酶法辅助提取生姜挥发油及其抗氧化活性研究

裴小娜，黄山

(青岛科技大学 化工学院，山东 青岛 266042)

生姜为姜科植物姜(Zingiber officinale Rosc.)的根茎，是一种使用历史悠久的香辛调味料，也是一种应用广泛的中药，具有祛寒除湿、祛风止痛、温经通络功效［1］。生姜的化学成分较复杂，现代药理研究表明，生姜挥发油具有明显的抗炎、清除自由基、降血脂、抗胃溃疡、止呕和防止血栓形成等作用［2-3］。生姜挥发油的提取方法较多，除传统的水蒸气蒸馏法外，一些新技术也有应用，如超高压提取［4］、超声波提取［5］、超临界CO2萃取等［6］，这些新技术的挥发油提取率高于单纯的水蒸气蒸馏法，但也存在生产设备成本高、工艺条件复杂、推广有难度等缺点。酶法辅助水蒸气蒸馏提取挥发油作为一种新工艺，近年来已有研究［7-8］，较之传统方法，酶法辅助提取具有提取时间短、工艺简单、能耗低、有效成分破坏少、经济安全等优点，此外，一般厂家现有设备就可满足生产要求，不需要增加新设备，可有效控制生产成本。因此，本文从方便今后规模化生产的实际出发，以生姜挥发油为实验体系，采用酶法辅助水蒸气蒸馏法提取，为了对本方法的多因素水平及其交互作用进行优化和评价，并能快速有效的确定最优条件，拟在单因素实验的基础上采用星点设计-响应面分析法考察酶法辅助提取对挥发油得率的影响，并通过DPPH 自由基清除实验以及脂质过氧化实验对其抗氧化活性进行研究。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

鲜生姜;纤维素酶(5 万U/g);果胶酶(10 万U/g);木瓜蛋白酶(80 万U/g);木聚糖酶(5 万U/g);α-淀粉酶(2 万U/g);β-葡聚糖酶(2 万U/g);DPPH 试剂;其余试剂均为分析纯。

RE-52 型旋转蒸发仪;FA1004 型电子天平;HH-2 水浴锅;PXS-270 pH 计;UV8100 型紫外可见分光光度计。

1.2 酶法辅助提取生姜挥发油

1.2.1 生姜的预处理鲜生姜洗净、切片，60 ℃干燥至含水量到12%以下，粉碎并过60 目筛。

1.2.2 酶解称取姜粉100 g，加入1 L 水，调节pH 值5.0。按一定姜粉质量比例称取酶，配成酶溶液，加入到姜粉溶液中，在50 ℃酶解2 h。

1.2.3 水蒸气蒸馏采用水蒸气蒸馏法，将酶解液共水蒸馏提取3 h，收集挥发油，并计算生姜挥发油得率。

1.3 生姜挥发油抗氧化活性研究

1.3.1 生姜挥发油对脂质过氧化的抑制作用［9-10］

1.3.2 生姜挥发油对DPPH·自由基清除率的测定参考文献资料［11-13］，反应完全后，以95%乙醇作空白，于517 nm 波长下测定吸光度值。平行测定3 次，取平均值。DPPH·自由基清除率计算公式如下:

式中 A0——DPPH·溶液4 mL 加无水乙醇4 mL的吸光度;

A1——DPPH·溶液4 mL 加样品溶液4 mL的吸光度;

A2——样品溶液4 mL 加无水乙醇4 mL 的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 酶法提取单因素实验

2.1.1 酶种类对提取率的影响称取姜粉100 g(7 份)，调节pH 值4.75，分别加入不同种类酶溶液(各种酶的使用量见表1)，同时，进行空白对照实验，在50 ℃水浴中酶解2 h，水蒸气蒸馏3 h，提取生姜挥发油，结果见表1。

表1 酶种类筛选Table 1 Screening enzyme species

由表1 可知，单独采用纤维素酶辅助提取生姜挥发油，其得率最高，为3.49%，而纤维素酶与其他酶共同使用时，挥发油得率均较低。纤维素酶与其他种类的酶合用，有可能限制了纤维素酶的酶解活力。故单用纤维素酶作为提取酶。

2.1.2 酶用量对生姜挥发油提取率的影响由图1 可知，挥发油的提取率随着酶用量的增加而提高，在酶用量1.0% ～2.0%时达最高，超过2.0%后，生姜挥发油提取率随之下降，所以确定酶用量为2.0%。

图1 酶用量对提取率的影响Fig.1 Effect of enzyme dosage on volatile oil yield

2.1.3 酶解温度对生姜挥发油提取率的影响由图2 可知，在30 ～50 ℃范围内，随着温度的升高，挥发油得率增加，50 ℃时达最高，超过50 ℃，随着温度的升高得率反而下降。因此，确定酶解温度为50 ℃。

图2 酶解温度对提取率的影响Fig.2 Effect of enzymatic temperature on volatile oil yield

2.1.4 酶解pH 对生姜挥发油提取率的影响由图3 可知，在pH 值4 ～6 范围内，随着pH 值的升高，挥发油得率增加，pH=6 时达最高;pH ＞6 时，随着pH 值的升高得率反而降低。所以，纤维素酶反应的pH 值为6.0。

