全基因组表达谱芯片在新疆维 汉族胶质母细胞瘤患者中的应用研究△

刘 亮 栾新平（通讯作者） 夏海成 顿志平 朱正权 杜山别克 李文婷

1）新疆医科大学附属肿瘤医院 乌鲁木齐 830011 2）新疆医科大学第二附属医院 乌鲁木齐 830063 3）山东大学第二医院 济南 250033

原发性胶质母细胞瘤（Glioblastoma）是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，WHO 分级Ⅳ级。大多数胶质母细胞瘤迅速直接的发生，很少有低度恶性前期病变［1］，其恶性度高，生存期短，预后极差。近年来，胶质母细胞瘤发病趋势呈现年轻化，胶质母细胞瘤死亡率更是上升了近100%［3］。新疆是多民族聚居地区，流行病学分析显示，维吾尔族（以下简称维族）胶质母细胞瘤患者中男性发病多于女性，发病年龄较汉族患者轻，但生存期高于汉族。新疆维、汉族患者高级别胶质瘤在发病及临床特点等方面的不同，提示其在基因水平上，可能存在一定的差异性。本研究通过运用mRNA 表达谱芯片筛选新疆维、汉族患者高级别胶质瘤差异基因标志物，比较新疆维、汉族患者脑胶质母细胞瘤基因表达的差异性，初步探讨维、汉族胶质母细胞瘤发病机制的差异。

1 资料与方法

1．1 一般资料 随机选取2010—2013 年期在新疆医科大学附属肿瘤医院手术切除经病理证实为胶质母细胞瘤新鲜组织标本6例，其中维族3例，汉族3例；男2例，女4例；年龄29～56岁，中位年龄45岁；组织学分级均为Ⅳ级。标本均于-80℃的冰箱保存。所选病例经核实无重复，年龄、性别、民族、病理诊断、影像学表现、术后随访等临床资料完整，术前均未进行放疗和化疗。

1．2 提取总RNA 及mRNA 表达谱芯片检测 Trizol（Invitrogen，美 国）和The RNeasy kit（Qiagen，德 国）进 行 总RNA 提取，具体操作按试剂盒说明进行。采用1%琼脂糖凝胶电泳及NanoDrop Spectrophotometer 2000对总RNA 质量分别进行定性及定量检测。将样本RNA 体外转录合成cRNA，经过质检的cRNA 与杂交试剂混合形成杂交样本，放到室温孵育，经过高温洗涤、乙醇洗涤及3次室温洗涤，最后干燥，进行Illumina HT-12全基因组表达谱芯片扫描，读取数据及获取图像。

2 结果

2．1 总RNA 提取的定量和定性分析 RNA 浓度＞100化ng／uL，RNA 总 量＞2 ug，经NanoDrop2000 检 测，纯 度A260／A280比值在均＞1．90。RNA 1%琼脂糖凝胶电泳结果显示18srRNA 和28srRNA 出现两条带清晰两条带，说明所提取组织的总RNA 完整性好，没有降解，纯度高，可用于后续mRNA 表达谱芯片检测。

2．2 差异基因筛选及生物信息学分析 将芯片杂交扫描图片导入Illumina GenomeStudio软件，得到校正后的数据，利用R 语言lumi包进行标准化处理及差异基因筛选（P＜0．05）后，维、汉族胶质母细胞瘤全基因组表达谱的比较分析发现，筛选出显著差异表达的基因共1 475个，其中表达上调有669个（44．84%），下 调有807个（55．16%）（其 中STRC基因对应2个转录本，1个转录本表达上调1个转录本表达下调），统计的差异基因均为公共数据库中收录的基因。对于筛选出来的差异基因，利用Web Gestalt软件，对差异基因做GO（Gene Ontology）分析（P＜0．05）。通过统计每个GO条目中差异基因的个数，利用统计检验对差异表达的1 475个基因中做富集分析，计算差异基因富集的显著性，分析发现有1 175个基因富集分布在代谢过程、生物调节、对刺激反应、多细胞的有机过程、细胞交流、细胞增殖等生物过程中。见表1。

表1 差异基因参与的主要生物过程

3 讨论

脑胶质瘤作为最常见的原发性脑肿瘤，其中一半以上为恶性度最高的胶质母细胞瘤，其恶性度极高，患者即使采用了最为积极的治疗手段，中位生存期仍然不容乐观。研究表明，不同级别的胶质瘤的分子改变、用药以及预后均有明显不同［3-4］。近年来，国内外对于新疆维、汉族患者脑胶质瘤的研究大多停留在TP53、MGMT、VEGF等蛋白表达方面［5-6］，对于胶质瘤基因水平及胶质母细胞瘤的研究报道较少。新疆维、汉族患者高级别胶质瘤在发病及临床特点等方面的不同，提示其在基因水平上，可能存在一定的差异性。

从基因水平探究其发病机制已成为胶质瘤研究领域的必然趋势。和所有恶性肿瘤一样，胶质母细胞瘤的发生发展也是一系列分子改变的结果，自1995年Schena等发表第一篇基因表达谱芯片文章以来，目前基因芯片法已广泛应用于人类多种恶性肿瘤，如卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌等［7］，同样也应用与胶质瘤基因表达谱的研究。而对于筛选维、汉族胶质母细胞肿瘤的差异性表达，国内外尚未见报道。

本研究采用含有47 323个探针对应的31 330个基因的mRNA 表达谱芯片检测了3例维族患者胶质母细胞瘤，3例汉族患者胶质母细胞瘤的mRNA 基因表达谱情况，发现差异表达的基因1 475个（4．7%）。经过软件分析，筛选出显著差异表达（P＜0．05）的1 475个基因中，表达上调有669个（44．84%），下 调 有807个（55．16%），其 中 有1个 基 因（STRC）对应2个转录本，1个转录本表达上调1个转录本表达下调。

筛选出来维、汉族胶质母细胞瘤的差异表达基因，涵盖了胶质瘤分子诊断指南中常见分子标记物中的MGMT、TP53、IDH 等［8-9］。通过GO 分析，发现维、汉族胶质母细胞瘤之间的差异表达基因涵盖了多个生物学过程，这些差异基因主要参与代谢过程、生物调节、对刺激反应、多细胞的有机过程等，其中包含小GTP酶调节信号通路、Ras信号蛋白通路、神经元反应蛋白调节、中枢神经系统髓鞘形成等多个功能节点。

在基因差异和通路功能方面，维族和汉族胶质母细胞瘤既有相同的差异表达基因，又各自有自己特有的差异表达基因。说明胶质母细胞瘤的发生发展中有其肿瘤共同的基因变化，又有民族之间的差异。对维族、汉族两个民族共同的差异表达基因的研究，有助于我们对胶质母细胞瘤的发生发展的分子机制、信号传导通路进行进一步的认识；而对两个民族各自特有的共同差异表达基因的研究有助于我们进一步认识胶质母细胞瘤在发病机制上可能存在民族差异。

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