尾加压素Ⅱ对皮肤成纤维细胞表达Ⅰ型胶原蛋白的影响

罗丽敏 李军 刘菡 刘劲松 董晓 党书毅

尾加压素Ⅱ对皮肤成纤维细胞表达Ⅰ型胶原蛋白的影响

罗丽敏 李军 刘菡 刘劲松 董晓 党书毅

目的探讨血管活性物质尾加压素Ⅱ对人皮肤成纤维细胞表达Ⅰ型胶原蛋白及其迁移的影响和细胞内信号转导机制。方法在离体培养的人皮肤成纤维细胞上,用酶联免疫吸附试验和Transwell迁移试验,观察尾加压素Ⅱ对细胞的促分泌和迁移作用。加入不同的细胞内信号转导阻断剂,观察其对尾加压素Ⅱ效应的影响。结果尾加压素Ⅱ以浓度和时间依赖方式促进成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白。尾加压素Ⅱ浓度为10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L的实验组Ⅰ型胶原蛋白分泌量分别比对照组依次增加21.2%(P＞0.05)、52.2%(P＜0.05)、84.4%(P＜0.05)、83.6%(P＜0.05)和77.1%(P＜0.05)。从4 h开始,Ⅰ型胶原蛋白浓度明显增加,其分泌量较对照组增加23.2%(P＞0.05)、12 h时增加69.5%(P＜0.05)和24 h时增加84.1%(P＜0.05)。与对照组相比,10-8mol/L尾加压素Ⅱ组可明显促进细胞迁移(P＜0.05)。尾加压素Ⅱ的效应能被丝裂原活化的蛋白激酶阻断剂PD98059、钙通道阻断剂尼卡地平和钙调素激酶阻断剂环孢素A所阻断,其中对尾加压素Ⅱ促成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白的抑制率依次为18.2%、15.9%、19.7%,对迁移的抑制率为38.3%(P＜0.05)、20.7%(P＜0.05)和81.4%(P＜0.05)。结论尾加压素Ⅱ可促进人皮肤成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白的分泌和成纤维细胞的迁移,其促进效应可能通过Ca2+、钙调素激酶以及丝裂原活化的蛋白激酶通路来介导。

血管活性肠肽;尾加压素Ⅱ;细胞运动;成纤维细胞;胶原Ⅰ型

人皮肤成纤维细胞(fibroblast,Fb)是皮肤的重要组成部分,它在多种血管活性物质作用下,通过分泌活性因子,参与细胞表型转化、增殖、凋亡、迁移及胶原的合成和分泌,在伤口创面愈合、瘢痕组织形成以及皮肤硬化等［1］生理病理过程中起作用［2-4］。有研究表明,Fb表型异常与系统性硬皮病、瘢痕性疾病具有相关性［1］,Fb已成为治疗皮肤功能异常的新靶点［5］。 尾加压素Ⅱ(urotensinⅡ，UⅡ)是一种新的血管活性肽,在全身各个部位均有分布,其生物学效应广泛,已有研究证实,UⅡ具有促进成纤维细胞增殖及表型转化的作用［6］。本研究用酶联免疫吸附试验(ELISA)和细胞迁移试验等技术手段,观察UⅡ对Fb分泌Ⅰ型胶原蛋白及细胞迁移的影响,初步探讨相应的细胞内信号转导机制。

材料与方法

一、材料

1.主要试剂:高糖DMEM培养基为美国Gibco公司产品,胎牛血清为杭州四季青公司产品,L-谷胺酰胺为美国Hyclone公司产品,Ⅰ型胶原酶为美国Invitrogen公司产品,胰蛋白酶为美国Sigma公司产品,鼠抗人波形蛋白抗体、SP试剂盒及DAB显色试剂盒为北京中杉公司产品,RatUⅡ为美国Phoenix Phann Inc产品,Transwell小室为美国康宁公司产品,环孢素、尼卡地平和PD98059为德国Biochemical公司产品,余为市售分析纯试剂。

2.皮肤标本:湖北医药学院附属东风总医院泌尿外科提供4～5岁儿童包皮环切术后遗弃的包皮组织。

二、方法

(一)实验方法:

1.成纤维细胞的原代培养:参考文献［7］,简述如下:取包皮,分离表皮与真皮,将真皮片剪成1 mm ×1 mm×1 mm,移入离心管中,加入0.2%Ⅰ型胶原酶溶液吹打均匀,37℃、5%CO2孵箱消化4 h,经200目不锈钢滤网过滤消化液;收集消化液,200×g离心5 min,弃上清,用含10%胎牛血清的DMEM培养液重新悬浮细胞混匀,接种于培养瓶,在37℃、5%CO2孵箱中培养,待细胞贴壁生长到80%融合,用0.25%胰酶消化传代。取2～4代细胞进一步实验。

