丹栀逍遥散合左金丸对阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆及细胞因子的影响

黄 琼

湖北民族学院中医药学院(湖北恩施445000)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，又称老年性痴呆，是以记忆力减退、认知功能障碍为特征的渐行性脑退性疾病或综合征[1]。其发病机制复杂，目前尚未完全明了。多数学者认为β－淀粉样蛋白(Aβ)沉积，激活小胶质细胞(microglia，MG)引起的炎症反应是AD的发病核心。Aβ激活的MG可引起白细胞介素1β(IL－1β)、白细胞介素－6(IL－6)、肿瘤坏死因子－α(TNF－α)等炎性细胞因子及神经毒性物质的产生，造成持续性的神经损伤，炎性细胞因子又可以激活MG，导致神经毒性循环，最终造成邻近神经细胞变性坏死，加重神经元损伤;细胞因子诱导Aβ的生成，Aβ沉积、聚集进而形成老年斑，进一步刺激MG合成和分泌细胞因子，在体内形成一个正反馈环路，因此认为炎症反应是AD显著的病理特点之一[2－3]。选择合适的药物控制炎性细胞因子的分泌已成为研究治疗AD的热点。结合中医对AD病因病机的认识，笔者尝试运用丹栀逍遥散合左金丸治疗AD小鼠，观察小鼠学习记忆能力的改善情况，及检测海马组织 IL－1β、IL－6、TNF－α 的含量，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物丹栀逍遥散合左金丸，方中药物柴胡 8g，白芍10g，当归10g，丹皮10g，栀子 8g，白术10 g，茯苓10g，甘草6g，黄连9g，吴茱萸3g，水煎滤液浓缩为2g/mL，置冰箱冷藏备用。脑复康:湖北华中药业有限公司，产品批号:20081027，0.4 g/片，将药片在研钵中研成细粉，加入蒸馏水，搅拌制成混悬液，浓度0.1g/mL，备用。D氨基半乳糖胺(D－gal)，国药集团化学制剂有限公司，批号:F20080109。

1.2 实验试剂碘(125I)白细胞介素1β放射免疫分析药盒，碘(125I)白细胞介素－6放射免疫分析药盒，碘(125I)肿瘤坏死因子－α放射免疫分析药盒，北京普尔伟业生物科技有限公司。

1.3 主要仪器γ放射免疫计数器，SN－695B型。Morris水迷宫及水迷宫自动实验记录仪，中国医学科学院出产。

1.4 实验动物4月龄KM雄性小鼠80只，体质量25～28g，购自湖北省实验动物研究中心。

1.5 实验方法

1.5.1 造模及给药 小鼠笼养，自由摄食与饮水。适应性喂养1周后，随机分为正常组、模型组、脑复康治疗组(简称脑复康组)、丹栀逍遥散合左金丸组(简称丹左组)，每组20只。正常组不予处理，其余组在小鼠颈背部皮下注射120mg/kg D－gal，1次/d，连续7周，制备AD小鼠模型。7周后，丹左组灌服丹左合方中药，脑复康组灌服脑复康混悬液，分别按0.04mL/g体质量灌胃给药，1次/d，连续5周。其余组每日灌等体积的生理盐水，1次/d，连续5周 。

1.5.2 Morris水迷宫行为学实验 ①定位航行实验。平台位于第四象限中点，第1 d将小鼠放至平台上停留约15s后，将其面向池壁从第一象限入水点放入水中，记录小鼠在120 s内找到平台的时间(逃避潜伏期)。如果小鼠在120 s内未找到平台，则由实验者将其牵至平台，让其在平台上停留10 s后再放入水中，其逃避潜伏期记为120 s。之后直接将小鼠放入水中进行实验，按顺时针方向更换入水点，历时4d，每天上午、下午各2次。②空间探索实验。第5d，将平台移走，任选1个入水点将小鼠放入，记录小鼠第1次经过原平台的时间(潜伏期)及平台象限的游泳距离占总距离的百分比(象限百分比)。用于测量小鼠对平台空间位置记忆的能力。

1.5.3 小鼠海马组织 IL－1β、IL－6、TNF－α 的测定行为学测试完后第2d处死小鼠，断头取脑，迅速分离，取出海马组织，吸去血迹，称重，加入生理盐水1 mL碾磨，充分匀浆，将匀浆液以4℃3000 rpm离心5min，取上清液，－20℃冻存备用。严格按照放射免疫试剂盒说明步骤操作，测定计算海马每毫克组织中 IL－1β、IL－6、TNF－α 的含量。

