金花茶多酚氧化酶基因的克隆及其体胚发生过程中的表达分析

高宇琼，林玉玲，赖钟雄

(1.福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建福州350002;2.铜仁学院生物科学与化学系，贵州铜仁554300)

金花茶(Camellia nitidissima Chi.)属于山茶科山茶属，为灌木状多年生木本植物，以蜡质的黄色花朵而闻名，属于我国原产的特有种类，是稀有的园林观花植物[1].除观赏价值外，金花茶在人们生活中，尤其是食品、药用、保健品等工业中有着重要的作用，但其自然繁殖率低，采用组织培养技术可以加速其繁殖速度，且有利于种质保存以及其他方面研究.有关金花茶体胚发生的报道较多[2－10].研究表明，多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)参与苯丙烷类衍生物代谢、类黄酮及生物碱的合成等生理生化过程，与植物生长发育、抗逆性等有关[11－13].有关山茶属的PPO基因克隆已有研究[14－15]，但金花茶的PPO基因克隆尚未见报道.因此，本试验以金花茶成年材料离体再生体系为材料来源，获得同步化体胚材料，克隆金花茶体胚PPO基因，采用实时荧光定量PCR技术对金花茶体胚发生过程中PPO基因表达的变化情况进行研究，并测定金花茶体胚发生过程中PPO活性的变化，以明确金花茶体胚发生过程中PPO作用的分子机制.

1 材料与方法

1.1 供试材料

金花茶胚性培养物由林莉[4]获得，各阶段同步化体胚(球形胚、子叶胚、心形胚、成熟胚及花状多子叶胚)的获得参见文献[8，12].

1.2 仪器与试剂

台式高速冷冻离心机Avanti30为Beckman公司产品，梯度PCR仪Tgradient为Biometra公司产品，水平电泳槽DYCP-31BM、DYCP-31D以及电泳仪DYY-6C为北京市六一仪器厂产品.qPCR仪器用罗氏LightCycler 1.5;试剂:Trizol试剂(Invit rogen)，TaKaRa SYBR ExScript TM RT-PCR Kit(TaKaRa).

Ex Taq酶、pMD18-T载体、胶回收试剂盒、Mark DL2000等购自大连宝生物有限公司(TaKaRa);琼脂糖、氨苄青霉素、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂等购自厦门泰京生物技术有限公司;dNTP购自Promega公司;其他常规试剂均为国产分析纯和超纯试剂.

用于RNA操作的用具均用1%DEPC处理后高压灭菌;其余用于DNA操作的用具也进行高压灭菌处理.核苷酸引物由上海英骏生物技术有限公司合成.

1.3 方法

1.3.1 PPO基因克隆 (1)引物设计.根据GenBank上公布的山茶属植物PPO序列中的保守序列区，设计用于克隆金花茶体胚PPO基因的PCR引物，并进行nest_PCR.引物:PPO orf F:5'-ATGGCTTCCA TTCTCCCTCC AACCACCA-3';PPO orf R:5'-TTAAGAATCA AACTCAATCT TGACACCAC-3'.

(2)RNA提取与反转录反应.以Trizol法提取的金花茶体胚组织的总RNA为模板，cDNA第一链的合成按照RevertAidTMfirst-strand cDNA synthesis kit说明书进行操作.

(3)PCR扩增.采用PCR扩增PPO全长，然后对第一轮扩增产物进行胶回收纯化.

PCR 反应体系为 50 μL，其中模板、10 μmol·L－1上游引物、10 μmol·L－1下游引物各为 2 μL，10 ×Taq PCR buffer为 5 μL，2.5 mmol·L－1dNTP 为 4 μL，Taq Ex(5 U·μL)为 0.4 μL，灭菌水为 34.6 μL.

PCR反应程序:94℃变性1 min，54.4℃退火50 s，72℃延伸70 s，循环数为35个.循环前94℃预变性2 min，循环结束后72℃延伸10 min.

扩增结束后将产物保存于4℃.

(4)PCR产物的回收纯化.采用TaKaRa(大连)公司的胶回收纯化试剂盒纯化目的片段.

