 徐力克，邓慧萍，史俊.超声波降解有机物机理及其应用研究［J］.环境科学与技术，2010，33(12):416-419.

［16］ 吕鹏，庄重，凌建亚，等.超声对酶的影响［J］.生物技术通讯，2004，15(5):534-536.