2.1.5 酶解时间对生姜挥发油提取率的影响由图4 可知，挥发油提取率随时间的延长呈逐渐上升趋势，≥2 h 时生姜精油提取率趋于稳定，故选取酶解时间2 h 为宜。

图4 酶解时间对提取率的影响Fig.4 Effect of enzymatic time on volatile oil yield

2.2 酶法提取工艺条件的优化

2.2.1 星点实验结果在单因素实验的基础上，应用statistica 6.0 统计软件进行3 因素5 水平的实验设计，选择单因素实验中影响显著的3 个因素酶解pH 值、酶用量、酶解温度为自变量，生姜挥发油得率为响应值，采用响应面法进行分析，实验因素及水平见表2，结果见表3。

表2 星点设计因素水平表Table 2 The table of central composite designing factors and levels

通过statistica 6.0 统计软件对表3 数据做回归分析，得回归方程:Y =－27. 928 4 +2. 168 2X1+8.384 5X2+ 0. 171 5X3－0. 390 1X1X1－0.682 8 X2X2－0.001 3X3X3－0.017 2X1X2－0.010 1X1X3－0.002 6X2X3，对回归方程进行方差分析和显著性检验。

表3 实验结果Table 3 The experimental result

回归分析表明，模型回归显著(P ＜0.05)，决定系数R2=97.59%，说明该模型与实验值拟合较好，可用于生姜挥发油得率的理论预测。方差分析结果表明，影响生姜挥发油得率的各因素按影响大小排列依次为:X3＞X2＞X1;X2X3的二项式系数的P ＜0.05，无显著性差异，所以二者对生姜挥发油得率的影响存在交互作用。因此，各因素对生姜挥发油得率的影响并非简单的线性关系。

2.2.2 响应面分析根据回归方程作出响应面和等高线，结果见图5 ～图10。考察拟合响应面的形状，分析酶解温度、酶解pH、酶用量对挥发油提取率的影响。从等高线图可知，极值条件应在圆心处，酶解温度X3为最显著因素，表现为等高线更为陡峭;酶解pH 次之，表现为等高线曲线较平滑。酶法提取生姜挥发油的最优提取条件为:酶用量为2.0%，酶解pH 为6.0，酶解温度为50 ℃时，挥发油的得率最高预测值为3.90%。根据确定的最优提取工艺，分别取3 份样品，进行验证实验，平均提取率为3.86%，证明该方法可靠。李晓等［14］采用单纯酶法提取生姜挥发油其提取率为0.39%，周玉东等［15］单纯利用水蒸气蒸馏法提取，提取5 h，最高提取率为2.4%。说明此方法能显著减少水蒸气蒸馏的时间、节约能源，同时提高了生姜挥发油的提取率。

图5 酶用量和酶解pH 对提取率的效应曲面分析Fig.5 Enzyme dosage and pH on volatile oil yield of surface analysis

图6 酶用量和酶解pH 对提取率的等高线图分析Fig.6 Enzyme dosage and pH on volatile oil yield of contour map analysis

图7 酶解pH 和酶解温度对提取率的效应曲面分析Fig.7 pH and enzymatic temperature on volatile oil yield of surface analysis

图8 酶解pH 和酶解温度对提取率的等高线图分析Fig.8 pH and enzymatic temperature on volatile oil yield of contour map analysis

图9 酶用量和酶解温度对提取率的效应曲面分析Fig.9 Enzyme dosage and enzymatic temperature on volatile oil yield of surface analysis

图10 酶用量和酶解温度对提取率的等高线图分析Fig.10 Enzyme dosage and enzymatic temperature on volatile oil yield of contour map analysis

2.3 生姜挥发油的抗氧化活性研究

2.3.1 生姜挥发油对脂质过氧化的抑制作用由图11 可知，生姜挥发油对脂质过氧化具有抑制作用，其活性随着浓度的提高而增强。其IC50为109.37 g/L。

图11 生姜挥发油对脂质过氧化的抑制作用Fig.11 Inhibitory effect of volatile oil from ginger on lipid peroxidation

2.3.2 生姜挥发油对DPPH·自由基的清除由图12 可知，生姜挥发油对DPPH·自由基的清除率随着其浓度的增加而增加，这表明生姜挥发油具有一定的清除DPPH·自由基的能力。生姜挥发油对DPPH·自由基清除率的IC50为3.73 g/L。

图12 生姜挥发油对DPPH·自由基的清除率Fig.12 DPPH·radical scavenging of volatile oil from ginger

3 结论

(1)以酶法辅助水蒸气蒸馏法提取生姜挥发油的最佳工艺条件为:纤维素酶作为提取酶，酶用量为2.0%，酶解温度50 ℃，酶解时间2 h，酶解pH 6.0，水蒸气蒸馏时间3 h，生姜挥发油的提取率可以达到3.86%。

(2)生姜挥发油具有一定的抗氧化活性，说明生姜挥发油是一种较好的天然抗氧化剂，由于生姜产量大、价格相对较低，因而具有广泛的开发和应用前景。

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