鬼针草抑菌物质提取及抑菌活性研究

滕 蓉，李清禄，张温玲

(1.福建生物工程职业技术学院，福建福州350001;2.福建农林大学生命科学学院，福建福州350002;3.福州出入境检验检疫局，福建 福州350001)

随着人们生活水平的提高，追求天然、健康的消费理念逐步深入，对食品的安全水平也提出了更高的要求.传统化学防腐剂的使用受到挑战，开发高效、安全、无毒的天然食品防腐剂已成为当前食品领域研究的热点之一.由于自然选择和对环境的适应性，众多植物具有很好的抑菌效果，以植物中提取的抑菌物质作为食品防腐剂具有广阔的发展前景.

鬼针草(Bidens bipinnata L.)是菊科(Compositae)鬼针草属(Bidens)植物，也叫鬼钗草、一把针、引线包等，常见于热带及温带地区，分布广泛.鬼针草具有清热、解毒、消肿的功效，可全草入药.研究显示，鬼针草含有黄酮类、多炔类、有机酸及酯类、苷类、甾醇类和香豆素类等多种活性成分，有降血压、降血糖、抗炎镇痛、抗肿瘤等药理作用，还有抑菌活性[1－2].据报道，鬼针草的水煎剂可抗堪萨斯分枝杆菌[3]，鬼针草的乙醇浸液对金黄色葡萄球菌、黑根霉菌、链格孢菌及灰葡萄孢菌均有抑制作用[4].但是，目前有关鬼针草抑菌物质的提取工艺尚未见报道.因此，本文研究鬼针草抑菌物质的提取工艺及抑菌活性，为鬼针草作为新型天然防腐剂的开发应用提供依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

鬼针草药材购于福州中源药店，干燥全草，研碎成粗粉，保存于干燥器中备用.供试菌种:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)由福建农林大学生命科学学院实验室提供.荔枝疫霉(Peronophythora litchii)、水稻纹枯(Rhizoctonia solani)、稻瘟菌(Magnaporthe grisea)由福建省农业科学院植物保护研究所提供.细菌采用营养琼脂培养基，真菌采用马铃薯葡萄糖培养基(PDA).

1.2 试验方法

1.2.1 鬼针草提取液的制备 称取鬼针草粗粉10 g，装入500 mL圆底烧瓶中，用95%乙醇回流提取，试验条件为料液比1∶10、温度70℃、回流1次(2 h)，旋转蒸发仪中减压回收溶剂，蒸发皿水浴锅上浓缩，然后60℃真空干燥，制得鬼针草醇提物，备用.

1.2.2 菌液的准备 (1)菌种的活化.用划线法将供试标准菌株(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)分别接入营养琼脂培养基斜面上，放入培养箱中，37℃ 下培养24 h.荔枝疫霉、水稻纹枯、稻瘟菌等真菌分别接入PDA培养基斜面上，放入培养箱中，28℃下培养24－48 h.

(2)菌液制备.挑取活化好的菌落，用无菌生理盐水10倍稀释法制得不同稀释浓度的菌悬液，通过菌落计数法制得1×106－1×107CFU·mL－1的菌悬液.

1.2.3 提取物对细菌抑制效力的测定——滤纸片法[5－6]将已灭菌烘干的直径为5 mm的圆滤纸片，在质量浓度为0.2 g·mL－1的鬼针草提取液中浸泡2 h后取出，晾干.将各浓度的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌菌悬液各50 μL加入平皿培养基中，涂布均匀.用镊子夹取已制备好的鬼针草提取物滤纸片并平贴在含菌培养基上，每个平板均匀放3片，摆成等边三角形，滤纸片距平皿边沿均大于1 cm.以浸有相应溶剂滤纸片作对照，每个菌种做3个平行.将操作好的平板倒置，37℃恒温培养24 h.用游标卡尺十字交叉法测量抑菌圈直径，求3次平均值.

1.2.4 提取物对真菌抑制效力的测定——生长速率法[7－10]取1 mL质量浓度为0.5 g·mL－1的鬼针草提取物加入100 mL已121℃湿热灭菌20 min并冷却至50℃的PDA培养基中，充分摇匀，倒入直径为60 mm培养皿内制成平板.待培养基凝固后，用打孔器取供试真菌菌饼(直径4 mm)，放在平板中央，置于28℃恒温培养箱中培养48－72 h，观察到对照菌落直径为培养皿的3/4左右时，即可测量结果.十字交叉法测菌落直径，试验重复3次.

纯生长量/mm=菌落直径－菌饼直径

抑菌率/%=对照组与试验组的纯生长量差/对照组纯生长量×100

1.2.5 鬼针草抑菌物质提取条件优化 在单因素试验基础上，以枯草芽孢杆菌抑菌圈直径大小为指标，采用L9(34)正交试验，选取乙醇浓度、提取时间、回流次数、提取温度为测定因素，优化鬼针草抑菌成分的提取条件.

1.2.6 最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)的测定[11]将8支试管编号，1号管装1.8 mL液体培养基，2－8号管装液体培养基1 mL.将其高压灭菌后冷却，无菌操作下，在1号管加入质量浓度为1 g·mL－1鬼针草提取物0.2 mL，摇匀后，从1号管吸取1 mL混合液移入2号管，依次操作，将鬼针草提取液进行一系列对倍稀释后，1 －7 号管中鬼针草提取物浓度依次为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 mg·mL－1.7号管弃去1 mL，以8号管作对照.1－8号管各加入菌悬液0.1 mL，37℃恒温培养24 h后，肉眼观察对照试管混浊(有细菌显著生长)，以澄清(无肉眼可见菌生长)试验管的最低浓度为鬼针草提取物对该菌的MIC.1.2.7 鬼针草提取物稳定性试验[12](1)提取物对温度的稳定性.水浴温度分别调为20、40、60、80、100℃，将鬼针草醇提物分别置于不同温度上加热30 min，另一组在121℃湿热下加热30 min，对照样品置于室温下.以枯草芽孢杆菌为指示菌，用滤纸片法测定处理前后样品的抑菌状况，试验重复3次.