2.细胞迁移试验:将培养细胞用1.25 g/L胰酶消化,制成细胞悬液,血细胞计数器计数,调整细胞浓度。在Transwell小室下室加入含不同浓度UⅡ或含相同浓度UⅡ加不同浓度阻断剂的DMEM 500 μl,上室接种105Fb悬液,37℃、5%CO2培养箱内孵育6 h后取出上室,以棉签轻拭去上室滤膜内面Fb,对迁移至滤膜外面的Fb用95%冰乙醇固定后,HE染色,随机取10个视野(×200)对迁移细胞计数,取均值作为1次实验数据。重复3次,取平均值。

3.ELISA:收集经不同浓度UⅡ和信号转导阻断剂处理后的Fb培养液,用ELISA法检测培养液中Ⅰ型胶原的含量。首先将待测培养液加入96孔板过夜,然后加鼠抗人Ⅰ型胶原抗体(工作浓度1∶500)37℃2 h,洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(工作浓度1∶1 000)37℃1 h,加入DAB显色。用酶标仪读取450 nm的吸光度值(A值)。

(二)设计和分组:不同浓度UⅡ对Fb分泌Ⅰ型胶原蛋白的影响分为6组:1组为对照组,不加UⅡ;2 ～ 6 组分别为 10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L UⅡ组。不同时间10-8mol/LUⅡ对Fb分泌Ⅰ型胶原蛋白的影响分为4组,分别在0、4、12、24 h这4个时间点收集培养液。不同信号途径阻断剂对10-8mol/L UⅡ对Fb分泌Ⅰ型胶原蛋白效应的影响分为5组:①对照组:不加任何处理因素;②UⅡ组:只加UⅡ;③UⅡ +10-5mol/L PD98059组;④UⅡ +10-5mol/L尼卡地平组;⑤UⅡ+10-5mol/L环孢素组。

参考上述实验,选择10-8mol/L UⅡ、培养24 h时间点,观察不同信号途径阻断剂对UⅡ促细胞迁移作用效应的影响,分为5组,分组处理同上。

(三)统计分析:用GraphPad Prism软件进行数据分析,计量资料用±s表示,两组之间均数的比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不同浓度UⅡ对Fb分泌Ⅰ型胶原蛋白的影响

不同浓度UⅡ刺激Fb 24 h后,收集细胞培养液,使用ELISA测定培养液中Ⅰ型胶原蛋白的含量。结果提示,随着UⅡ浓度的增加,Fb分泌的Ⅰ型胶原蛋白亦增加。10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L UⅡ组Ⅰ型胶原蛋白分泌量分别较对照组增加21.2%、52.2%、84.4%、83.6%和77.1%。 见图1。

二 UⅡ作用不同时间对Fb分泌Ⅰ型胶原蛋白的影响

见图2。使用10-8mol/L UⅡ刺激FB 4～24 h,收集细胞培养液,ELISA法测定培养液中Ⅰ型胶原蛋白的含量。结果显示,从4 h开始,Ⅰ型胶原蛋白浓度明显增加,4、12、24 h后其分泌量分别较对照组增加23.2%、69.5%和84.1%。

三、不同信号通路阻断剂对UⅡ刺激Fb分泌Ⅰ型胶原蛋白的影响

图1 不同浓度尾加压素Ⅱ对人皮肤成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白的影响 1组为对照组,不加UⅡ;2～6组分别为10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L UⅡ组;a:与对照组相比,P ＜ 0.05(n=5)

图2 尾加压素Ⅱ作用不同时间对人皮肤成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白的影响;a:与对照组相比,P＜0.05(n=5)

图3 不同信号通路阻断剂对UⅡ促人皮肤成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白的影响 1组:对照组;2组:UⅡ组;3组:UⅡ+10-5 mol/L PD98059组;4组:10-5mol/L尼卡地平组;5组:UⅡ+10-5 mol/L环孢素组;a:与对照组相比,P＜0.05;b:与UⅡ组相比,P＜0.05(n=5)

见图3。用不同信号通路阻断剂PD98059(10-5mol/L),尼卡地平(10-5mol/L),环孢素(10-5mol/L)预处理Fb 30 min后,再使用10-8mol/L UⅡ刺激Fb 24 h,收集细胞培养液,ELISA法测定培养液中Ⅰ型胶原蛋白的含量。结果发现,UⅡ刺激Fb分泌Ⅰ型胶原蛋白的作用能够被PD98059、尼卡地平和环孢素所抑制,其抑制率依次为18.2%、15.9%和19.7%。

