化感水稻抑草圈土壤及提取物的化感作用

李家玉，张 奇，林志华，彭晓倩，陈丽云，何海斌

(福建农林大学生命科学学院，福建福州350002)

植物化感作用是指一个活体植物(供体植物)通过向环境中释放其产生的某些化学物质，从而影响周围植物(受体植物)的生长和发育的化学生态学现象.这些具有影响作用的化学物质称为化感物质.化感物质可以通过挥发、淋溶、根系分泌和残留物分解等方式释放到环境中去，从而影响周围其它植物的生长[1－2].1985－1986年美国遗传育种学家Dilday首次在田间试验中发现了412个化感水稻品种对水生杂草沼生异蕊花(Heteranthera limosa)具有明显的抑草圈现象(对杂草的抑制圈大于10 cm)[3－4]，这一研究结果引起了世界各国政府和研究机构的高度重视.

化感物质是引起化感作用现象的源头，因此化感物质的提取分离与鉴定一直是植物化感作用研究的热点.Kim et al[5]采用有机溶剂浸提水稻叶片，对具有抑草活性的组分进行GC-MS检测，结果表明对稗草具有抑草活性的主要化学物质有甾醇、苯甲酸衍生物、长链脂肪酸酯、醛酮和胺类物质.国内外研究[6－10]表明化感物质主要是酚酸类物质.何海斌等[11－13]对水培、沙培条件下的水稻根系分泌物乙醚萃取物的化学组成进行了系统分析，结果表明化感水稻PI312777与非化感水稻Lemont的根系分泌物组成中相同或相似的成分居多，差异主要在含氧萜类化合物上.也有报道称萜类物质、黄酮类物质等是潜在的水稻化感物质[14－15].上述水稻化感作用方面的研究，也存在一些不足之处:一是采用有机溶剂提取水稻植株，提取的物质与水稻种植过程中自然分泌释放到环境的物质在成分和含量上有区别;二是水稻释放的物质经过土壤环境后到达受体杂草，方能起到抑制作用，期间可能发生了物质的分解、转化和异构等化学与生物化学变化，因此抑制受体的物质不等同于水稻释放的物质.由此，本研究以化感水稻有效抑草圈的受体(稗草)的根系土壤为研究对象，对土壤以及经过水、70%(体积分数)乙醇浸提后的土壤进行抑草活性分析，结合提取物的生物测试，评价有效抑草圈的终端土壤及物质的化感作用.

1 材料与方法

1.1 供试材料

以国际上公认的强化感潜力水稻品种PI312777和非化感水稻Lemont为供体[4]，以稗草(Echinochloa crus-galli L.)为受体.稗草种子收集于田间并在冰箱4℃存放1 a左右.

1.2 水稻与稗草混种试验

根据前期试验[16]，以抑草圈模式种植，如图1所示.取30 kg已挑除残根、残枝的混匀风干稻田土，置于圆盆中(圆盆直径51 cm，高16 cm)，加10 L水并搅匀，静置1 d;挑选长势一致的预萌发的PI312777和Lemont 2种水稻种子各6颗，分别以间距2 cm围绕盆心种植，每天定时添加蒸馏水，保持土壤湿润(至土壤表层有水层出现)，手工除去试验过程中生长的杂草;待2种水稻长至5叶期时，挑选长势一致的二叶期稗草距水稻12 cm环绕水稻种植.以单种稗草作为对照，7 d后测定各组稗草株高和干物重[17]，试验设3个重复.

图1 水稻与稗草混合种植示意图Fig.1 The schematic diagram of the mixed culture of rice and barnyardgrass

1.3 水稻根系土壤物质提取与抑草活性测定

分别取PI312777和Lemont 2种水稻周围8－12 cm处土壤，将表层有青苔的土壤丢弃，0－4 cm处取样，直至取到稗草根际土壤.以对照组相应位置的稗草根际土壤为空白组.将上述取样土壤的根、叶等残枝清理干净，稍微晾干，磨碎，备用.

称取上述稗草根系土壤1000 g，每份土壤平均分成2份，分别加70%(体积分数)乙醇和蒸馏水浸提48 h，过滤，滤后土壤再用同等体积的70%(体积分数)乙醇和蒸馏水浸提1次，合并滤液;40℃减压浓缩并称重，分别记为PI水提物、PI醇提物、Le水提物和Le醇提物;各提取物用适当体积的甲醇溶解，得到母液25 mg·mL－1，备用;提取完的土壤晾干以充分去除溶剂，备用.

采用培养皿滤纸法进行生物测试[18].将莴苣种子用100 g·kg－1H2O2消毒10 min，蒸馏水洗净，用1 mol·L－1HNO3处理30 min，蒸馏水洗净，之后将莴苣种子加蒸馏水浸泡，直至种子全部沉到底部为止;在组培瓶底部垫上1张滤纸，分别加入200 μL PI水提物、PI醇提物、Le水提物和Le醇提物;待溶剂挥干后，将5粒露白的莴苣种子播入培养皿中，分别加入0.05%(体积分数)吐温－80水溶液(起助溶作用)5 mL，各样品终浓度为1 mg·mL－1，盖上盖子;于22℃光照培养，每天光照12 h(6:00－18:00).所有试验设4次重复，以0.05%(体积分数)吐温－80水溶液作为对照，5 d后测量莴苣的根长.

