κ-卡拉胶降解菌Devosia sp.Fjfst-330的筛选与鉴定

郭娟娟，张龙涛，曾绍校，林美强，张 怡，郑宝东

(福建农林大学食品科学学院，福建福州350002)

卡拉胶(Carrageenan，CGN)来源于爱尔兰苔菜，又叫角叉胶、鹿角胶等，其降解产生的卡拉胶寡糖具有免疫调节、抗病毒、抗凝血、抗氧化等多种生物活性，在医药、食品等领域具有一定的应用价值，是新功能性食品、新药品、新化工品的开发热点.目前制备卡拉胶寡糖主要依赖于化学法，但化学降解条件不稳定，产物杂质不易分离.卡拉胶酶具有专一性，可酶切糖链的特定位点[1]，从而制得特定的寡糖，并且反应条件温和，降解过程易于控制，是卡拉胶寡糖研究的热点.

微生物是卡拉胶酶开发的重要来源.目前仅在假单胞菌属(Pseudomonas carrageenovora)、噬纤维菌属(Cytophaga)、别单胞菌属(Alteromonas carrageenovora)、弧菌属(Vibrio)[2－5]等微生物发酵产物中检测到卡拉胶酶，且尚未见卡拉胶酶规模化生产的报道，筛选新的产卡拉胶酶的微生物是该领域的热点之一.本研究从角叉菜中分离得到1株κ-卡拉胶降解菌，经鉴定，确定为德沃斯氏菌属(Devosia)，国内外尚未见报道.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料 κ-卡拉胶、λ-卡拉胶、ι-卡拉胶(分析纯，购自 SIGMA 公司).

1.1.2 仪器与设备 紫外可见分光光度计(北京谱析通用仪器有限责任公司);DKY-Ⅱ恒温调速回转式摇床(上海社科自动化设备有限公司);RXZ-280B型培养箱(新江南仪器有限公司);HC014-11-01灭菌锅(上海东亚压力容器制造有限公司);H-1850R离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);S1000 Thermal Cycler PCR仪;BIO RAD核酸电泳仪.

1.1.3 培养基 富集培养基:κ-卡拉胶2 g;无机盐母液100 mL;海水900 mL;pH 7.5.

初筛培养基:氯化钠15 g;κ-卡拉胶15 g;无机盐母液100 mL;水900 mL;pH 7.5.

复筛培养基:氯化钠15 g;κ-卡拉胶2 g;酵母膏1 g;无机盐母液100 mL;水900 mL;pH 7.5.

传代培养基(改良2216 E培养基):蛋白胨5 g;酵母膏1 g;κ-卡拉胶15 g;海水800 mL;蒸馏水200 mL;pH 7.5.

产酶培养基:氯化钠15 g;κ-卡拉胶2 g;酵母膏1 g;无机盐母液100 mL;水900 mL;pH 7.5.无机盐母液:NaNO320 g;MgSO47H2O 5 g;K2HPO410 g;CaCl21 g;蒸馏水1 L.

1.2 样品采集与处理

角叉菜样品取自福建省绿麒食品胶体有限公司，捣碎后用人工海水(30%海盐配置)浸泡，常温静置3 d，用移液管轻轻吸取上清液，备用.

1.3 菌株筛选

1.3.1 富集培养 分别取1 mL样品上清液加入到盛有25 mL富集培养基的三角瓶中28℃，165 r·min－1摇瓶培养3 d后，用无菌移液管从中吸取5 mL培养液移至另一盛有25 mL新鲜富集培养基的三角瓶中继续培养.反复操作4次后，对明显混浊的培养液进行初筛分离.

1.3.2 初筛 取0.1 mL富集培养液涂布初筛分离培养基平板.28℃倒置培养48 h，观察菌落形态，挑取周围形成明显透明圈和凹坑的菌落划线初筛培养基，培养48 h后，挑取单菌落移接传代培养基斜面，获得卡拉胶降解菌纯培养.

1.3.3 复筛 取卡拉胶降解菌纯培养物接种到复筛培养基三角瓶中(250 mL三角瓶装液30 mL)，32℃、150 r·min－1振荡培养24 h后，取1 mL液体种子接种产酶液体培养基中(250 mL三角瓶装液30 mL)，32℃、150 r·min－1振荡培养 48 h.发酵液离心(4000 r·min－1，4 ℃，9 min)去除沉淀细胞，取上清液测定卡拉胶降解酶活力.

1.4 酶活力测定

取1 mL粗酶液加入到盛有20 mL 0.5%卡拉胶底物的三角瓶中，于32℃振荡反应1 h，对照组用1 mL灭活酶液和20 mL底物溶液混合.以反应液中还原糖的增加量作为检测酶活力的指标.还原糖的测定则采用 DNS(3，5-二硝基水杨酸)法[4，6].取1 mL 反应液加1 mL DNS溶液，沸水浴反应5 min后冷却，定容至25 mL，以灭活反应液为对照，于520 nm下测定吸光值.以半乳糖做标准曲线，根据反应组和对照组吸光值的差值计算还原糖的产生量[3，7].1个酶活力单位(U)定义为在32℃条件下，1 min产生1 μg还原糖(以半乳糖计)所需要的酶量.

酶活力公式:酶活力(U·mL－1)=(D+0.011)×180.5 ×2 ×n/0.1420 ×t

D:吸光度;n:稀释倍数21倍;t:反应时间60 min;标准曲线的斜率为0.1420.

1.5 生长与产酶曲线测定

在发酵培养24 h后，取种子液于10个装有30 mL产酶培养基的锥形瓶中，每隔8 h测定生物量及酶活.

