雷公藤红素对荷瘤裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响

姜 华 孙成法 褚荣涛 王君祥 周幽心 黄煜伦 谢学顺

1）江苏常熟市第二人民医院神经外科 常熟 215500 2）苏州大学附属第一医院神经外科 苏州 215006

胶质瘤起源于中枢神经系统的胶质细胞，是神经系统中最常见的富含血管的实体肿瘤。雷公藤红素是我国首先从雷公藤根中提炼的三萜色素类单体，是雷公藤的主要活性成分之一。研究发现，雷公藤红素对血管内皮细胞有较明显的体外抑制作用，IC50为1．33μg／mL［1］；而且雷公藤红素通过多个方面抑制血管新生：雷公藤红素抑制ECV 的小管形成，并呈剂量依赖性；鸡胚尿囊膜血管生成试验发现其血管生成抑制率达85．0%［2］；动物实验中我们还发现雷公藤红素抑制荷SHG44胶质瘤裸鼠移植瘤生长，而且通过下调周期蛋白D1及PCNA 的蛋白表达，对肿瘤细胞周期进行调控，减缓瘤细胞增殖［3-4］，但雷公藤红素抑制血管生成的作用机制尚不明确。因此，我们进一步研究雷公藤红素抑制血管生成的相关分子作用机制。

1 材料与方法

1．1 实验材料 人脑胶质瘤细胞株SHG-44由苏州大学附属第一医院神经外科脑研室自行构建并留存。46 只雌性BALB／c裸小鼠，SPF等级，体质量（25±3）g，鼠龄5～7周，购自上海实验动物中心，动物合格证号：SCXK（沪）2002-0010。饲养于NASA1000 级生物净化室内，按SPF 等级要求管理。二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma Chemical公司，RPMI-1640培养液购自Life Technologics公司，DMEM 培养液购自GIBCO BRL公司，小牛血清购自杭州四季青公司。雷公藤红素（Celastrol）购自中科院上海药物研究所，分子式C29H38O4，分子量450，纯度＞97%。顺铂由昆明三戊贵金属药业生产。即用型SP 超敏试剂盒及柠檬酸盐缓冲液（pH 6．0±0．1），CD34、VEGF单克隆抗体，bFGF、VEGFR1、VEGFR2多克隆抗体均购于福州迈新生物技术开发有限公司。

1．2 裸鼠皮下荷瘤模型 复苏胶质瘤细胞株SHG44，传代培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液。收集处于对数期生长的细胞，调整为密度2×107／mL 的单细胞悬液悬于不含血清的DMEM 培养基中，抽取细胞悬液0．5mL，分别接种于6只BALB／c裸鼠右腋部背侧皮下。荷瘤裸鼠饲养于NASA1000级生物净化室，皮下瘤块生长至直径约1．2 cm，进行裸鼠肿瘤传代移植。接种裸鼠40只，2周后肿瘤形成约0．16cm3瘤块，剔除荷有最大和最小瘤块的裸小鼠各3只。

1．3 荷SHG-44胶质瘤裸鼠的治疗 采用完全随机设计方法，将接种成功的34 只荷SHG-44胶质瘤裸鼠随机分成5组：溶媒对照组（A组），雷公藤红素按3种浓度4mg／kg（B组）、2mg／kg（C组）、1 mg／kg（D 组）分组给药，阳性对照顺铂组（E组）按2mg／kg给药。每周2次，共给药4周。所有组共投药4周，以开始投药时的所测肿瘤体积为基准，每隔5 d用游标卡尺测量肿瘤结节的最长径和最短径。肿瘤体积的计算公式V＝长径×短径×短径／2。每周称量荷瘤裸鼠体重以监测药物毒性。28d后断颈处死剔出肿瘤并测量肿瘤的最长径和最短径，病理医生检查每只荷瘤裸鼠肺、肝、肾组织。

