L-半胱氨酸与L-胱氨酸间相互转化的拉曼光谱研究

黄燕飞，廖海星，唐和清

(1.中南民族大学 化学与材料科学学院，湖北 武汉 430074;2.长江大学 化学与环境工程学院，湖北 荆州 434020)

半胱氨酸是含硫氨基酸中的一种，也是生物体必需氨基酸中的一种，是多数蛋白质和酶的空间结构和功能组成部件的重要组成成分。由于半胱氨酸容易形成具有二硫键结构的胱氨酸，或者是在含有半胱氨酸残基的多肽中，容易形成二硫键，因此，对于蛋白质的稳定化并保持一定的功能具有重要的作用［1-3］。此外，它对于在细胞中维持氧化还原平衡，影响细胞生长、分化和增值具有重要作用的谷胱甘肽的产生也是必不可少的［4］，且有助于修复由甲基化试剂引起的DNA 损伤［5-6］。在生理条件下，巯基很容易去质子化，其形成的巯基盐是大多数蛋白质中活性官能团的来源。其中最常见的是巯基和二硫键间的相互转化反应，这一反应涉及了细胞新陈代谢的许多方面，包括蛋白质的折叠、电子的转移，以及许多的调控机制［7-8］。

在研究多肽中半胱氨酸巯基的离子化以及S─H 与S─S 键间相互转化反应的过程中，Bulaj 等采用反相高效液相色谱分离及UV 吸收检测的方法，监测了16 种典型多肽中半胱氨酸残余巯基与4 种不同的二硫化物试剂之间的反应，得到了巯基与二硫键间相互转化的速率常数，并确定了静电效应是影响巯基与二硫键间相互转化的主导因素。然而，此方法需要进行大量的前处理工作和后续繁琐的数据拟合处理，才能得到速率常数，进而判断S─H 与S─S 之间相互转化的关系。Watanabe 等［9］采用电化学和拉曼结合的方法，研究了胱氨酸(100 mmol/L 溶液)在银电极上的氧化还原，发现当电极电位到达－0.05 V 时，可观察到502 cm－1处的S─S 键的伸缩振动峰;随着电极电位的降低，此峰强逐渐减弱，到－0.3 V 时消失;但当电极电位逐渐向+0.3 V 正移时，此拉曼峰恢复可见并逐渐增强。这表明胱氨酸发生了准可逆的二硫化物与硫醇间的电化学相互转化。但是，在半胱氨酸溶液中并未观察到上述现象。由于在实验方法上的困难，有关L-半胱氨酸与L-胱氨酸间相互转化的直接研究还很少见。

随着Raman 光谱仪制造技术的发展以及纳米化表面拉曼增强(SERS)基底材料的开发，SERS 在监控反应过程中的应用越来越方便。最近我们课题组开发了专门的高性能SERS 基底材料，并以此为基础，提出了氨基酸检测的高灵敏SERS 分析方法［10］。在本工作中，我们将采用石墨烯/纳米银(GO/Ag NPs)复合物为基底，利用SERS 技术，以L-半胱氨酸作为巯基试剂，探究了半胱氨酸与胱氨酸之间的巯基与二硫键的相互转化，为探究实际生物体内蛋白质或多肽链间二硫键与巯基之间的相互转化，维持生理平衡提供参考依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

硝酸银、石墨、硼氢化钠、硝酸钠、氢氧化钠、浓硫酸、高锰酸钾、盐酸羟胺均为分析纯;L-半胱氨酸、L-胱氨酸均购于阿拉丁化学试剂有限公司;实验用水为超纯水(＞18.2 MΩ·cm)。

Tecnai G220 S-TWIN 透射电子显微镜;Evolution 201 紫外可见分光光度计;DXR Raman Microscope 激光共焦显微拉曼;Micropure UV 超纯水制备仪。

