RECK与MT1－MMP 在甲状腺乳头状癌中的表达及意义

唐 甜

（武汉大学人民医院肿瘤Ⅱ科 武汉430060）

甲状腺癌是常见的内分泌肿瘤，女性较男性发病率高。临床发现的甲状腺结节中有5%－10%为甲状腺癌，其发病率为30－40／100万，占人类所有恶性肿瘤的1%－2%。其中甲状腺乳头状癌（Papil－lary thyroid carcinoma，PTC）最多，占60%－80%。近年来，我国甲状腺癌的发病率呈明显上升的趋势［1］。为了使甲状腺癌患者得到正确诊断和及时有效治疗，我们需要进一步研究和探讨甲状腺癌的发病机制。

RECK基因是近年发现的新型基质金属蛋白酶（MMP）抑制剂，研究表明，其可在转录后水平抑制多种MMP的表达，抑制肿瘤血管形成，从而抑制肿瘤的侵袭及转移［2－4］。

应用免疫组织化学方法和图像分析技术检测RECK与MT1－MMP在甲状腺乳头状癌及癌旁组织中的表达水平，以探讨其在甲状腺乳头状癌发生、发展、转移和侵袭过程中的作用机制，为临床上治疗甲状腺乳头状癌提供理论依据。

材料和方法

1.材料

1.1 材料来源

收集武汉大学人民医院病理科2008－2012年手术切除及活检的甲状腺乳头状癌标本40例和癌旁组织20例。其中甲状腺乳头状癌中男12例，女28例；年龄23－68岁。癌旁组织中男6例，女14例；年龄20－60岁。随访时间为8－36个月，平均随访时间20.3个月，中位随访时间18个月。

1.2 材料分组

蜡块切片厚5μm，粘片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上，置于烤箱烤干待用。常规HE染色，用免疫组织化学S－P法检测RECK和MT1－MMP在各组中的表达。

2.主要试剂和仪器

2.1 主要试剂

2.1.1 浓 缩 型 兔 抗 人 MT1－MMP、鼠 抗 人RECK多克隆抗体（北京中杉生物技术有限公司）；

2.1.2 超敏即用型S－P通用型免疫组织化学试剂盒（北京中杉生物技术有限公司）

2.1.3 显色试盒及多聚赖氨酸（北京中杉生物技术有限公司）。

3.方法

3.1 免疫组织化学S－P法检测RECK和 MT1－MMP相关抗原

主要步骤：

5μm组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理10min以抑制内源性过氧化物酶活性，Ezrin蛋白采用微波抗原修复（3档，10min），正常羊血清37℃孵育10min以减少非特异性反应，一抗37℃孵育1h，生物素标记的二抗，37℃孵育10min，SP复合物处理10min，DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用磷酸缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。

3.2 免疫组织化学结果判断

3.2.1 以胞浆和胞核出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。

3.2.2 采用HPIAS－2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对RECK和MT1－MMP的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下RECK和MT1－MMP的阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积／单位面积中细胞的总面积×100%）

4.统计学处理

对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK－q检验，检验水准α为0.05。

结 果

1.RECK的表达

甲状腺乳头状癌组织内可见少量的棕黄色颗粒，RECK表达弱（图1）；癌旁组织中可见密集分布的棕黄色颗粒，RECK表达呈强阳性（图2）。图像分析结果显示：癌旁组织和甲状腺乳头状癌组织之间RECK表达的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义（P＜0.05）（表1）。

表1 甲状腺乳头状癌与癌旁组织中RECK表达的平均光密度和阳性面积率（）Table 1 The average optical density and the rate of positive area ofRECKin thyroid papillary carcinoma and inCarcinoma adjacent tissue（）

表1 甲状腺乳头状癌与癌旁组织中RECK表达的平均光密度和阳性面积率（）Table 1 The average optical density and the rate of positive area ofRECKin thyroid papillary carcinoma and inCarcinoma adjacent tissue（）