1.6 菌种鉴定

1.6.1 生理生化鉴定 将目的菌株在普通电子显微镜下观察其形态并记录，按照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)进行生理生化指标鉴定.

1.6.2 16S rDNA测序鉴定 收集菌体，参照DNA抽提试剂盒提取细菌基因组(由上海生工提供)，提取出的细菌基因组为模板进行采用16S细菌通用PCR引物进行PCR扩增得到其16S rDNA[8].将16S rDNA序列在核糖体数据库http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp上进行同源性比对，确定该菌株的分类地位.

2 结果与分析

2.1 产卡拉胶酶菌株的初筛与复筛

经初筛，一共得到60株能够降解κ-卡拉胶的菌株，将这60株菌进行复筛，一共有13株菌周围出现了较为明显的凹陷水解圈，凹陷内有无色透明液体，水解圈呈规则的圆形，边缘整齐光滑(图1).其中2号菌株的降解圈明显比其他菌株的降解圈大且透明，经革兰氏染色为阴性，因此选取2号菌进行深入研究.为了了解2号菌对其他类型卡拉胶的降解性，将2号菌株在分别以λ-卡拉胶、ι-卡拉胶为唯一碳源的初筛培养基划线培养，发现并无明显生长.将该酶加入分别只含λ-卡拉胶、ι-卡拉胶的底物溶液中进行降解并未显示活性.因此初步判断为 κ-卡拉胶降解菌[8－10].

2.2 拉胶酶的酶活测定

将经过复筛的13株水解圈较明显的细菌，采用DNS法测定其降解κ-卡拉胶的酶活力，其结果如表1所示，2号菌和9号菌具有较高的酶活性，测定的酶活分别为63.30、49.07 U·mL－1.

图1 菌株Fjfst-330降解κ-卡拉胶的凹陷Fig.1 Strain Fjfst-330 with κ-carrageenase activation

表1 菌株的酶活Table 1 Enzyme activity of the strain

2.3 卡拉胶酶的生长和产酶曲线

取活性最高的2号菌株进行生长曲线与产酶曲线的测定(图2).2号菌株的生物量在8 h达到最高，8－48 h为平稳期，48 h后进入衰亡期.当发酵培养到56 h时，酶活达到最大值，随后酶活力迅速下降.在微生物产酶动力学中，这种产酶形式属于滞后合成型[11]，即在细胞进入平稳期后，酶才开始合成并大量累积，许多水解酶都属于这一类[5，7，12].

图2 生长与产酶曲线Fig.2 The curve of growth and κ-carrageenase-producing

2.4 菌种鉴定

2.4.1 生理生化鉴定 2号菌在平板培养基上菌落呈浅黄色，通过电子显微镜观察，其形态为细小的短杆菌，单生鞭毛.对2号菌株进行生理生化鉴定(表2).参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[13]和《常见细菌系统鉴定手册》[14]，并结合菌株的细胞形态学观察，初步将2号菌株归入德沃斯氏菌属.

2.4.2 16S rDNA的克隆及序列测定 进一步确定2号菌的分类学地位，对2号菌株16S rDNA测序分析，其基因序列长度为1473 bp.将测序结果提交至核糖体数据库 http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp，进行Blast比对表明，该序列与 Devosia chinhatensis具有 93.4% 的同源性[15]，其 NCBI上登录号为EF433462.初步将该细菌归属于德沃斯氏菌属，并将其命名为Devosia sp.Fjfst-330.

表2 菌株的生理生化特性1)Table 2 Physiological and biochemical characteristics of the strain

3 讨论

本研究从角叉菜表面分离到多株能够水解卡拉胶的菌株，经过比较各菌株所产生水解圈的大小判断其降解卡拉胶的能力，对其中1株水解圈最大的菌Fjfst-330进行重点研究.由于卡拉胶的分类较多，目前工业生产使用的主要有κ-型、λ-型和ι-型，因此进一步在3种卡拉胶上进行纯化，发现菌株Fjfst-330只在κ-卡拉胶上有生长并有较大水解圈.经16S rDNA测序比对，生理生化指标测定，与德沃斯氏菌属有较高的同源性，因此初步命名为Devosia sp.Fjfst-330.该菌属为产κ-卡拉胶酶的新属，目前国内外尚未见相关报道.

菌株Fjfst-330培养过程中，其生长及产酶曲线并非同步合成.菌株在8 h时生物量最大，而在56 h时，酶合成及积累量最大，从产酶动力学分析属于滞后合成型，这与牟海津[4]的研究结果不同.从产酶曲线推测，菌株Fjfst-330在利用κ-卡拉胶为碳源降解时，可能受到分解代谢物的阻遏且同时生成不同酶.该菌为产κ-卡拉胶酶的新菌属，其酶种类与酶活性在国内外也未见报道.

菌株Fjfst-330在初步筛选过程中，表现出较高的产酶能力，测定其酶活达63.3 U·mL－1.与国内外已有卡拉胶酶活力相比，噬琼胶菌属(Tamlana agarivorans)为50·75 U·mL－1[16]、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)为 6.788 U·mL－1[17]、黄杆菌属(Flavobacterium)为 149.8 U·mL－1[3]、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)为26.5 U·mL－1[2]，菌株 Fjfst-330的产酶活力具有较好的优势.通过发酵优化，其产酶能力与产酶量将得到进一步提高.目前，我国尚未有工业化的卡拉胶菌株，所需的卡拉胶酶购自外国公司，价格昂贵.本菌株具有一定的生产潜力，为开发卡拉胶酶及其工程菌提供良好的基础材料.

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