1．4 肿瘤抑制率的测定 肿瘤抑制率＝（对照组体积-试验组体积）／对照组体积×100%。

1．5 HE染色及免疫组织化学 肿瘤标本予10%甲醛固定，逐级脱水，常规石蜡包埋，连续4μm 石蜡切片。石蜡切片常规脱蜡水化后，磷酸盐缓冲液（PBS）洗5min×3次，柠檬酸盐缓冲液（0．01 mol／L，pH∶6．0）微波修复，室温冷却后PBS洗5min×3次，10%正常羊血清封闭10min，滴加稀释好的第一抗体（工作浓度为1∶100）60min，PBS洗5min×3次，生物素-SP标记二抗（即用型）孵育10min，PBS洗5 min×3次，DAB显色，显微镜下观察3～10 min，自来水冲洗，苏木素复染，梯度脱水，二甲苯透明。

1．6 微血管密度（microvesseldensity，MVD）计数及免疫组化的染色计数 （1）微血管密度（MVD）计数：参照Weidner微血管计数法［5］。血管内皮细胞胞浆呈棕黄色或棕褐色者为CD34阳性细胞。（2）免疫组化的染色计数：染色阳性表达为境界清楚、突出于背景的棕黄色或棕褐色颗粒。为兼顾染色强度（SI）和阳性细胞百分比（PP），采用免疫反应分数（IRS）表示其表达水平［6］，IRS＝SI×PP。SI分级：0 级为未见阳性细胞即阴性；1 级为弱阳性，染色颗粒散在分布，显色较弱；2级为中度阳性，显色强度适中；3 级为强阳性，细胞呈均一棕黄染色。PP分级：0级为阴性；1级≤10%；2级11%～50%；3级51%～80%；4级＞80%。

1．7 统计学处理 采用SPSS 13 软件作单因素方差分析（ANOVA），计量数据采用均数±标准差（±s）表示，组间两两比较运用LSD-t检验。P＜0．05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2．1 荷SHG-44胶质瘤裸鼠的一般生长情况 各组荷瘤裸鼠生长状况良好，体质量呈增加趋势；移植瘤体积也呈增大趋势，但生长速率不同。未观察到明显的不良反应，如活动迟缓、腹泻、厌食等症状。移植瘤瘤体呈球形或不规则团块状，边界尚清，有活动度，质地韧，可渐浸润皮肤、肌肉，甚至骨骼，部分瘤体皮肤有坏死。见图1。

图1 荷SHG-44胶质瘤裸小鼠

2．2 雷公藤红素对荷SHG-44胶质瘤裸鼠移植瘤的抑制作用 各组荷SHG-44胶质瘤裸鼠的移植瘤测量体积见表1。自异体瘤块移植后荷瘤裸鼠生长15d，各组皮下移植瘤平均体积已增长至0．16cm3，开始给药；给药第1天和第6天，5组移植瘤生长体积差异无统计学意义（F＝0．685，P＝0．608）。自给药第11 天开始，空白对照组和雷公藤红素1 mg／kg组肿瘤生长速率开始加快，各组移植瘤生长体积相比均有显著性差异（F＝5．501，P＝0．002）。雷公藤红素4mg／kg组、雷公藤红素2mg／kg组、雷公藤红素1 mg／kg组、阳性对照顺铂组的体积抑瘤率分别为35%、26．9%、12．8%、41．4%；与空白对照组相比，雷公藤红素4 mg／kg组、阳性对照顺铂组的肿瘤生长体积比差异显著（P＜0．01）；雷公藤红素2mg／kg组与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0．05），并存在剂量依赖性。