▲甲状腺乳头状癌与癌旁组织比较 （P＜0.05）▲Comparison between thyroid papillary carcinomaand Carcinoma adjacent Tissue P＜0.05

ositive area甲状腺乳头状癌thyroid papillary carcinoma 40 0.0851±0.0384▲ 0.0900±0.0385组别Group例数n平均光密度Average opticaldensity阳性面积率Rate ofp▲癌旁组织Carcinoma adjacent tissue 20 0.2758±0.0743 0.2850±0.0745

图1 RECK在甲状腺乳头状癌中的表达可见少量的棕黄色颗粒，RECK表达弱（S－P×200）。图2 RECK在癌旁组织中的表达可见密集分布的棕黄色颗粒，RECK表达呈强阳性（S－P×200）。Fig.1Expression ofRECKinthyroid papillary carcinoma Tere were few brown particles inthecytoplasmof thyroid papillary carcinoma，RECKwas weaklymasculine.S－P×200Fig.2Expression of RECKin Carcinoma adjacent tissueThere were plenty of brown particles in the cytoplasm ofCarcinoma adjacent tissue.RECK was Stronglymasculine.S－P×200

2.MT1－MMP的表达

甲状腺乳头状癌组织内可见密集分布的棕黄色颗粒，MT1－MMP表达强（图3）；癌旁组织中可见少量的棕黄色颗粒，MT1－MMP表达弱（图4）。图像分析结果显示：甲状腺乳头状癌组织和癌旁组织之间MT1－MMP表达的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义（P＜0.05）（表2）。

表2 甲状腺乳头状癌与癌旁组织中MT1－MMP表达的平均光密度和阳性面积率（）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of MT1－MMP in thyroid papillary carcinoma and in Carcinoma adjacent tissue

表2 甲状腺乳头状癌与癌旁组织中MT1－MMP表达的平均光密度和阳性面积率（）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of MT1－MMP in thyroid papillary carcinoma and in Carcinoma adjacent tissue

▲甲状腺乳头状癌与癌旁组织比较 （P＜0.05）▲comparison between thyroid papillary carcinomaand Carcinoma adjacent Tissue P＜0.05

ositive area甲状腺乳头状癌thyroid papillary carcinoma 40 0.2756±0.0698▲ 0.3854±0.0701组别Group例数n平均光密度Average opticaldensity阳性面积率Rate ofp▲癌旁组织Carcinoma adjacent tissue 20 0.0801±0.0357 0.0820±0.0359

图3 MT1－MMP在甲状腺乳头状癌中的表达可见密集分布的棕黄色颗粒，MT1－MMP表达呈强阳性（S－P×200）；图4 MT1－MMP在癌旁组织中的表达可见少量的棕黄色颗粒，MT1－MMP表达弱（S－P×200）；Fig.3Expression ofMT1－MMPin thyroid papillary carcinomaThere were plenty of brown particles in the cytoplasm ofthyroid papillary carcinoma.MT1－MMPwas Stronglymasculine.S－P×200Fig.4Expression ofMT1－MMPinCarcinoma adjacent tissue Tere were few brown particles inthecytoplasmof Carcinoma adjacent tissue，MT1－MMP was weaklymasculine.S－P×200

讨 论

甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常见的甲状腺恶性肿瘤，约占甲状腺癌的60%－70%，发病及生物学行为较为特殊，甲状腺癌（TC）在头颈部肿瘤中居首位。病理组织学改变有时和某些具有显著的假乳头结构的良性乳头状增生性疾病不易鉴别，影响临床诊断和治疗［5，6］。尽管大多数PTC患者表现为无痛性甲状腺肿块，治疗后无病生存期长且治愈率高，但PTC的一些组织学亚型具有胞膜侵犯和远处转移的生物学特性，导致病人死亡。早期诊断和及时正确的治疗是提高生存率的关键。深入认识甲状腺癌的发病机制，将有可能为治疗提供新的线索和途径。

RECK基因就是新发现的一种MMP抑制剂。研究表明，其能在转录后水平抑制至少3种MMP；即 MMP－2，MMP－9 及 MT1－MMP，进而抑制肿瘤的血管形成及转移。具体表现为膜表面锚定的RECK基因抑制 MMP－9前体的分泌，而锚定的RECK蛋白及可溶性RECK蛋白均可抑制MMP－2，MMP－9及 MT1－MMP的活性［7－10］。