1.6 统计学处理采用SPSS11.0统计软件，计量资料采用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在灌胃给药过程中，各组均有5只小鼠死亡，最终进行行为学实验的小鼠每组15只。

2.1 Morris水迷宫行为学实验结果模型组学习记忆能力较正常组、丹左组、脑复康组明显下降。与模型组、脑复康组比较，丹左组能明显缩短小鼠逃避潜伏期和潜伏期，差异有统计学意义(P＜0.01)，见表 1、表 2。

表1 各组小鼠定位航行能力的比较(n=15， ±s)

表1 各组小鼠定位航行能力的比较(n=15， ±s)

注:与正常组比较，▲P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.01;与脑复康组比较，★P＜0.01。

组别 4d逃避潜伏期/s 后2d逃避潜伏期/s正常组 28.51±2.26 16.52±1.09模型组 61.09±1.51▲ 53.13±1.46▲丹左组 40.02±1.21▲△★ 29.01±1.31▲△★脑复康组 50.96±1.39▲△ 32.01±1.57▲△

表2 各组小鼠空间探索能力的比较(n=15， ±s)

表2 各组小鼠空间探索能力的比较(n=15， ±s)

注:与正常组比较，▲P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.01;与脑复康组比较，★P＜0.01。

组别 潜伏期/s 象限百分比/%正常组 20.05±1.20 49.08±0.16模型组 52.09±1.98▲ 30.15±1.71▲丹左组 26.79±1.81▲△★ 41.21±1.08▲△★脑复康组 36.98±1.81▲△ 34.98±1.59▲△

2.2 各组小鼠海马组织 IL－1β、IL－6、TNF－α 的含量正常组海马组织中 IL－1β、IL－6、TNF－α的含量明显低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)。经药物干预后，细胞因子明显下降(P＜0.01)，丹左组下降更显著(P＜0.01)，见表3。

表3 各组小鼠海马组织IL－1β、IL－6、TNF－α 的含量(n=15， ±s，ng·mg－1)

表3 各组小鼠海马组织IL－1β、IL－6、TNF－α 的含量(n=15， ±s，ng·mg－1)

注:与正常组比较，▲P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.01;与脑复康组比较，★P＜0.01。

组别 IL－1β IL－6 TNF－α正常组 0.19±0.22 1.85±0.05 5.02±0.11模型组 0.40±0.02▲ 6.02±0.03▲ 9.81±0.30▲丹左组 0.23±0.02△★ 2.59±0.09△★ 6.77±0.29△★脑复康组 0.30±0.09△ 2.89±0.07△ 7.39±0.17△

3 讨论

中医认为AD病位在脑，而脑的功能与五脏有关，脑功能失常产生的病变也归属于五脏。肝主疏泄可调节情志活动，“肝藏魂”，“肝主谋虑”，“肝在志为怒”，说明肝与神志活动密切相关。《景岳全书·杂证谟》云:“痴呆证凡平素无痰，而或以郁结、或以不遂、或以思虑、或以惊恐而致痴呆”。《辨证录·呆病门》云:“大约其始也，起于肝气之郁”。《辨证录》有云:“人有气机不疏，忽忽如有所失，目前之事竟不记忆，夫肝气最急，欲则不能急矣，于是肾气来滋，致肝则止，心气来降，至肝则回，以致心肾两间隔，致有遗忘也……”《灵枢经 ·本神》云:“肝，悲哀动中则伤魂，魂伤则狂妄不精”，都明确指出肝与痴呆的关系。若肝疏泄功能正常、气机调畅、五脏气血调和，魂有所舍，则人的神志活动正常。人体气血均上达头面部，发挥其濡养脑髓的功能。若肝气郁滞，则气不行水致痰浊内生，气不行血致瘀血内停。气郁痰浊瘀血壅于五脏，气血不能正常上达脑部;肝气郁滞影响脾胃的运化功能致气血生成不足，气血不足、气血瘀阻都可导致脑失所养，神明失用而发为AD。张艳霞等[4]通过检索现代AD文献，发现AD病因证素中以痰、血瘀、气滞为主。肝气郁滞日久可导致肝火炽盛，痰浊瘀血壅于五脏日久，也能郁而化火，火热之邪上扰清窍，神机失用发为AD。因此笔者认为肝郁气滞，肝火炽盛是导致AD的一个重要病机。