(2)提取物对酸碱度的稳定性.用不同pH的磷酸缓冲液将鬼针草醇提物的pH分别调节为6个梯度:2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，同时以未添加鬼针草醇提物的缓冲液培养基为空白对照.以枯草芽孢杆菌为指示菌，用滤纸片法测定处理前后样品的抑菌状况，试验重复3次.

(3)提取物对紫外光(UV)的稳定性.将鬼针草醇提物置于紫外灯下分别照射5、10、15、20、25、30 min，同时以未经紫外灯照射的鬼针草醇提物为对照.以枯草芽孢杆菌为指示菌，用滤纸片法测定处理前后样品的抑菌状况，试验重复3次.

2 结果与分析

2.1 鬼针草抑菌物质的提取工艺

从表1－2可以看出:各因素对鬼针草抑菌效果的影响从大到小依次为A(乙醇浓度)、B(提取温度)、C(提取时间)和D(回流次数).最优水平组合为A3B3C2D1，即用95%乙醇在70℃下提取1次(2 h).在此最佳提取条件下重复试验3次，测得对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为(10.76±0.32)mm，大于正交实验表中的结果.

表1 正交试验设计表及结果Table 1 The orthogonal design table and results

2.2 鬼针草醇提物的抑菌效果

在最佳提取条件下，鬼针草醇提物对大肠杆菌、稻瘟菌无抑制作用，0.2 g·mL－1鬼针草醇提物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为(9.63 ±0.16)、(10.76 ±0.32)mm，说明鬼针草醇提物抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌效果较好.0.5 g·mL－1鬼针草醇提物对水稻纹枯和荔枝疫霉的抑菌率分别为60.4%和31.6%.

2.3 鬼针草醇提物浓度对抑菌效果的影响

在最佳提取条件下，鬼针草醇提物浓度对抑菌效果影响显著(P＜0.05).鬼针草醇提物浓度越大，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制效果越强.同一浓度鬼针草提取物对枯草芽孢杆菌的抑制效果大于金黄色葡萄球菌(表3).

表2 方差分析结果1)Table 2 The results of variance analysis

表3 鬼针草醇提物浓度对其抑菌活性的影响1)Table 3 The effect of alcohol extract concentration of B.bipinnata on the antibacterial activities

2.4 MIC 的测定

由表4可见，鬼针草醇提物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的MIC分别为12.5、6.25 mg·mL－1.

表4 鬼针草醇提物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC1)Table 4 MIC of alcohol extracts of B.bipinnata against S.aureus and B.subtilis

2.5 鬼针草提取物的稳定性

2.5.1 温度对鬼针草醇提物抑菌活性的影响 结果(图1)表明，鬼针草醇提物经不同温度热处理后，对枯草芽孢杆菌均能形成明显的抑菌圈，即使121℃处理20 min，对枯草芽孢杆菌的抑菌圈平均直径仍达到(10.38±0.13)mm.由此可见，温度对鬼针草醇提物的抑菌能力没有显著影响(P＞0.05)，说明鬼针草醇提物抑菌活性物质热稳定性较好.

图1 不同处理条件对鬼针草醇提物抑菌活性的影响Fig.1 Effects of different treatments on the antibacterial activities of alcohol extract of B.bipinnata

2.5.2 pH对鬼针草醇提物抑菌活性的影响 不同pH下鬼针草醇提物对枯草芽孢杆菌的抑制能力有显著差别(P＜0.05).随着pH的增大，鬼针草醇提物抑菌活性呈先增强后减弱趋势，中性偏碱性环境的抑菌活性比酸性和较强碱性环境时强.在pH 4－8时，抑菌圈直径没有显著差异(P＞0.05)，鬼针草醇提物对枯草芽孢杆菌的抑制活性较强且稳定性较好(图1).

2.5.3 UV对鬼针草醇提物抑菌活性的影响 不同紫外光照时间下，鬼针草醇提物对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径波动范围很小，且不存在规律性，说明紫外光照对其抑菌能力没有显著影响(P＞0.05).由此可见，鬼针草醇提物抑菌活性物质对紫外光具有较高的稳定性(图1).

3 讨论

本研究表明，鬼针草醇提物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等有较好的抑制作用，对荔枝疫霉、水稻纹枯等真菌有较高的抑菌率，对大肠杆菌无抑制效果.这与文献报道鬼针草的乙醇浸液在体外对革兰氏阳性细菌有良好的抑菌作用[13]，对金黄色葡萄球菌和真菌有抑制作用[14]相一致.黄酮化合物是鬼针草中的主要有效成分[15－17].众多研究表明，植物源提取的黄酮类物质具有广谱抑菌性[18－21].鬼针草乙醇提取物较强的抑菌能力，可能与黄酮类物质有关，下一步可对鬼针草提取物进行分离纯化，深入探讨其活性物质的抑菌机理及其构效关系.

鬼针草药材资源丰富，且营养丰富，含17种氨基酸，其中8种为人体必需的氨基酸，总氨基酸含量达139.89 g·kg－1，并含有 Ca、Mg、P、Fe 等多种人体必需微量元素[22－24].急性毒理试验数据表明，鬼针草属无毒类型[25].本试验结果表明，鬼针草抑菌物质提取工艺简单，抑菌效果良好，稳定性高.因此，以鬼针草为原料，开发生产新型植物源防腐剂具有一定的潜力.

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