本实验研究结果显示：甲状腺乳头状癌中MT1－MMP的表达水平明显高于癌旁组织的表达水平。结果提示 MT1－MMP参与了甲状腺乳头状癌的发生，并通过降解ECM促进了甲状腺乳头状癌的侵袭和转移。并且在肿瘤血管形成过程中，MT1－MMP均发挥着重要作用。对 MT1－MMP的检测可作为研究甲状腺乳头状癌发生发展的临床生物学指标之一。

Kazal基序逆向诱导半胱氨酸丰富蛋白（reversion－inducing－cysteine－rich protein with kazal motifs，RECK）基因是一个重要的肿瘤抑制基因，对多种基质金属蛋白酶（matrix metallo－proteinase，MMPs）的表达和活性的调节起着重要作用［11－13］。RECK蛋白为膜锚定蛋白，而TIMP为可溶性蛋白。因此，RECK蛋白可能只在细胞表面周围起作用，而TIMP则在较长距离外起作用。由于TIMP能与其他类型的膜结合蛋白（如 MT1－MMP）和ECM形成复合物，因此，它们也能参与局部调节。研究已证实，在一些转化细胞中，细胞外水解酶的活性有时是升高的，如MMP家族水解酶。另有研究也表明，活化的癌基因可抑制ECM成分的表达，如胶原蛋白等。RECK基因在正常组织中高表达，而在各种肿瘤来源的细胞系及转染了ras癌基因等的细胞中不表达或低表达，许多癌基因如ras，fos，myc等均可下调RECK基因的表达，这说明RECK基因可能是癌基因共同作用的一个负调节靶位点［14－16］。

实验研究结果显示：RECK基因在癌旁组织中呈高表达，而在甲状腺乳头状癌组织中呈低表达。结果提示：RECK可抑制至少3个 MMP家族成员的活性，包 括：MMP－2，MMP－9 及 MT1－MMP，此 外，RECK基因还与血管生成密切相关，其适量表达能抑制血管的生成。RECK在甲状腺乳头状癌组织中呈低表达说明RECK通过抑制 MT1－MMP的活性，从而影响了proMMP－2的活化。RECK对 MMP－9的抑制作用发生在翻译后水平，即抑制 MMP－9从细胞的释放以及直接抑制其蛋白水解活性最终抑制了MMP－9的总量及活性从而发挥抗肿瘤作用。RECK具有独特的抑制基质金属蛋白酶表达与活性的功能，与许多癌基因信号及细胞外基质重建密切相关。

对于RECK和MT1－MMP之间的相互关系在甲状腺乳头状癌中的研究少有文献报道。RECK主要通过直接抑制 MMP－2、MMP－9 和 MT1－MMP来发挥作用，或通过抑制 MT1－MMP从而抑制proMMP－2和proMMP－9的活化。但 RECK究竟通过何种途径实现对 MT1－MMP功能的抑制尚不明了。RECK可与MT1－MMP形成一个复合物并抑制其活性；RECK还可在葡萄糖梯度离心过程中增加同抗去垢膜（detergent－resistant membranes，DRM）结合的 MT1－MMP的量。另外，对膜胆固醇的干扰可以明显的影响RECK对 MT1－MMP的抑制作用。这些实验结果表明，除了通过抑制酶活性，RECK对MT1－MMP的调节还可通过直接在细胞膜上影响其生物学行为。当RECK表达缺失时，MT1－MMP的内化可以通过笼状蛋白或胞膜穴样内陷途径得已完成；RECK表达时，MT1－MMP的内化则经过了与之不同的途径，这表明RECK调节了MT1－MMP的内化途径。而途径的改变又加速了 MT1－MMP的内化和降解。本实验中，甲状腺乳头状癌组织中 MT1－MMP及RECK的表达水平呈负相关，提示 MT1－MMP及RECK在甲状腺乳头状癌的侵袭和转移中发挥重要作用，并且具有协同作用。联合检测RECK及 MT1－MMP在甲状腺乳头状癌组织中的表达，为临床上预测甲状腺乳头状癌侵袭转移、预后评估及指导合理的综合治疗等提供了重要的理论依据。

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