(5)序列测定.将鉴定正确的含有目的片段的大肠杆菌菌株递交上海博尚生物技术有限公司，对目的片段进行测序.

(6)序列比较.用Blast进行序列比较，用DNAMAN进行氨基酸翻译，并构建进化树.

1.3.2 金花茶体胚发生过程中PPO的qPCR分析 (1)总RNA提取和cDNA合成.金花茶体胚发生过程中不同阶段的培养物总RNA提取按照Trizol法.逆转录采用TaKaRa的SYBR ExScriptTM试剂盒，方法参照其说明书.

(2)引物设计.以茶树18S rRNA为内参基因，检测PPO基因在金花茶体胚发生过程中不同发育阶段培养物转录水平的相对表达量，根据本试验已克隆的金花茶体胚PPO基因及18S rRNA基因的序列，按照qPCR引物设计原则设计引物.

18S rRNA基因扩增引物:18S rRNA F:5'-CCTGAGAAAC GGCTACCACA T-3';18S rRNA R:5'-CACCAGACTT GCCCTCCA-3'.目的片段 171 bp.

PPO基因扩增引物:PPO F:5'-CTGACGCCGA GTACATAGC-3';PPO R:5'-GACTTGGTGA TA-AGCTCCGT-3'.目的片段 134 bp.

(3)实时荧光定量PCR条件优化和实时定量分析.PCR反应体系参照SYBR Premix Ex TaqTM说明书配制.总计20 μL，其中，cDNA 为1 μL，SYBR Premix Ex TaqTM(2 ×)为10 μL，10 μmol·L－1正向引物0.4 μL，10 μmol·L－1反向引物 0.4 μL，双蒸水为 8.2 μL.参照孙云等[16]的方法，以 18S rRNA 基因作为内参.

PCR反应程序(2步法):18S rRNA基因扩增:95℃预变性10 s，95℃变性5 s，60℃退火20 s，40个循环.PPO基因扩增:95℃预变性10 s，95℃变性5 s，55℃退火20 s，40个循环.

在Light Cycler 1.5实时荧光定量PCR仪上对金花茶体胚发生过程中不同发育阶段培养物进行qPCR检测，每个样品设3管重复，将所有设定保存后运行程序.反应完成后，得到所有样品的所有记录点曲线.在调整基线和阈值后，得出循环阈值(Ct).

1.3.3 金花茶体胚发生过程中PPO活性变化检测 除5个阶段的体胚材料外，增加离体植株作为材料.测定方法参照文献[17].

酶液粗提液:称取金花茶体胚发育过程中不同阶段的样品各1 g，加入5 mL 50 mmol·L－1pH 7.0 PBS(含10%PVP)，冰浴研磨，于15000×g、4℃离心20 min，取上清备用.

PPO 测定:取 2.6 mL 50 mmol·L－1pH 7.0 PBS、0.3 mL 0.1 mol·L－1M4-甲基邻苯二酚、0.1 mL 酶液粗提液混合.于37℃保温10 min，迅速放入冰浴中，立即加入2 mL 20%三氯乙酸，以5000×g离心10 min，收集上清液，于410 nm波长下比色.每种样品重复3次.

PPO 活性 =(ΔA410VT)/(0.01FW·V1·T)

以每分钟ΔA410变化0.01为1个PPO活性单位/(U·g－1·min－1).VT表示提取液总体积/mL;FW表示样品质量/g;V1表示测定时用去酶液体积/mL;T表示反应时间/min.

2 结果与分析

2.1 金花茶体胚的获得与体胚PPO基因的PCR扩增

金花茶体胚发生各阶段同步化体胚材料(球形胚、心形胚、子叶胚、成熟胚及花状多子叶胚)见图1.以Trizol法提取的金花茶体胚组织的总RNA为模板，进行反转录获得cDNA.PCR扩增后，经1%琼脂糖电泳检测，结果表明:在1800 bp左右扩增出目的条带，与预期大小一致(图2).经回收、连接、转化、扩增鉴定后，进行序列测定.