1.2 基底材料的制备

采用改进的Hummers 法制备GO［11］，最终得到4.5 mg/mL 的分散液。在使用之前，先在70%功率的超声清洗仪下超声处理30 min。银纳米粒子(Ag NPs)则采用超声辅助NH2OH·HCl 还原AgNO3的方法制备得到［12］。取适量的Ag NPs 悬浊液，加入一定体积的GO，得到GO 浓度为0. 01 mg/mL 的GO/Ag NPs 悬浊液，搅拌均匀后，静置过夜。GO/Ag NPs 悬浊液呈碱性。

1.3 实验方法

取100 μL GO/Ag NPs 复合材料加入到2 mL 不同浓度的半胱氨酸溶液中，搅拌混合均匀，静置吸附30 min 后，取5 μL 滴在干净的玻璃片上，环境条件下自然晾干。采用Thermo Fisher 的DXR Raman 对半胱氨酸与胱氨酸之间巯基与二硫键间的相互转化进行监测，激光波长532 nm，激光能量10 mW，曝光时间5 s。文中如无特别说明，拉曼谱图均是在相同条件下所得。

2 结果与讨论

2.1 GO 和Ag NPs 的UV-Visible 分析

GO、Ag NPs 以及GO/Ag NPs 的紫外可见吸收光谱见图1。

图1 GO(a)，Ag NPs(b)及GO/Ag NPs(c)分散液的紫外可见吸收光谱Fig.1 UV-visible absorption spectra of (a)GO，(b)Ag NPs and (c)GO/Ag NPs dispersions

由图1 可知，GO 在226 nm 处有一最大吸收峰，在约300 nm 有一肩峰，与文献报道相符合［13］。银纳米粒子在425 nm 有最大吸收峰，当GO 和Ag NPs复合之后，在437 nm 处出现了新峰。该峰为Ag 纳米粒子的表面共振吸收峰［13］，说明GO 与Ag NPs形成了复合物。GO/Ag NPs 的TEM 见图2。

图2 GO/Ag NPs 的TEM 照片Fig.2 TEM image of the GO/Ag NPs composite

由图2 可知，Ag NPs 较均匀地分布GO 表面，形成了复合物，与紫外可见吸收光谱的结果相吻合。

2.2 L-半胱氨酸(L-Cys)的Raman 研究

采用GO/Ag NPs 作为基底材料，在激光波长532 nm，激光能量10 mW，曝光时间5 s，测得的不同浓度半胱氨酸的拉曼光谱见图3。

图3 不同浓度L-半胱氨酸的Raman 谱图Fig.3 Raman spectra of L-cysteine at different concentrations

由图3 可知，在较高浓度下，L-半胱氨酸位于2 550 cm－1的特征峰清晰可见，而且强度相当高，属于S─H 的伸缩振动［14］。当L-半胱氨酸的浓度降低至10－3mol/L 时，2 550 cm－1处的峰几乎消失，到10－4mol/L 时已完全检测不到，但500 cm－1处却出现了新的峰，属于S─S 的伸缩振动［14］。上述变化表明，随着L-半胱氨酸浓度的降低，S─H 键趋于消失，而S─S 不断增多。也就是说，该体系中存在S─H 键与S─S 键之间的相互转化，半胱氨酸被转化成了胱氨酸。

由于在本工作中，所用的GO/Ag NPs 悬浮液呈碱性(pH≈8.5)，当L-半胱氨酸的浓度较高时，测试体系呈酸性，而当L-半胱氨酸的浓度降低时，测试体系的pH 值将逐渐升高，接近GO/Ag NPs 悬浮液的初始pH 值(pH≈8.5)。例如，当半胱氨酸的浓度为10－3mol/L 时，体系的pH 值已达到7.2，为弱碱性。考虑到L-半胱氨酸中的巯基(─SH)容易受到pH 的影响，上述观察到的S─H 向S─S 转化的浓度依存性可能实际上是pH 依存性。因此，选择半胱氨酸浓度为10－2mol/L，采用HNO3将体系的pH值调节至酸性，实验结果见图5。

图4 拉曼谱图Fig.4 Raman spectra

图5 不同pH 条件下L-半胱氨酸(10 －2 mol/L)的拉曼谱图Fig.5 Raman spectra of L-cysteine (10 －2 mol/L)at different pH values