表1 荷SHG44胶质瘤裸鼠的移植瘤体积 （±s，cm3）

表1 荷SHG44胶质瘤裸鼠的移植瘤体积 （±s，cm3）

注：与A组（空白对照组）比较，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

组别 n 体积第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天A组 10 0．1677±0．0246 0．2321±0．0547 0．7790±0．1715 1．1999±0．2604 1．7892±0．3676 2．8490±0．3937 B组 6 0．1626±0．0253 0．2014±0．0311 0．3701±0．0747＊＊ 0．6813±0．2454＊＊ 1．0490±0．2425＊＊ 1．8518±0．5492＊＊C组 6 0．1628±0．0252 0．2297±0．0464 0．4958±0．1746＊＊ 0．7957±0．2797＊＊ 1．3750±0．4283＊ 2．0812±0．6170＊D组 6 0．1573±0．0501 0．2486±0．0822 0．6001±0．2836 0．9370±0．2920 1．5416±0．4416 2．4837±0．7376 E组 6 0．1639±0．0284 0．2438±0．0437 0．4845±0．1749＊＊ 0．6733±0．1838＊＊ 0．9806±0．3043＊＊ 1．6683±0．5914＊＊

2．3 雷公藤红素对荷SHG-44胶质瘤裸鼠移植瘤MVD 的影响 见图2。不同剂量的雷公藤红素对荷瘤裸鼠移植瘤的MVD 均有影响。

2．4 雷公藤红素对荷SHG-44胶质瘤裸鼠移植瘤的bFGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表达的IRS 见表2。5 组荷瘤裸鼠移植瘤的VEGFR1的免疫反应分数组间比较（LSD法）发现，雷公藤红素4mg／kg、2mg／kg与1mg／kg组间比较无显著差异；VEGFR2组间比较发现，雷公藤红素4 mg／kg组与雷公藤红素1mg／kg组比较差异显著；bFGF组间比较发现，雷公藤红素4mg／kg组与2mg／kg组、1 mg／kg组比较差异显著。结果提示不同剂量的雷公腾红素对荷瘤裸鼠移植瘤的VEGF蛋白表达没有影响；雷公藤红素不同剂量组均能下调荷瘤裸鼠移植瘤的VEGFR1 蛋白表达，但还不能认为3者之间有差别；雷公藤红素4mg／kg组和雷公藤红素2mg／kg组均能下调荷瘤裸鼠移植瘤的VEGFR2蛋白表达，且存在剂量依赖性。雷公藤红素4mg／kg组和阳性对照顺铂组均能下调bFGF的蛋白表达。

图2 雷公藤红素对荷SHG-44 胶质瘤裸鼠移植瘤MVD 的影响

表2 荷SHG-44胶质瘤裸鼠移植瘤的bFGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的免疫反应分数（IRS） （±s）

表2 荷SHG-44胶质瘤裸鼠移植瘤的bFGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的免疫反应分数（IRS） （±s）

注：与A组（空白对照组）比较，＊P＜0．05，＊＊P ＜0．01

组别 n bFGF VEGF VEGFR1 VEGFR2 A组10 6．00±1．15 3．31±1．27 5．98±1．29 6．13±1．54 B组 6 2．59±0．92＊＊ 2．95±1．15 3．39±1．10＊＊ 3．28±0．86＊＊C组 6 5．08±1．36 3．21±0．45 3．45±0．75＊＊ 4．50±0．94＊D组 6 4．89±1．41 2．58±0．66 4．56±0．91＊ 5．89±2．03 E组 6 4．67±0．79＊ 3．70±1．04 2．83±0．86＊＊5．36±1．14

3 讨论

肿瘤的主要生物学行为特征是无限增殖，其无限增殖的前提是要有新生血管提供营养物质，新生血管是实体肿瘤生长的必备条件［7］。肿瘤血管生成不足可致肿瘤细胞程序性死亡，达到抑制肿瘤生长的目的。MVD 是表示肿瘤血管生成数量的有效指标，胶质瘤的微血管密度及形态结构与其预后及生物学行为密切相关。本研究发现，顺铂组对荷瘤裸鼠移植瘤的微血管密度没有影响，与相关文献报道结果一致。不同剂量的雷公藤红素与对照组比较均能降低荷瘤裸鼠移植瘤的MVD；雷公藤红素4 mg／kg 组、雷公藤红素2 mg／kg组和雷公藤红素1mg／kg组降低MVD 效果有差别，存在剂量依赖性；其中雷公藤红素4mg／kg组抑制效果最明显。可以推断雷公藤红素抑制荷瘤裸鼠移植瘤的生长机制之一是其能降低荷瘤裸鼠移植瘤的微血管密度（MVD）。