图1 金花茶体胚发生过程各阶段材料Fig.1 Materials in each satge during somatic embryogenesis in C.nitidissima

2.2 金花茶体胚PPO基因与编码氨基酸序列分析

利用序列分析软件对测序结果比较拼接，得到了金花茶体胚PPO基因的cDNA全长序列，其长度为1788个碱基，含有完整的开放阅读框(open reading frame，ORF)，GenBank登录号FJ597757，编码为595个氨基酸残基.

用Blast将金花茶体胚PPO基因的核苷酸序列与已经登录于GenBank中植物的PPO基因的核苷酸序列进行多重比较，结果表明:金花茶体胚PPO基因的核苷酸序列与一些山茶属植物的序列较为相似，相似性达到74%;金花茶与蒲公英(Taraxacum officinale)、葡萄(Vitis vinifera)、梨(Pyrus pyrifolia)、苹果(Malus x domestica)、李(Populus balsamifera)、杨(Prunus salicina)等草本、藤本、木本植物的PPO基因在核苷酸水平上的相似性为60% －70%.这表明不同植物之间PPO基因的序列差异不大，在植物的进化过程中比较保守.

对金花茶体胚PPO基因编码的氨基酸序列进行Blast在线分析，结果(表1)发现，与已登录的山茶属植物的PPO基因氨基酸序列相比对，除PPO基因氨基酸序列的保守区序列外，其他部位的序列相似性相对较低，且同源性均为72%，略低于核苷酸的同源性，如英红9号(Camellia sinensis var.assamica)、杭州龙井(Camellia sinensis)、南昆山毛叶茶(Camellia ptilophylla)等.与其他植物PPO基因氨基酸序列相比对发现，氨基酸的相似性也较低，同源性为62% －67%，如与葡萄和蒲公英的相似性为66%，与梨的相似性为64%，与油()(Prunus salicina var.cordata)和苹果的相似性均为62%等.

图2 金花茶体胚PPO基因PCR产物琼脂糖电泳Fig.2 Agarose gel for PCR of PPO gene in C.nitidissima somatic embryos

表1 金花茶体胚PPO基因氨基酸序列Blast比对结果Table 1 The results of Blast of PPO amino acid sequence in C.nitidissima somatic embryos

2.3 金花茶PPO基因编码的蛋白结构分析

利用DNAMAN软件，将金花茶体胚PPO基因编码区序列翻译成氨基酸序列，分析氨基酸的组成及出现频率，结果见表2.从氨基酸的组成看，20种氨基酸都有出现，以丙氨酸出现次数最多(52次)，其次为亮氨酸(47次)，色氨酸和半胱氨酸出现次数最少(仅8次).从氨基酸的类型看，非极性氨基酸有8种，共出现259次，占总数(595次)的43.52%;不带电荷的极性氨基酸有7种，出现178次，占总数的29.92%;碱性氨基酸有3种，出现86次，占总数的14.45%;酸性氨基酸出现72次，占总数的12.10%.可见，极性氨基酸总数(336次)超过非极性氨基酸(259次)，说明金花茶体胚PPO为亲水性多肽.

利用DNAMAN软件预测其二级结构分子质量、等电点，结果表明，金花茶体胚PPO分子质量约为65.88 kD，等电点 pI为6.67;由46.15%的螺旋结构、35.90%的线状结构和17.95%的折叠结构组成，以螺旋—线状或螺旋—折叠—线状交替的结构较多.纵观蛋白的整体结构，螺旋和线状结构是金花茶PPO蛋白中含量较多的结构元件，散布于整个蛋白质中.

表2 金花茶体胚PPO基因编码的氨基酸组成及出现频率Table 2 Composition and emerging frequency of amino acids encoded by PPO gene in C.nitidissima somatic embryos

利用DNAMAN软件对金花茶体胚PPO亲水性的分析表明，金花茶体胚PPO以疏水区域和亲水区域交替排列.以疏水性氨基酸开头，却以亲水性氨基酸结尾，且其中极性氨基酸较多.因此，金花茶体胚PPO为亲水性蛋白质.

