IGF－1R和MMP－2蛋白在膀胱尿路上皮癌中的异常表达及意义

陕 光

（武汉大学人民医院泌尿Ⅱ科 武汉430060）

膀胱尿路上皮癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第2位。膀胱尿路上皮癌其生物学行为有多中心、易复发、及浸润性生长的特点。膀胱癌的病因复杂，既有内在的遗传因素，又有外在的环境因素。因此进一步研究膀胱癌的发生发展机制，寻找能够有效预测其生物学行为的指标，对其早期诊断、指导治疗和预后具有重要的意义。

胰岛素样生长因子－1受体（Isulin－like growth factor 1recep tor（IGF－1R）是具有促进细胞增殖、分化等多种生物活性的生长因子。研究表明其参与多种恶性肿瘤的发生、发展过程，与癌基因及其他细胞因子相互作用促进肿瘤的发生，而且在基因的靶向治疗中也显示出优越性［1－3］。

基质金属蛋白酶（MMPs）是一类依赖锌离子的具有催化活性的蛋白质，它主要通过水解细胞外周基质成分从而保持组织中内环境稳定，在癌组织中变异的蛋白水解作用导致肿瘤的恶化，组织的重塑，炎症，组织侵袭和转移［4，5］。

采用免疫组化和图像分析方法检测和分析了膀胱尿路上皮癌组织中IGF－1R和MMP－2蛋白的表达以及二者的表达与膀胱尿路上皮癌临床病理因素的关系，有望能为膀胱尿路上皮癌的诊治提供新的靶点。

材料和方法

1.材料

1.1 收集武汉大学人民医院病理科2000－2006年膀胱尿路上皮癌存档蜡块50例（均经病理学证实为膀胱尿路上皮癌），其中男性38例，女性12例，平均年龄50.3岁，另5例癌旁组织距瘤缘3－5cm。标本均经HE染色，光镜观察诊断，按WHO尿路肿瘤组织学分类（2004），浸润性尿路上皮癌30例，非浸润性乳头状尿路上皮癌；高级别15例，低级别5例；按 UICC临床分期，T1 31例，T2 11例，T3－4 8例。其中未经化疗的初发肿瘤28例，化疗后复发肿瘤22例。

1.2 主要试剂

1.2.1 即用型兔抗人IGF－1R多克隆抗体；（北京中杉生物技术有限公司）

1.2.2 即用型兔抗人 MMP－2多克隆抗体；（北京中杉生物技术有限公司）

1.2.3 超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒；（北京中杉生物技术有限公司）

1.2.4 DAB显色试盒及多聚赖氨酸 （北京中杉生物技术有限公司）

2.方法

2.1 HE染色

常规取材、固定、脱水、透明、包埋、切片、HE染色及封片。

2.2 免疫组织化学SP法检测IGF－1R 和MMP－2蛋白相关抗原

具体步骤：4μm组织切片常规脱蜡至水后，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；抗原修复（柠檬酸缓冲液微波抗原修复法），室温自然冷却后，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗5×3min；滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景；甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，0.01mol／LPBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加链霉素抗生物素蛋白－过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间（约3－5min），自来水冲洗终止反应；苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检；用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为IGF－1R和MMP－2的阳性对照组。

2.3 免疫组织化学结果判断

2.3.1 IGF－1R 和 MMP－2以细胞质或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性反应，阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。

2.3.2 采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对IGF－1R和MMP－2的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积／单位面积中细胞的总面积×100%）

3.统计学处理

统计学处理 对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和q检验，检验水准α为0.05。IGF－1R和 MMP－2蛋白在不同分组中的表达情况及二者在膀胱尿路上皮癌各临床病理因素之间表达差异采用χ2检验和Fisher确切概率法。

结 果

1.IGF－1R的表达

膀胱尿路上皮癌胞膜或胞质中可见较多棕黄色颗粒，IGF－1R呈阳性表达（图1）；癌旁组织胞膜或胞质中可见少量的棕黄色颗粒，IGF－1R表达弱，呈阴性表达（图2）。图像分析结果见表1。经q检验，膀胱尿路上皮癌与癌旁组织之间，IGF－1R的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.05）（表1）。

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁组织IGF－1R表达的平均光密度和阳性面积率（）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of IGF－1Rin Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue（）