由图5 可知，当体系的pH 值由7.6 降至3.5时，S─H 的峰强逐渐增强，而S─S 的峰逐渐消失，与之前的假设相符，可以确定体系的pH 变化是致使2 550 cm－1和500 cm－1的峰发生变化的主要原因。并且，变化前2 550 cm－1的峰面积与变化后2 500 cm－1和500 cm－1的两峰面积的加和具有1 ∶0.9 ～1 ∶1.1 的相关性。可见，10－3mol/L 时得到的拉曼谱图是半胱氨酸和胱氨酸两混合物的拉曼谱图。此外，关于激光诱导产生反应的情况也已有报道［15］，因此，除了体系的pH 值能对巯基与二硫键间的相互转化产生影响之外，检测过程中使用的激光也可能成为诱导半胱氨酸转化成胱氨酸的原因。为了避免因pH 变化带来的影响，选择半胱氨酸的浓度为10－2mol/L 时和半胱氨酸对照品作为在不同曝光时间下探讨激光诱导反应的体系来证实激光对半胱氨酸转化成胱氨酸是否有影响。实验结果见图6、图7。

图6 不同曝光时间下半胱氨酸(10 －2 mol/L)的拉曼谱图Fig.6 Raman spectra of L-cysteine (10 －2 mol/L)under different exposure time

图7 不同曝光时间下半胱氨酸对照品的拉曼谱图Fig.7 Raman spectra of L-cysteine reference substance in solid state under different exposure time

由图6、图7 可知，不管是在GO/Ag NPs 基底上10－2mol/L 时的L-半胱氨酸样品，还是单纯的L-半胱氨酸固体对照品，在激光曝光时间大大增加时，仍然没有观察到S─H 与S─S 之间的相互转化，即没有半胱氨酸与胱氨酸之间的相互转化。由此，可以肯定，仅在激光辐照的条件下是不能够对半胱氨酸转化成胱氨酸产生诱导作用的，体系pH 变化是导致半胱氨酸转化成胱氨酸的主要因素(图8)。

图8 半胱氨酸与胱氨酸分子在银纳米粒子表面的吸附及相互转化Fig.8 The adsorption and transformation of L-cysteine and L-cystine molecules on surface Ag nanoparticles

3 结论

采用GO/Ag NPs 复合材料作为拉曼光谱基底，监测到了半胱氨酸与胱氨酸之间相互转化的过程，并探究了产生这一相互转化的主要原因，确定了在碱性条件下，有利于半胱氨酸与胱氨酸的相互转化，并给出了可能的机理，为探究实际生物体系内涉及巯基与二硫键间相互转化的重要反应提供了一定的参考依据。

［1］ Jocelyn P C. Biochemistry of the SH Group［M］. New York:Academic Press，1972.

［2］ Grzegorz Bulaj，Tanja Kortemme，David P Goldenberg. Ionization-reactivity relationships for cysteine thiols in polypeptides［J］.Biochemistry，1998，37(25):8965-8972.

［3］ McDonald N Q，Hendrickson W A.A structural superfamily of growth factors containing a cystine knot motif［J］.Cell，1993，73:421-424.

［4］ Gamcsik M P，Dubay G R，Cox B R.Increased rate of glutathione synthesis from cystine in drug-resistant MCF-7 cells［J］.Biochem Pharmacol，2002，63:843-851.

［5］ Fang Qingming，Anne M Noronha，Sebastian P Murphy，et al.Repair of O6-G-alkyl-O6-G inter-strand cross-links by human O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase［J］. Biochemistry，2008，47(41):10892-10903.

［6］ Douglas S Daniels，Tammy T Woo，Kieu X Luu，et al.DNA binding and nucleotide flipping by the human DNA repair protein AGT［J］. Nature Structural ＆ Molecular Biology，2004，11(8):714-720.

［7］ Hiram F Gilbert. Protein disulfide isomerase and assisted protein folding［J］. J Biol Chem，1997，272:29399-29402.