现代医学认为炎性反应与AD关系密切，许多药物可通过抑制其炎性反应达到治疗AD的目的，质子泵抑制剂如兰索拉唑、奥美拉唑可以抑制TNF－α和IL－6的分泌，非甾体类抗炎药联合质子泵抑制剂可能对AD的治疗有协同作用，过氧化酶活化增生受体抗体可以抑制IL－10的分泌，依那西普是一种人免疫球蛋白，它可以结合TNF－α，抑制其促炎效应[5]。因此进一步寻找天然抗炎药物及探讨其作用机制的研究就显得非常必要。

丹栀逍遥散合左金丸，丹栀逍遥散养血健脾，疏肝清热，方中柴胡苦辛、微寒，善条达肝气，疏肝解郁;白芍酸苦微寒，养血敛阴，柔肝缓急，有研究表明芍药中的芍药苷可以改善AD模型大鼠学习记忆能力[6];当归辛行温通，养血和血，且可理气，为活血行气之要药，研究表明当归中的阿魏酸等有效成分对AD具有保护损伤后脑细胞，抗炎，减缓记忆消退，抗衰老及氧化等作用[7];柴胡、白芍、当归合用补肝体调肝用，使血和肝和，血充肝柔;肝郁血虚日久，则生热化火，牡丹皮微寒，能清热、活血;栀子苦寒，泻火除烦，牡丹皮栀子合用增加了清热、活血、通经的功效;白术、茯苓、甘草健脾益气，一可实土以御木乘，二可使脾胃功能健旺，气血生化有源。左金丸清肝泻火和胃，方中黄连苦寒，清泻肝火;肝之气郁化火证，纯用苦寒之品，恐郁遏伤中，故佐以辛热之吴茱萸，一则辛散解郁，主入肝经，可疏泄肝经郁气，使肝气条达;二则制黄连之寒，使火泻而无凉遏之弊;三则可引黄连入肝经。王林艳等[8]认为黄连与吴茱萸配伍，可抑制白介素等物质的分泌，还有较强的抗抑郁作用。二方合用，共奏疏肝解郁，清热泻火，健脾养血之功效。

本结果显示前2d，各组小鼠基本上都是围绕池壁游泳，很少接近平台。从第3 d开始丹左组小鼠运动轨迹多在平台象限，找到平台位置的时间逐渐缩短，与模型组、脑复康组比较均有显著差异。4 d潜伏期丹左组与模型组、脑复康组比较有显著性差异(P＜0.01);后2d潜伏期丹左组与模型组、脑复康组比较有显著性差异(P＜0.01)，表明丹左组有较强的学习能力。空间探索试验表明丹左组小鼠找到平台的时间较模型组与脑复康组短，丹左组小鼠主要在原平台象限寻找平台，丹左组与模型组、脑复康组比较有显著性差异(P＜0.01)，表明丹左组有较强的空间记忆能力。对 IL－1β、IL－6、TNF－α 含量的影响，丹左组能显著降低 IL－1β、IL－6、TNF－α 含量，与模型组、脑复康组比较有显著性差异(P＜0.01)。

以上的实验结果表明，丹栀逍遥散合左金丸能通过降低小鼠海马组织 IL－1β、IL－6、TNF－α 的含量，减轻AD模型小鼠炎症反应，达到增强AD模型小鼠的学习记忆能力的作用，可用于AD的治疗。

[1] 盛树力.老年性痴呆及相关疾病[M].北京:科学技术文献出版社，2006:43.

[2] 刘景，龚其海，石京山.小胶质细胞与阿尔茨海默病[J].遵义医学院学报，2012，35(5):447－450.

[3] 左丽君，张巍.神经免疫炎症与阿尔茨海默病[J].中华临床医师杂志，2013，7(14):6547－6550.

[4] 张艳霞，张允岭.基于现代文献的老年性痴呆证型及证候要素分布研究[J].北京中医药大学学报，2011，34(6):417－420.

[5] 亓坤，杜怡峰.炎性反应在阿尔茨海默病发病机制中作用的研究进展[J].中国神经免疫学和神经病学杂志，2013，20(4):278－280.

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[7] 周桂媛.当归有效成分抗早老性痴呆药理作用及分子机制[J].实用中医内科杂志，2013，27(2):122－123.

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