四、不同信号通路阻断剂对UⅡ刺激Fb迁移的影响

UⅡ刺激Fb迁移的作用能够被PD98059、环孢素和尼卡地平所抑制,其抑制率依次为38.3%、81.4%和20.7%。见图4。

讨 论

Fb是皮肤真皮结缔组织中的主要细胞,可分泌胶原蛋白、弹性蛋白,从而形成胶原纤维和弹性纤维;也可分泌葡聚糖、纤连蛋白、糖蛋白及透明质酸等细胞外基质成分。在皮肤损伤后的愈合过程中,Fb起着主要作用。

UⅡ是一种新的血管活性肽［8］,从软体动物到人均有分布,1998年被首次发现在人体表达,在全身各个部位均有分布。研究表明,它是一种既能够促进细胞增殖,又能够促进细胞表型转化的活性因子。UⅡ能够以浓度依赖性方式促进血管外膜成纤维细胞表达α平滑肌肌动蛋白,向肌成纤维细胞表形转化,并促进成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原及细胞迁移［8］。这些作用可以通过促有丝分裂蛋白激酶MAPK、钙调神经磷酸酶、Rho以及蛋白激酶C、钙通道等途径来实现［6，9-10］。从肽类生长因子调控皮肤各种病理生理作用的角度而言,UⅡ可能有助于揭示Fb在皮肤损伤愈合过程中的作用机制。

图4 不同信号通路阻断剂对UⅡ促人皮肤成纤维细胞迁移的影响 1组:对照组;2组:UⅡ组;3组:UⅡ+10-5mol/L PD98059组;4组:UⅡ+10-5mol/L环孢素组;5组:10-5mol/L尼卡地平组;a:与对照组相比,P＜0.05;b:与UⅡ组相比,P＜0.05(n=10)

本研究在体外培养的皮肤成纤维细胞中,发现UⅡ以时间和浓度依赖性的方式促进Fb产生和分泌Ⅰ型胶原蛋白,此作用能被钙通道阻断剂尼卡地平、钙调素激酶阻断剂环孢素和丝裂原活化蛋白激酶阻断剂PD98059所阻断,提示UⅡ能够促进皮肤Fb直接合成和分泌Ⅰ型胶原蛋白,该作用可能通过Ca2+、钙调素激酶以及丝裂原活化蛋白激酶等多条途径来实现。同时发现,在UⅡ浓度为10-8mol/L,时间为24 h这个时间点上,UⅡ能促进Fb迁移,且在不同程度被上述通道阻断剂抑制,说明Fb的迁移作用能被UⅡ介导,Ca2+、钙调素激酶及MAPK等通路参与其中。Fb活性增加,发生表型转化,分泌胶原蛋白增多和迁移是皮肤损伤后愈合的重要环节,在伤口创面愈合、瘢痕组织形成和系统性硬皮病［1］等疾病的发生发展过程中具有十分重要的意义,因此UⅡ对Fb的这种促分泌和促趋化效应值得深入研究。

本试验所展示的UⅡ可以诱导Fb迁移和胶原分泌,并且与Ca2+、钙调素激酶及MAPK等通路相关,提示UⅡ是一种新的Fb活性刺激剂,它可通过自分泌和旁分泌方式来实现与其他生物活性因子之间的调节过程。

［1］Pehlivan Y，Onat AM，Comez G，et al.Urotensin-II in systemic sclerosis:a new peptide in pathogenesis ［J］.Clin Rheumatol，2011，30(6):837-842.

［2］Wong VW，Longaker MT，Gurtner GC.Soft tissue mechanotransduction in wound healing and fibrosis［J］.Semin Cell Dev Biol，2012，23(9):981-986.

［3］Koskela A，Engström K，Hakelius M，et al.Regulation of fibroblast gene expression by keratinocytes in organotypic skin culture provides possible mechanisms for the antifibrotic effectof reepithelialization［J］.Wound Repair Regen，2010，18(5):452-459.

［4］Coolen NA，Vlig M，van den Bogaerdt AJ，et al.Development of an in vitro burn wound model［J］.Wound Repair Regen，2008，16(4):559-567.

［5］辛崇美，李明.低氧对系统性硬化病患者皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成的影响［J］.中华皮肤科杂志，2007，40(6):343-346.