2.4 金花茶体胚PPO基因的进化树分析

由图3可以看出，金花茶体胚PPO基因与国际数据库公布的茶树PPO基因聚为一类.山茶属植物不同品种相比，其他种类的茶品种亲缘关系较近，与金花茶亲缘关系稍远;与其他属植物品种相比，相对于草本植物蒲公英来说，金花茶与梨、苹果、杨等木本植物亲缘关系较近.

图3 金花茶与其他物种PPO的进化树分析Fig.3 The phylogenetic tree analysis of C.nitidissima PPO with the other species

2.5 金花茶体胚发生过程中PPO基因相对定量表达分析

以18S rRNA作为内参基因，利用2－△△Ct方法计算金花茶体胚发生过程中不同发育阶段培养物PPO基因的相对表达量.以心形胚作为对照，并定义为1个单位，对其他4个阶段培养物进行定量分析.结果(图4)表明:金花茶体胚发生过程中，球形胚阶段PPO基因表达量最大，为对照的3.2倍;子叶胚阶段表达量大幅下降，下降了55%，仅为对照的1.44倍;体胚发生后期，表达量表现为小幅下降，为对照的40%;而花状多子叶胚的表达量也仅为对照的45%，与正常子叶胚相比，表达量下降了68%.总体上，PPO转录水平的表达量与体胚发育进程趋势相反.

2.6 金花茶体胚发育过程中PPO活性变化分析

由图5可知，金花茶体胚发育过程中PPO活性整体呈下降趋势.球形胚、子叶胚以及心形胚3个阶段的PPO活性变化剧烈，存在显著差异，其中球形胚PPO活性最高，达25.5 U·g－1·min－1;与心形胚相比，成熟胚的PPO活性略有升高，为12.5 U·g－1·min－1;随后离体苗的PPO活性又急剧下降，达到最低点，仅为5 U·g－1·min－1;而花状多子叶胚(9.55 U·g－1·min－1)PPO 活性仅为正常子叶胚(18.55 U·g－1·min－1)的1/2.这说明PPO影响体细胞内氧化还原的酶促反应，也间接地影响体胚形态.总体上，PPO活性变化与体胚发育进程趋势相反.

图4 金花茶体胚发生过程中PPO基因的相对表达量Fig.4 Relative expression levels of PPO during somatic embryogenesis in C.nitidissima

图5 金花茶体胚发生过程中PPO活性变化Fig.5 Variations of PPO activities during somatic embryogenesis in C.nitidissima

3 讨论

3.1 金花茶体胚PPO基因的特异性

植物的PPO基因在进化过程中具有高度的保守性[18].本研究从金花茶体胚克隆得到的PPO基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与其他植物相比，相似性相对较低.这可能与PPO基因的复杂表达有关，植物种类、部位、细胞类型及生长发育阶段不同，PPO基因表达的种类及表达量都不同[19].关于金花茶体胚PPO基因是否具有多基因家族性及有无内含子，还有待进一步研究.

核苷酸和氨基酸序列相似性值相近，说明不同物种之间部分核苷酸碱基的改变，不会引起编码氨基酸很大的变化，与陈忠正等[15]的研究结果一致.此外，金花茶体胚PPO基因核苷酸和氨基酸序列与已克隆的植物同源性较低，具体原因还需后续研究.

3.2 金花茶体胚发生过程中PPO基因相对表达量与体胚发育进程的关系

胚胎发生的实现是在内源信息作用下，通过转录与翻译水平复杂而精巧的调控，基因在时间和空间上选择性激活和表达，导致细胞生理代谢的阶段性和区域性差异，从而使形态建成的物质基础也不同[18].本研究发现，PPO基因相对表达量与体胚发育进程呈反向相关，说明PPO可能影响金花茶体胚形态建成，且与PPO mRNA含量在不同阶段组织中的变化[12]一致.对金花茶体胚发生过程中PPO活性变化的研究表明，金花茶体胚内PPO活性在体胚发生早期含量较高，后期减少;人参体细胞胚胎发生过程中PPO活性在早期胚时也最高[20]，说明PPO与早期胚形成密切相关.PPO活性变化趋势与PPO基因荧光定量表达变化规律一致.这说明PPO的氧化可能会影响其细胞分化[21]，进而影响金花茶体胚生长，其真正原因有待进一步研究.

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