Vogelstein和Kinzler研究小组已经证实［8］，肿瘤血管生成和生理状态下的血管生成在基因表达上有明显不同。这一发现为血管生成的基础和临床研究提供了重要资料。肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程，Jain 和Carmeliet提出［9］，肿瘤血管通过出芽、套叠、血管生成拟态等6种可能机制而新生。VEGF和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等均是已知强烈的促血管生成因子。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的生物学作用是通过与其特异性的细胞表面受体-FGFR 结合而介导实现。血管内皮生长因子（VEGF）与内皮细胞上的酪氨酸激酶受体VEGFR 结合，通过Raf-MEKMAP 信号转导途径而发挥其生物学作用［10-11］。Kubota认为应用不同的方法封闭或阻断VEGF／VEGFR 信号转导途径均可抑制肿瘤的血管生成，进而抑制肿瘤的生长［12］。

本文结果提示，雷公藤红素对bFGF、VEGFR1、VEGFR2的蛋白表达有显著下调作用，对VEGF蛋白表达没有影响。雷公藤红素影响荷SHG44胶质瘤裸鼠移植瘤MVD 的可能原因：（1）下调肿瘤组织中VEGFR 蛋白表达，使VEGF的信号转导减弱，明显降低了VEGF生物学效应的发挥，进而抑制内皮细胞的增殖和腔化；由于雷公藤红素抑制荷瘤裸鼠移植瘤的VEGFR-2 蛋白表达存在剂量效应，更能抑制VEGF／VEGFR2所介导的血管内皮细胞分裂活性。（2）下调bFGF的蛋白表达，对抑制肿瘤血管生成有一定作用。因此，雷公藤红素抑制荷SHG44胶质瘤裸鼠移植瘤生长的机制之一是其具有抗血管生成的生物活性。

［1］周幽心，黄煜伦，许期年，等．雷公藤单体体外抑制胶质瘤细胞的实验研究［J］．癌症，2002，21（10）：1 106-1 108．

［2］黄煜伦，周幽心，周 岱，等．雷公藤红素抑制血管生成的实验研究［J］．中华肿瘤杂志，2003，25（5）：429-432．

［3］周幽心，姜华，陈学彬，等．雷公藤红素对荷SHG44胶质瘤裸鼠的抑瘤试验［J］．中国神经肿瘤杂志，2005，3（4）：262-266．

［4］黄煜伦，周幽心，姜华，等．雷公藤红素抑制可移植性人脑胶质瘤生长相关分子［J］．江苏医药，2007，33（1）：37-39．

［5］Weidner N，Semple JP，Welch WR，et al．Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma［J］．N Engl J Med，1991，324：1-8．

［6］Friedrichs K，Gluba S，Eidtmann H，et al．Overexpression of P53and prognosis in breast cancer［J］．Cancer，1993，72：3 641-3 647．

［7］Folkman J．Tumor angiogenesis：therapeutic implications［J］．N Engl J Med，1971，285（21）：1 182-1 186．

［8］Croix BS，Vogelstein BV，Kinzler1 KW，et al．Genes Expressed in Human Tumor Endothelium［J］．Science，2000，289：1 197-1 202．

［9］Jain RK，Carmeliet P．Snapshot：tumor angiogenesis［J］．Cell．2012，149（6）：1 408-1 408．

［10］Carmelite P，Jain RK．Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis［J］．Nature，2011，473（7 347）：298-307．

［11］Ucuzian AA，Gassman AA，East AT，et al．Molecular mediators of angiogenesis［J］．J Burn Care Res，2010，31（1）：158-175．

［12］Kubota Y．Tumor angiogenesis and anti-angiogenic therapy［J］．Keio J Med，2012，61（2）：47-56．