［6］Zhang YG，Li J，Li YG，et al.Urotensin II induces phenotypic differentiation，migration，and collagen synthesis of adventitial fibroblasts from rat aorta［J］.J Hypertens，2008，26(6):1119-1126.

［7］戴振声，徐燕丽，谢毅.HSF原代培养方法的改良［J］.东南大学学报(医学版)，2004，(4):236-238.

［8］Ames RS，Sarau HM，Chambers JK，et al.Human urotensin-II is a potent vasoconstrictor and agonist for the orphan receptor GPR14［J］.Nature，1999，401(6750):282-286.

［9］Zhang YG，Kuang ZJ，Mao YY，et al.Osteopontin is involved in urotensin II-induced migration of rat aortic adventitial fibroblasts［J］.Peptides，2011，32(12):2452-2458.

［10］Zhang YG，Hu YC，Mao YY，et al.Transforming growth factorβ1 involved in urotensin II-induced phenotypic differentiation of adventitial fibroblasts from rat aorta ［J］.Chin Med J(Engl)，2010，123(24):3634-3639.

Effects of urotensin Ⅱ on the expression of typeⅠ collagen in human skin fibroblasts

Luo Limin*，Li Jun，Liu Han，Liu Jinsong，Dong Xiao，Dang Shuyi.*Department of Dermatology，Dongfeng General Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，Hubei，China

Li Jun，Email:stulijun@sina.com

Objective To evaluate the effect of a vasoactive substance urotensin Ⅱ on the expression of typeⅠ collagen and migration of human skin fibroblasts，and to explore the underlying mechanisms of signal transduction.Methods Fibroblasts were isolated from human foreskin tissues and subjected to primary culture.After a series of subculture，fibroblasts were classified into several groups to be treated with different concentrations(10-10to 10-6mol/L)of urotensin Ⅱ for 24 hours，urotensin Ⅱ of 10-8mol/L for different durations(0，4，12，24 hours)，or pretreated with PD98059(a mitogen-activated protein kinase kinase inhibitor)，nicardipine(a calcium channel blocker)and ciclosporin(a calcineurin inhibitor)of 10-5mol/L respectively for 30 minutes followed by treatment with urotensinⅡ of 10-8mol/L for 24 hours.The cells receiving no treatment served as the control.Subsequently，enzyme-linked immunosorbent assay was performed to determine the level of urotensin Ⅱ in the supernatant of fibroblasts，and Transwell assay to estimate the migration activity of fibroblasts.Statistical analysis was carried out byttest and analysis of variance.Results UrotensinⅡ promoted the expression of typeⅠ collagen in a time-and concentrationdependent manner.The level of typeⅠ collagen was increased by 21.2%(P＞0.05)，52.2%(P＜0.05)，84.4%(P＜0.05)，83.6%(P＜ 0.05)and 77.1%(P＜ 0.05)in the supernatant of fibroblasts treated with 10-10，10-9，10-8，10-7and 10-6mol/L of urotensinⅡ for 24 hours respectively，by 23.2%(P＞0.05)，69.5%(P＜0.05)and 84.1%(P＜0.05)in the supernatant of fibroblasts treated with urotensin Ⅱ of 10-8mol/L for 4，12 and 24 hours respectively，compared with the untreated control fibroblasts.The migration activity was markedly enhanced in fibroblasts treated with urotensinⅡ of 10-8mol/L for 24 hours compared with the control fibroblasts(P＜0.05).PD98059，nicardipine and cyclosporin A inhibited the secretion of typeⅠ collagen by 18.2%，15.9%and 19.7%respectively，and suppressed the migration of fibroblasts by 38.3%(P＜0.05)，20.7%(P＜0.05)and 81.4%(P＜0.05)respectively in the groups receiving pretreatment compared with those treated with urotensinⅡalone.Conclusions UrotensinⅡ can promote the secretion of typeⅠ collagen by and migration of fibroblasts，which may be realized through the Ca2+，calmodulin kinase，and mitogen-activated protein kinase pathways.

Vasoactive intestinal peptide；Urotensin Ⅱ；Cell movement；Fibroblasts；Collagen typeⅠ

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.010

湖北省自然科学基金(2011CDC049);湖北省教育厅科研项目(B20102104);十堰市科技局科研基金(2010st39)

442000武汉,湖北医药学院附属东风总医院皮肤科(罗丽敏、刘菡、刘劲松);湖北医药学院附属太和医院心内科(李军、董晓、党书毅)

李军,Email:stulijun@sina.com

2013-11-18)

(本文编辑:吴晓初)