1.4 抑草圈土壤抑草活性测定

参照文献[19]中的方法，采用土壤琼脂三明治法对抑草圈土壤进行抑草活性测试.称取田间抑草圈水稻径向距离12 cm处的稗草根际土壤和采用1.3中的方法提取、晾干的土壤各10 g，置于1.3 cm(高)×6.2 cm(直径)培养皿中;倒出30 mL冷却至约45℃，0.8%(质量分数)的琼脂溶液，充分混匀;待凝固后再加入2 mL 0.5%(质量分数)的琼脂溶液覆盖表面，冷却后往琼脂表面播入10粒预萌发的稗草.以空白土壤为对照，5次重复.25℃光照，每天光照培养12 h(6:00－18:00)，3 d后测定稗草的根长和株高.

1.5 数据处理

采用Origin 8.0软件制图.采用单因素方差分析和Dunnett two-sided test进行显著性差异分析.通过抑制率评价其对受体生长的影响，即受体相对抑制率(IR)的计算公式为:

IR=(对照组生长指标－处理组生长指标)/对照组生长指标×100%

2 结果与分析

2.1 抑草圈试验

从图2可看出，化感水稻PI312777对12 cm处稗草的株高和地上部干物重的抑制率分别为50.3%和74.4%，而非化感水稻Lemont对12 cm处稗草的株高和地上部干物重的抑制率分别为18.3%和26.8%.此结果与作者前期的抑草圈试验结果一致[16]，表明12 cm可以做为化感水稻抑制稗草的有效距离，可以用此距离的土壤进行下一步土壤及其物质的抑草作用研究.

图2 不同化感潜力水稻品种抑草圈试验结果Fig.2 Inhibitory effects of different allelopathic rice on barnyardgrass by inhibitory circle method

2.2 抑草圈土壤对稗草的抑制作用

采用土壤三明治法得到的结果(表1)表明:化感水稻PI312777抑制圈土壤提取前对受体稗草的根长影响最大(根长最短)，达到显著水平;该土壤被水提取后对稗草根长的影响显著减弱，而70%(体积分数)乙醇提取后该土壤对稗草根长的影响介于原土壤与水提土壤之间，仍有一定的影响(表1);非化感水稻Lemont抑制圈土壤处理前后稗草根长差异很小，而抑草圈土壤对稗草的株高影响不大.

表1 抑草圈土壤对稗草的抑制作用1)Table 1 The inhibitory effect of soils from inhibitory circle on barnyardgrass

2.3 抑草圈土壤提取物对莴苣的抑制作用

化感水稻PI312777抑制圈土壤水提液对莴苣根长的抑制率为42.6%，70%(体积分数)乙醇提取液的抑制率为21.4%.而非化感水稻Lemont抑制圈土壤提取液对莴苣根长均无影响(图3).表明采用这2种方法得到的化感水稻PI312777抑制圈土壤提取物对莴苣根长均有抑制作用，而水提取物的抑制作用更强.

图3 土壤提取物对莴苣根长的抑制率Fig.3 Inhibitory rates of soil extracts on the root length of lettuce

3 讨论

为了寻找水稻化感物质，前人研究中大多是对植株提取物、水培溶液或琼脂种植提取液，分析其成分并结合生物测试进行鉴定[5－11].而离开了实际种植环境特别是土壤媒介，研究结果常与实际表现有偏差，因而诸多研究结论还需要进一步用田间试验进行验证.本研究采用前期建立的水稻与稗草土壤共培抑草圈方法，将供、受体同时种植在土壤媒介的自然环境下，因而水稻对稗草的化感抑草作用与实际情况基本一致.抑草圈种植结果表明，化感水稻对12 cm处稗草株高的抑制率达到50%以上，而非化感水稻的抑制率不到20%(图1).在此基础上，采用土壤三明治法对12 cm的有效抑草圈距离的土壤进行进一步研究，结果表明，化感水稻PI312777抑制圈土壤对稗草根长具有显著的抑制作用，经水浸提后土壤抑制作用明显下降(表1)，而水浸提液对莴苣的抑制率达到42%(图2).而经70%(体积分数)乙醇提取后土壤对稗草根长的抑制作用也有所下降，但下降幅度小于水浸提土壤(表1)，70%(体积分数)乙醇浸提液对莴苣的抑制率只达到水浸提液的一半(图2).显然，与非化感水稻相比，化感水稻12 cm处的抑制圈土壤具有明显的抑草作用，而水浸提液是土壤中主要抑草物质组分，醇提液次之.表明水稻化感物质具有多样性和复杂性.现有报道的水稻化感物质有酚酸类、萜类、脂肪酸、黄酮类，以及潜在的胺类、甾醇、苯甲酸衍生物、长链脂肪酸酯、醛酮等[5－11]，这些物质具有水溶性和醇溶性，比较合理地解释了本试验得到的水浸提液、醇浸提液均有抑制作用的结果.针对水稻土壤种植，用水提取化感物质的效率更高.

土壤种植环境是一个复杂的生态系统，水稻分泌的物质在土壤中要经历吸附、滞留、转移等过程，发生物质的分解、异构、断裂等生理生化过程[20－21]，各类物质的综合作用形成了抑草圈这一特定的生态学现象.因此对化感水稻实际抑草圈距离的土壤进行抑草物质分析，更接近实际过程.水浸提液对莴苣的抑制率达到42%，说明抑草圈土壤中水溶性物质是主体.本研究结果也表明采用70%(体积分数)乙醇提取的方法也可以提取部分化感物质，且同等条件下，该醇提取物的抑制率可以达到21.4%(图2)，说明采用醇提取的方法也是可行的.研究[10]表明化感水稻中起作用的化感物质大多是弱极性物质，这些物质在正常情况下在蒸馏水中的溶解度有限，而70%(体积分数)乙醇的溶解范围非常广，可以溶解不同极性的物质.

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