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁组织IGF－1R表达的平均光密度和阳性面积率（）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of IGF－1Rin Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue（）

＊ 膀胱尿路上皮癌与癌旁组织比较（comparison between Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue）P＜0.05

ositive area膀胱尿路上皮癌Bladder Urothelial Cancer 50 0.3681±0.0075＊组别Group例数n平均光密度Average optical density阳性面积率Rate of p 0.3783±0.0076癌旁组织Cancer side tissue 5 0.0682±0.0032 0.0702±0.0033

2.MMP－2蛋白的表达

膀胱尿路上皮癌胞膜或胞质中可见密集分布的棕黄色颗粒，MMP－2蛋白表达强（图3）；癌旁组织胞膜或胞质中可见少量或无棕黄色颗粒，MMP－2蛋白呈弱阳性或阴性表达，（图4）。图像分析结果见表2。经q检验，膀胱尿路上皮癌与癌旁组织之间，MMP－2蛋白的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.05）（表2）。

表2 膀胱尿路上皮癌和癌旁组织MMP－2表达的平均光密度和阳性面积率（）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of MMP－2 in Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue（）

表2 膀胱尿路上皮癌和癌旁组织MMP－2表达的平均光密度和阳性面积率（）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of MMP－2 in Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue（）

＊ 膀胱尿路上皮癌与癌旁组织比较（comparison between Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue）P＜0.05

ositive area膀胱尿路上皮癌Bladder Urothelial Cancer组别Group例数n平均光密度Average optical density阳性面积率Rate of p 50 0.3012±0.0059 0.3112±0.0063癌旁组织Cancer side tissue 5 0.0801±0.0034 0.0789±0.0033

3.IGF－1R和MMP－2的表达与膀胱癌临床分 期的关系，结果见表3。

表3 IGF－1R、MMP－2的表达与膀胱尿路上皮癌临床分期的关系Table 3 The expression of IGF－1Rand MMP－2with the correlation of TNM stag of Bladder Urothelial Cancer

4.IGF－1R和MMP－2的表达与膀胱尿路上皮 癌淋巴结转移的关系，结果见表4。

表4 IGF－1R和MMP－2的表达与膀胱尿路上皮癌淋巴结转移的关系Table 4 The expression of IGF－1Rand MMP－2with the correlation of LymPh nodemetastasi of Bladder Urothelial Cancer

5.IGF－1R 和 MMP－2的表达与肿瘤大小关 系，结果见表5。

表5 IGF－1R和MMP－2的表达与肿瘤大小关系Table 5 The expression of IGF－1Rand MMP－2with the correlation of tumor size and Pathologic type of Bladder Urothelial Cancer

表6 IGF－1R、MMP－2的表达与性别、年龄、病理类型等的关系Table 6 The expression of IGF－1and RMMP－2with the correlation of sex、age and Pathologic type of Bladder Urothelial Cancer

6.IGF－1R、MMP－2的表达与性别、年龄、病理 类型等的关系，结果见表6。

讨 论

膀胱癌是我国泌尿外科肿瘤中的发病率和死亡率均占首位，近年来发病率呈上升趋势。约2／3的膀胱癌为浅表性、易复发，复发后70%－80%不发生肌层浸润和远处转移，预后较好，而20%－30%将进展为浸润性肿瘤；另1／3的膀胱癌较早发生肌层浸润和远处转移，预后差。早期诊断膀胱癌并根据其生物学特点采取及时合理的治疗方法，一直是泌尿外科学者研究的重要课题。近年来，人们认识到细胞凋亡在肿瘤发生、发展中的重要作用。

胰岛素样生长因子－1受体（insulin like growth factor 1recep tor，IGF－1R）系IGFs家族成员，为一种跨膜的酪氨酸蛋白受体，在神经系统恶性肿瘤、肝细胞癌、乳腺癌、肾上腺皮质肿瘤及肺癌中均有高表达，且通过与其配体结合对细胞的增殖、分化和凋亡等产生重要影响［6－9］。现已在多种肿瘤中检测到IGF－1R的表达。研究表明IGF－1R在多种肿瘤中的表达上调，并通过促进细胞增埴，抑制细胞凋亡，与其他生长因子如血管内皮生长因子（VEGF－C）的信号通路相互作用实现促瘤作用，与诱导和保持肿瘤细胞的表型及浸润转移密切相关。胰岛素样生长因子系统（IGFS）是一类与胰岛素高度同源的多肽生长因子，近年来的研究已证实IGFS在脑癌、前列腺癌等的癌细胞中过度表达。IGFS的大多数生物学活性主要由IGF－1R来介导，IGF－1及其受体与肿瘤的发生、发展及预后关系紧密［10－14］。IGF－1可通过多种形式被调节。IGF－2 可以调节肿瘤细胞的生长，肿瘤细胞通过以自分泌和旁分泌的形式分泌IGF－2，IGF－2可以激活1型受体，调节对组织的增殖和分化作用。