［8］ Watson J Lees，George M Whitesides. Equilibrium constants for thiol-disulfide interchange reactions:A coherent，corrected set［J］. J Org Chem，1993，58(3):642-647.

［9］ Tadashi Watanabe，Hiroyuki Maeda.Adsorption-controlled redox activity:Surface-enhanced Raman investigation of cystine versus cysteine on silver electrodes［J］. J Phys Chem，1989，93(8):3258-3260.

［10］Ouyang Lei，Zhu Lihua，Jiang Jizhou，et al. A surface-enhanced Raman scattering method for detection of trace glutathione on the basis of immobilized silver nanoparticles and crystal violet probe［J］.Analytica Chimica Acta，2014，816:41-49.

［11］Chen Ji，Yao Bowen，Li Chun，et al. An improved hummers method for eco-friendly synthesis of graphene oxide［J］.Carbon，2013，64:225-229.

［12］Jiang Jizhou，Ouyang Lei，Zhu Lihua，et al.Novel one-pot fabrication of Lab-on-a-Bubble @ Ag substrate without coupling-agent for surface enhanced Raman scattering［J］.Scientific Reports，2014，3942:1-9.

［13］ Zhang Zhe，Xu Fugang，Shu Wen，et al. A facile one-pot method to high-quality Ag-graphene composite nanosheets for efficient surface-enhanced Raman scattering［J］.Chem Commun，2011，47:6440-6442.

［14］Heewon Lee，Myung Soo Kim，Se Won Suh. Raman spectroscopy of sulphur-containing amino acids and their derivatives adsorbed on silver［J］. Journal of Raman Spectroscopy，1911，22:91-96.

［15］ Kwan Kim，YoonMi Lee，Hyang Bong Lee，et al. Visible laser-induced photoreduction of silver 4-nitrobenzenethiolate revealed by Raman scattering spectroscopy［J］.Journal of Raman Spectroscopy，2010，41:187-192.

［16］Boris A Kolesov，Vasil S Minkov，Elena V Boldyreva，et al.Phase transitions in the crystals of L-and DL-cysteine on cooling:Intermolecular hydrogen bonds distortions and the side-chain motions of thiol-groups.1.L-cysteine［J］.J Phys Chem B，2008，112:12827-12839.

［17］ Li Huimin，George J Thomas Jr. Cysteine conformation and sulfhydryl interactions in proteins and viruses.1.Correlation of the Raman S─H band with hydrogen bonding and intramolecular geometry in model compounds［J］. J Am Chem Sot，1991，113(2):456-462.

［18］Li Huimin，Charles J Wurrey，George J Thomas Jr.Cysteine conformation and sulfhydryl interactions in proteins and viruses.2. Normal coordinate analysis of the cysteine side chain in model compounds［J］. J Am Chem SOC，1992，114:7463-7469.

［19］Kerr K A，Ashmore J P.Structure and conformation of orthorhombic L-cysteine［J］. Acta Crystallogr B，1973，29:2124-2127.

［20］Kerr K A，Ashmore J P，Koetzle T F.A neutron diffraction study of L-cysteine［J］. Acta Crystallogr B，1975，31:2022-2026.

［21］Drebushchak T N，Bizyaev S N，Boldyreva E V.Bis(DLcysteinium)oxalate［J］.Acta Crystallogr C:Crystal Structure Communications，2008，64:313-315.

［22］Dobrowolski J C，Jamroz M H，Kolos R，et al. Theoretical prediction and the first IR matrix observation of several Lcysteine molecule conformers［J］. Chem Phys Chem，2007，8(7):1085-1094.

［23］Kandori H，Kinoshita N，Shichida Y，et al.Cysteine S─H as a hydrogen-bonding probe in proteins［J］.J Am Chem Soc，1998，120:5828-5829.

［24］Paukov I E，Kovalevskaya Yu A，Boldyreva E V.Low-temperature thermodynamic properties of L-cysteine［J］. J Therm Anal Calorim，2008，93:2423-2428.