MMP－2是基质金属蛋白酶的主要家庭成员，可以降解细胞外基质，参与多种生理和病理过程，在细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的作用下，参与了肿瘤的侵袭、转移和血管生成等环节。MMP－2主要通过降解Ⅳ型胶原纤维而起作用，而Ⅳ型胶原纤维则是细胞膜及细胞外基质（ECM）的主要组成成分。除此之外还可以降解纤维连接蛋白、层粘连蛋白、蛋白多糖连接蛋白、多功能蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖、弹力蛋白及骨结核素等非胶原细胞外基质。许多肿瘤细胞不仅可以自身表达 MMP－2还能诱导临近的成纤维细胞产生 MMP－2［15－17］。

本研究发现：IGF－1R和 MMP－2在膀胱尿路上皮癌中呈高表达，提示IGF－1R和 MMP－2可能与膀胱尿路上皮癌的发生发展过程密切相关；IGF－1R和 MMP－2在膀胱尿路上皮癌中的表达水平与膀胱尿路上皮癌的病理分级有关，表明膀胱尿路上皮癌恶性程度越高IGF－1R和MMP－2的表达水平越高；IGF－1R和 MMP－2在膀胱尿路上皮癌中的表达水平与膀胱尿路上皮癌的临床分期有关，表明膀胱尿路上皮癌分期越晚IGF－1R和 MMP－2表达水平越高。膀胱尿路上皮癌IGF－1R和 MMP－2与膀胱尿路上皮癌的发生、发展和转移过程密切相关，膀胱尿路上皮癌组织中IGF－1R的高表达和 MMP－2的高表达二者协同作用可能促进肿瘤的演进。同时我们还发现IGF－1R和MMP－2在不同肿瘤体积大小、淋巴结是否转移，不同病理分级和临床分期中的表达，都与上述变化相关，但与患者的性别、年龄及肿瘤的病理分型无关。由此可见，IGF－1R和 MMP－2与膀胱尿路上皮癌的发生、发展和转移过程密切相关，同时检测这两种蛋白的表达可以对膀胱尿路上皮癌恶性程度的判定及进一步治疗提供理论依据。

由此可见，IGF－IR和MMP－2的高表达可以促进正常细胞恶性转化，对膀胱尿路上皮癌细胞可以降解细胞外基质，促进细胞的增殖、浸润和转移。

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图 版 说 明

图1 IGF－1R的表达 膀胱尿路上皮癌胞膜内可见较多棕黄色颗粒（→），IGF－1R表达强（S－P×200）。

图2 IGF－1R的表达 癌旁组织胞质内可见少量的棕黄色颗粒（→），IGF－1R表达弱（S－P×200）。

图3 MMP－2蛋白的表达膀胱尿路上皮癌胞核和胞浆内可见较多棕黄色颗粒，MMP－2蛋白表达强（S－P×200）。

图4 MMP－2的表达 癌旁组织胞核和胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，MMP－2表达弱（S－P×200）。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1IGF－1Rexpression in Bladder Urothelial Cancer There were plenty of brown particles in the cell membrane，which showed IGF－1Rexpressed strongly.S－P×200

Fig.2IGF－1Rexpression in cancer side tissue.There were few brown particles in the cell membrane，which showed IGF－1Rexpressed weakly.S－P×200

Fig.3MMP－2expression in Bladder Urothelial Cancer .There were plenty of brown particles in the nuclear or cytoplasmic，which showed MMP－2expressed strongly.S－P×200

Fig.4MMP－2expression in cancer side tissue.There were few brown particles in the nuclear or cytoplasmic，which showed MMP－2expressed weakly.S－P×200